El efecto fotoacústico o efecto optoacústico es la formación de ondas sonoras tras la absorción de luz en una muestra de material. Para obtener este efecto la intensidad de la luz debe variar, ya sea periódicamente ( luz modulada ) o como un único destello ( luz pulsada ). [1] [ página necesaria ] [2] El efecto fotoacústico se cuantifica midiendo el sonido formado (cambios de presión) con detectores apropiados, como micrófonos o sensores piezoeléctricos . La variación temporal de la salida eléctrica (corriente o voltaje) de estos detectores es la señal fotoacústica. Estas mediciones son útiles para determinar ciertas propiedades de la muestra estudiada. Por ejemplo, en espectroscopia fotoacústica , la señal fotoacústica se utiliza para obtener la absorción real de luz en objetos opacos o transparentes. Es útil para sustancias en concentraciones extremadamente bajas, porque se pueden utilizar pulsos de luz muy fuertes de un láser para aumentar la sensibilidad y se pueden utilizar longitudes de onda muy estrechas para la especificidad. Además, las mediciones fotoacústicas sirven como una valiosa herramienta de investigación en el estudio del calor evolucionado en las reacciones fotoquímicas (ver: fotoquímica ), particularmente en el estudio de la fotosíntesis .
En términos generales, la radiación electromagnética de cualquier tipo puede generar un efecto fotoacústico. Esto incluye toda la gama de frecuencias electromagnéticas, desde la radiación gamma y los rayos X hasta las microondas y la radio . Aun así, gran parte de las investigaciones y aplicaciones que se han publicado y que utilizan el efecto fotoacústico se centran en las regiones espectrales del ultravioleta cercano / visible e infrarrojo .
El descubrimiento del efecto fotoacústico se remonta a 1880, cuando Alexander Graham Bell estaba experimentando con la transmisión de sonido a larga distancia. A través de su invento, llamado " fotófono ", transmitió señales vocales reflejando la luz solar desde un espejo móvil a un receptor de células solares de selenio . [3] Como subproducto de esta investigación, observó que las ondas sonoras se producían directamente a partir de una muestra sólida cuando se exponía a un haz de luz solar que se interrumpía rápidamente con una rueda ranurada giratoria. [4] Notó que la señal acústica resultante dependía del tipo de material y razonó correctamente que el efecto era causado por la energía luminosa absorbida , que posteriormente calienta la muestra. Más tarde, Bell demostró que los materiales expuestos a las porciones no visibles (ultravioleta e infrarrojo) del espectro solar también pueden producir sonidos e inventó un dispositivo, al que llamó "espectrófono", para aplicar este efecto a la identificación espectral de materiales. [5] El propio Bell y más tarde John Tyndall y Wilhelm Röntgen ampliaron estos experimentos, demostrando el mismo efecto en líquidos y gases. [6] [7] Sin embargo, los resultados eran demasiado rudimentarios, dependían de la detección del oído, y esta técnica fue abandonada pronto. La aplicación del efecto fotoacústico tuvo que esperar hasta el desarrollo de sensores sensibles y fuentes de luz intensa. En 1938 Mark Leonidovitch Veingerov reavivó el interés en el efecto fotoacústico, siendo capaz de usarlo para medir concentraciones muy pequeñas de dióxido de carbono en gas nitrógeno (tan bajas como 0,2% en volumen). [8] Desde entonces, la investigación y las aplicaciones crecieron más rápido y más ampliamente, adquiriendo varias veces más sensibilidad de detección.
Aunque se consideró que el efecto de calentamiento de la radiación absorbida era la causa principal del efecto fotoacústico, en 1978 se demostró que la evolución de gas resultante de una reacción fotoquímica también puede causar un efecto fotoacústico. [9] Independientemente, considerando el comportamiento anómalo aparente de la señal fotoacústica de una hoja de planta, que no podía explicarse únicamente por el efecto de calentamiento de la luz excitante, condujo al conocimiento de que la evolución del oxígeno fotosintético normalmente es un contribuyente importante a la señal fotoacústica en este caso. [10]
Aunque gran parte de la literatura sobre el tema se centra en un solo mecanismo, en realidad existen varios mecanismos diferentes que producen el efecto fotoacústico. El principal mecanismo universal es el fototérmico , basado en el efecto de calentamiento de la luz y la consiguiente expansión del material que absorbe la luz. En detalle, el mecanismo fototérmico consta de las siguientes etapas:
La imagen física principal, en este caso, imagina las pulsaciones de temperatura originales como orígenes de las ondas de temperatura que se propagan ("ondas térmicas"), [11] que viajan en la fase condensada, llegando finalmente a la fase gaseosa circundante. Las pulsaciones de temperatura resultantes en la fase gaseosa son la causa principal de los cambios de presión allí. La amplitud de la onda térmica que viaja disminuye fuertemente (exponencialmente) a lo largo de su dirección de propagación, pero si su distancia de propagación en la fase condensada no es demasiado larga, su amplitud cerca de la fase gaseosa es suficiente para crear cambios de presión detectables. [1] [ página necesaria ] [2] [12] Esta propiedad de la onda térmica confiere características únicas a la detección de la absorción de luz por el método fotoacústico. Los cambios de temperatura y presión involucrados son minúsculos, comparados con la escala cotidiana: el orden típico de magnitud para los cambios de temperatura, utilizando intensidades de luz ordinarias, es de aproximadamente micro a miligrados y para los cambios de presión resultantes es de aproximadamente nano a microbares.
El mecanismo fototérmico se manifiesta, además del efecto fotoacústico, también por otros cambios físicos, en particular la emisión de radiación infrarroja y los cambios en el índice de refracción . En consecuencia, puede detectarse por otros medios diversos, descritos con términos como "radiometría fototérmica", [13] "lente térmica" [14] y "deflexión térmica del haz" (popularmente también conocida como efecto " espejismo ", véase espectroscopia fototérmica ). Estos métodos son paralelos a la detección fotoacústica. Sin embargo, cada método tiene su rango de aplicación especial.
Si bien el mecanismo fototérmico es universal, podrían existir otros mecanismos adicionales, superpuestos al mecanismo fototérmico, que pueden contribuir significativamente a la señal fotoacústica. Estos mecanismos están generalmente relacionados con procesos fotofísicos y reacciones fotoquímicas posteriores a la absorción de luz: (1) cambio en el balance de materiales de la muestra o la fase gaseosa alrededor de la muestra; [9] (2) cambio en la organización molecular, que resulta en cambios en el volumen molecular. [15] [16] Los ejemplos más destacados de estos dos tipos de mecanismos se encuentran en la fotosíntesis. [10] [15] [17] [18] [19] [20]
El primer mecanismo mencionado anteriormente es más evidente en una hoja de planta fotosintética . Allí, la evolución de oxígeno inducida por la luz provoca cambios de presión en la fase de aire, lo que da como resultado una señal fotoacústica, que es comparable en magnitud a la causada por el mecanismo fototérmico. [10] [18] Este mecanismo se denominó provisionalmente "fotobárico". El segundo mecanismo aparece en complejos de subcélulas fotosintéticamente activas en suspensión (por ejemplo, centros de reacción fotosintéticos ). Allí, el campo eléctrico que se forma en el centro de reacción, después del proceso de transferencia de electrones inducido por la luz, provoca un efecto de microelectrostricción con un cambio en el volumen molecular. Esto, a su vez, induce una onda de presión que se propaga en el medio macroscópico. [15] [20] Otro caso de este mecanismo es la bomba de protones de la bacteriorrodopsina . Aquí, el cambio inducido por la luz en el volumen molecular es causado por cambios conformacionales que ocurren en esta proteína después de la absorción de luz. [15] [21]
En la aplicación del efecto fotoacústico existen varios modos de medición. Las muestras gaseosas o las muestras de fase condensada, donde la presión se mide en la fase gaseosa circundante, generalmente se prueban con un micrófono. La escala de tiempo aplicable útil en este caso es la escala de milisegundos a subsegundos. En este caso, la luz de excitación se corta o modula continuamente a una cierta frecuencia (generalmente en el rango entre aprox. 10–10000 Hz) y la señal fotoacústica modulada se analiza con un amplificador de bloqueo para su amplitud y fase, o para los componentes en fase y en cuadratura. Cuando la presión se mide dentro de la fase condensada de la muestra probada, se utilizan sensores piezoeléctricos insertados o acoplados a la muestra misma. En este caso, la escala de tiempo oscila entre menos de nanosegundos y muchos microsegundos [1] [ página necesaria ] [2] [22] [23] La señal fotoacústica, obtenida de los diversos sensores de presión, depende de las propiedades físicas del sistema, el mecanismo que crea la señal fotoacústica, el material que absorbe la luz, la dinámica de la relajación del estado excitado y la frecuencia de modulación o el perfil de pulso de la radiación, así como las propiedades del sensor. Esto requiere procedimientos apropiados para (i) separar entre las señales debidas a diferentes mecanismos y (ii) obtener la dependencia temporal de la evolución del calor (en el caso del mecanismo fototérmico) o la evolución del oxígeno (en el caso del mecanismo fotobárico en la fotosíntesis) o la dependencia temporal de los cambios de volumen, a partir de la dependencia temporal de la señal fotoacústica resultante. [1] [ página necesaria ] [2] [12] [22] [23]
Considerando solo el mecanismo fototérmico, la señal fotoacústica es útil para medir el espectro de absorción de luz , particularmente para muestras transparentes donde la absorción de luz es muy pequeña. En este caso, el método ordinario de espectroscopia de absorción , basado en la diferencia de las intensidades de un haz de luz antes y después de su paso a través de la muestra, no es práctico. En la espectroscopia fotoacústica no existe tal limitación. La señal está directamente relacionada con la absorción de luz y la intensidad de la luz. Dividir el espectro de la señal por el espectro de intensidad de la luz puede dar un espectro de absorción porcentual relativo, que puede calibrarse para producir valores absolutos. Esto es muy útil para detectar concentraciones muy pequeñas de varios materiales. [24] La espectroscopia fotoacústica también es útil para el caso opuesto de muestras opacas, donde la absorción es esencialmente completa. En una disposición donde un sensor se coloca en una fase gaseosa sobre la muestra y la luz incide en la muestra desde arriba, la señal fotoacústica resulta de una zona de absorción cercana a la superficie. Un parámetro típico que rige la señal en este caso es la "longitud de difusión térmica", que depende del material y de la frecuencia de modulación y que normalmente es del orden de varios micrómetros . [1] [ página necesaria ] [12] La señal está relacionada con la luz absorbida en la pequeña distancia de la longitud de difusión térmica, lo que permite la determinación del espectro de absorción. [1] [ página necesaria ] [12] [25] Esto también permite analizar por separado una superficie que es distinta del volumen. [26] [27] Al variar la frecuencia de modulación y la longitud de onda de la radiación de sondeo, se varía esencialmente la profundidad sondeada, lo que da como resultado la posibilidad de perfilar la profundidad [27] y obtener imágenes fotoacústicas , que revelan inhomogeneidades dentro de la muestra. Este análisis también incluye la posibilidad de determinar las propiedades térmicas a partir de la señal fotoacústica. [1] [ página necesaria ]
Recientemente, se ha utilizado el método fotoacústico para medir cuantitativamente macromoléculas, como las proteínas. El inmunoensayo fotoacústico marca y detecta proteínas objetivo utilizando nanopartículas que pueden generar señales acústicas potentes. [28] El análisis de proteínas basado en la fotoacústica también se ha aplicado a las pruebas en el punto de atención. [29]
Otra aplicación del efecto fotoacústico es su capacidad para estimar las energías químicas almacenadas en varios pasos de una reacción fotoquímica. Después de la absorción de la luz se producen conversiones fotofísicas y fotoquímicas, que almacenan parte de la energía de la luz como energía química. El almacenamiento de energía conduce a una menor evolución del calor. La señal fotoacústica resultante, más pequeña, proporciona así una estimación cuantitativa del alcance del almacenamiento de energía. Para las especies transitorias, esto requiere la medición de la señal en la escala de tiempo relevante y la capacidad de extraer de la parte temporal de la señal la evolución del calor dependiente del tiempo, mediante una deconvolución adecuada. [19] [22] [23] Hay numerosos ejemplos de esta aplicación. [30] Una aplicación similar es el estudio de la conversión de energía de la luz en energía eléctrica en células solares. [31] Un ejemplo especial es la aplicación del efecto fotoacústico en la investigación de la fotosíntesis.
La fotosíntesis es una plataforma muy adecuada para ser investigada por el efecto fotoacústico, proporcionando muchos ejemplos de sus diversos usos. Como se señaló anteriormente, la señal fotoacústica de especímenes fotosintéticos húmedos (por ejemplo, microalgas en suspensión, algas marinas ) es principalmente fototérmica. La señal fotoacústica de estructuras esponjosas (hojas, líquenes ) es una combinación de contribuciones fototérmicas y fotobáricas (evolución o absorción de gas). La señal fotoacústica de preparaciones que llevan a cabo las reacciones primarias de transferencia de electrones (por ejemplo, centros de reacción ) es una combinación de contribuciones fototérmicas y de cambios de volumen molecular. En cada caso, respectivamente, las mediciones fotoacústicas proporcionaron información sobre
Estas mediciones proporcionaron información relacionada con el mecanismo de la fotosíntesis, además de dar indicaciones sobre la integridad y salud del espécimen.
Ejemplos de ello son: (a) la energética de los procesos primarios de transferencia de electrones , obtenida a partir del almacenamiento de energía y el cambio de volumen molecular medidos bajo destellos de sub-microsegundos; (b) las características del ciclo de oxidación de 4 pasos en el fotosistema II , [19] obtenidas para hojas mediante el monitoreo de señales pulsadas fotoacústicas y su comportamiento oscilatorio bajo destellos de luz excitantes repetitivos; (c) las características del fotosistema I y el fotosistema II de la fotosíntesis ( espectro de absorción , distribución de luz a los dos fotosistemas) y sus interacciones. Esto se obtiene utilizando luz modulada continuamente de una cierta longitud de onda específica para excitar la señal fotoacústica y medir los cambios en el almacenamiento de energía y la evolución del oxígeno causados por la luz de fondo en varias longitudes de onda elegidas.
En general, las mediciones fotoacústicas de almacenamiento de energía requieren una muestra de referencia para la comparación. Es una muestra con exactamente la misma absorción de luz (en la longitud de onda de excitación dada) pero que degrada completamente toda la luz absorbida en calor dentro de la resolución temporal de la medición. Es una suerte que los sistemas fotosintéticos se autocalibran, proporcionando dicha referencia en una muestra, de la siguiente manera: Uno compara dos señales: una, que se obtiene con la luz modulada/pulsada de sondeo sola y la otra cuando se agrega una luz constante no modulada (denominada luz de fondo ), que es lo suficientemente fuerte como para impulsar la fotosíntesis hasta la saturación. [32] [33] [34] La luz constante añadida no produce ningún efecto fotoacústico por sí misma, pero cambia la respuesta fotoacústica debido a la luz de sondeo modulada/pulsada. La señal resultante sirve como referencia para todas las demás mediciones en ausencia de la luz de fondo. La parte fototérmica de la señal de referencia es máxima, ya que en la saturación fotosintética no se almacena energía. Al mismo tiempo, la contribución de los demás mecanismos tiende a cero en la saturación, por lo que la señal de referencia es proporcional a la energía luminosa total absorbida.
Para separar y definir las contribuciones fotobárica y fototérmica en muestras esponjosas (hojas, líquenes) se utilizan las siguientes propiedades de la señal fotoacústica: (1) A frecuencias bajas (por debajo de aproximadamente 100 Hz) la parte fotobárica de la señal fotoacústica puede ser bastante grande y la señal total disminuye bajo la luz de fondo. La señal fotobárica se obtiene en principio a partir de la diferencia de señales (la señal total menos la señal de referencia, después de una corrección para tener en cuenta el almacenamiento de energía). (2) Sin embargo, a frecuencias suficientemente altas, la señal fotobárica está muy atenuada en comparación con el componente fototérmico y puede despreciarse. Además, no se puede observar ninguna señal fotobárica incluso a bajas frecuencias en una hoja con su espacio de aire interior lleno de agua. Esto también es cierto en talos de algas vivas, suspensiones de microalgas y bacterias fotosintéticas. Esto se debe a que la señal fotobárica depende de la difusión de oxígeno desde las membranas fotosintéticas a la fase de aire, y se atenúa en gran medida a medida que aumenta la distancia de difusión en el medio acuoso. En todos los casos anteriores, cuando no se observa señal fotobárica, se puede determinar el almacenamiento de energía comparando la señal fotoacústica obtenida solo con la luz de sondeo con la señal de referencia. Los parámetros obtenidos a partir de las mediciones anteriores se utilizan de diversas formas. El almacenamiento de energía y la intensidad de la señal fotobárica están relacionados con la eficiencia de la fotosíntesis y se pueden utilizar para monitorear y seguir la salud de los organismos fotosintéticos. También se utilizan para obtener información mecanicista sobre el proceso fotosintético: la luz de diferentes longitudes de onda permite obtener el espectro de eficiencia de la fotosíntesis, la distribución de la luz entre los dos fotosistemas de la fotosíntesis e identificar diferentes taxones de fitoplancton. [35] El uso de láseres pulsados proporciona información termodinámica y cinética sobre los pasos primarios de transferencia de electrones de la fotosíntesis.