La fosfoenolpiruvato carboxiquinasa ( EC 4.1.1.32, PEPCK ) es una enzima de la familia de las liasas que se utiliza en la vía metabólica de la gluconeogénesis . Convierte el oxaloacetato en fosfoenolpiruvato y dióxido de carbono . [1] [2] [3]
Se encuentra en dos formas, citosólica y mitocondrial .
En los seres humanos existen dos isoformas de PEPCK: una forma citosólica (SwissProt P35558) y una isoforma mitocondrial (SwissProt Q16822) que tienen una identidad de secuencia del 63,4%. La forma citosólica es importante en la gluconeogénesis. Sin embargo, existe un mecanismo de transporte conocido para mover PEP desde las mitocondrias al citosol, utilizando proteínas transportadoras de membrana específicas. [4] [5] [6] [7] [8] El transporte de PEP a través de la membrana mitocondrial interna involucra a la proteína transportadora de tricarboxilato mitocondrial y, en menor medida, al transportador de nucleótidos de adenina . También se ha propuesto la posibilidad de un transportador de PEP/piruvato. [9]
Las estructuras de rayos X de PEPCK brindan información sobre la estructura y el mecanismo de la actividad enzimática de PEPCK. La isoforma mitocondrial de PEPCK de hígado de pollo complejada con Mn 2+ , Mn 2+ - fosfoenolpiruvato (PEP) y Mn 2+ -GDP brinda información sobre su estructura y cómo esta enzima cataliza las reacciones. [10] Delbaere et al. (2004) resolvieron PEPCK en E. coli y encontraron el sitio activo ubicado entre un dominio C-terminal y un dominio N-terminal . Se observó que el sitio activo se cerraba tras la rotación de estos dominios. [11]
Los grupos fosforilo se transfieren durante la acción de PEPCK, lo que probablemente se ve facilitado por la conformación eclipsada de los grupos fosforilo cuando el ATP está unido a PEPCK. [11]
Dado que la formación eclipsada es una formación de alta energía, la transferencia del grupo fosforilo tiene una energía de activación reducida , lo que significa que los grupos se transferirán más fácilmente. Esta transferencia probablemente ocurre a través de un mecanismo similar al desplazamiento SN2 . [11]
La transcripción del gen PEPCK ocurre en muchas especies y la secuencia de aminoácidos de PEPCK es distinta para cada especie.
Por ejemplo, su estructura y su especificidad difieren en humanos, Escherichia coli ( E. coli ) y el parásito Trypanosoma cruzi . [12]
La PEPCKasa convierte el oxalacetato en fosfoenolpiruvato y dióxido de carbono .
Como la PEPCK actúa en la unión entre la glucólisis y el ciclo de Krebs, provoca la descarboxilación de una molécula C4 , creando una molécula C3 . Como primer paso comprometido en la gluconeogénesis, la PEPCK descarboxila y fosforila el oxaloacetato (OAA) para su conversión a PEP, cuando está presente GTP. A medida que se transfiere un fosfato, la reacción da como resultado una molécula de GDP. [10] Cuando la piruvato quinasa , la enzima que normalmente cataliza la reacción que convierte PEP en piruvato, es eliminada en mutantes de Bacillus subtilis , la PEPCK participa en una de las reacciones anapleróticas de reemplazo , trabajando en la dirección inversa de su función normal, convirtiendo PEP en OAA. [13] Aunque esta reacción es posible, la cinética es tan desfavorable que los mutantes crecen a un ritmo muy lento o no crecen en absoluto. [13]
La PEPCK-C cataliza un paso irreversible de la gluconeogénesis , el proceso mediante el cual se sintetiza la glucosa. Por lo tanto, se ha considerado que la enzima es esencial para la homeostasis de la glucosa, como se demostró en ratones de laboratorio que contrajeron diabetes mellitus tipo 2 como resultado de la sobreexpresión de la PEPCK-C. [14]
El papel que desempeña PEPCK-C en la gluconeogénesis puede estar mediado por el ciclo del ácido cítrico , cuya actividad se encontró que estaba directamente relacionada con la abundancia de PEPCK-C. [15]
Los niveles de PEPCK-C por sí solos no se correlacionaron en gran medida con la gluconeogénesis en el hígado del ratón, como lo han sugerido estudios previos. [15] Si bien el hígado del ratón expresa casi exclusivamente PEPCK-C, los humanos también presentan una isoenzima mitocondrial (PEPCK-M). La PEPCK-M tiene potencial gluconeogénico per se. [2] Por lo tanto, el papel de la PEPCK-C y la PEPCK-M en la gluconeogénesis puede ser más complejo e involucrar más factores de lo que se creía anteriormente.
En los animales, este es un paso que controla la velocidad de la gluconeogénesis , el proceso por el cual las células sintetizan glucosa a partir de precursores metabólicos. El nivel de glucosa en sangre se mantiene dentro de límites bien definidos en parte debido a la regulación precisa de la expresión del gen PEPCK. Para enfatizar la importancia de PEPCK en la homeostasis de la glucosa , la sobreexpresión de esta enzima en ratones da como resultado síntomas de diabetes mellitus tipo II , con mucho la forma más común de diabetes en humanos. Debido a la importancia de la homeostasis de la glucosa en sangre, varias hormonas regulan un conjunto de genes (incluido PEPCK) en el hígado que modulan la velocidad de síntesis de glucosa.
La actividad de la PEPCK-C está controlada por dos mecanismos hormonales diferentes. La actividad de la PEPCK-C aumenta con la secreción de cortisol de la corteza suprarrenal y de glucagón de las células alfa del páncreas. El glucagón eleva indirectamente la expresión de la PEPCK-C al aumentar los niveles de AMPc (mediante la activación de la adenilil ciclasa) en el hígado, lo que conduce a la fosforilación de S133 en una lámina beta de la proteína CREB . A continuación, la CREB se une aguas arriba del gen de la PEPCK-C en el CRE (elemento de respuesta al AMPc) e induce la transcripción de la PEPCK-C. Por otra parte, el cortisol, cuando es liberado por la corteza suprarrenal, atraviesa la membrana lipídica de las células hepáticas (debido a su naturaleza hidrofóbica, puede atravesar directamente las membranas celulares) y luego se une a un receptor de glucocorticoides (GR). Este receptor se dimeriza y el complejo cortisol/GR pasa al núcleo, donde luego se une a la región del Elemento de Respuesta a Glucocorticoides (GRE) de manera similar a CREB y produce resultados similares (síntesis de más PEPCK-C).
Juntos, el cortisol y el glucagón pueden tener enormes resultados sinérgicos, activando el gen PEPCK-C a niveles que ni el cortisol ni el glucagón podrían alcanzar por sí solos. El PEPCK-C es más abundante en el hígado, los riñones y el tejido adiposo. [3]
Un estudio colaborativo entre la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA) y la Universidad de New Hampshire investigó el efecto de DE-71, una mezcla comercial de PBDE , sobre la cinética de la enzima PEPCK y determinó que el tratamiento in vivo del contaminante ambiental compromete el metabolismo hepático de la glucosa y los lípidos posiblemente por activación del receptor xenobiótico pregnano ( PXR ), y puede influir en la sensibilidad a la insulina de todo el cuerpo. [16]
Investigadores de la Universidad Case Western Reserve han descubierto que la sobreexpresión de PEPCK citosólica en el músculo esquelético de los ratones hace que estos sean más activos, más agresivos y tengan vidas más largas que los ratones normales; ver superratones metabólicos .
PEPCK ( EC 4.1.1.49) es una de las tres enzimas de descarboxilación utilizadas en los mecanismos de concentración de carbono inorgánico de las plantas C 4 y CAM . Las otras son la enzima NADP-málica y la enzima NAD-málica . [17] [18] En la fijación de carbono C 4 , el dióxido de carbono se fija primero por combinación con fosfoenolpiruvato para formar oxaloacetato en el mesófilo . En las plantas C 4 de tipo PEPCK , el oxaloacetato se convierte luego en aspartato , que viaja a la vaina del haz . En las células de la vaina del haz , el aspartato se convierte nuevamente en oxaloacetato . PEPCK descarboxila el oxaloacetato de la vaina del haz , liberando dióxido de carbono , que luego es fijado por la enzima Rubisco . Por cada molécula de dióxido de carbono producida por PEPCK, se consume una molécula de ATP .
PEPCK actúa en plantas que experimentan fijación de carbono C 4 , donde su acción se ha localizado en el citosol , en contraste con los mamíferos, donde se ha encontrado que PEPCK actúa en las mitocondrias . [19]
Aunque se encuentra en muchas partes diferentes de las plantas, se ha visto sólo en tipos de células específicos, incluidas las áreas del floema . [20]
También se ha descubierto que, en el pepino ( Cucumis sativus L. ), los niveles de PEPCK aumentan por múltiples efectos que se sabe que disminuyen el pH celular de las plantas, aunque estos efectos son específicos de la parte de la planta. [20]
Los niveles de PEPCK aumentaron en las raíces y los tallos cuando las plantas fueron regadas con cloruro de amonio a un pH bajo (pero no a un pH alto ) o con ácido butírico . Sin embargo, los niveles de PEPCK no aumentaron en las hojas en estas condiciones.
En las hojas, un contenido de CO2 del 5% en la atmósfera conduce a una mayor abundancia de PEPCK. [20]
En un esfuerzo por explorar el papel de PEPCK, los investigadores provocaron la sobreexpresión de PEPCK en la bacteria E. coli a través de ADN recombinante . [21]
Se ha demostrado que la PEPCK de Mycobacterium tuberculosis activa el sistema inmunológico en ratones al aumentar la actividad de las citocinas . [22]
Como resultado, se ha descubierto que PEPCK puede ser un ingrediente apropiado en el desarrollo de una vacuna de subunidades eficaz contra la tuberculosis . [22]
Hasta hace poco, la PEPCK no se había tenido en cuenta en la investigación del cáncer. Se ha demostrado que en muestras de tumores humanos y líneas celulares de cáncer humano (células de cáncer de mama, colon y pulmón), la PEPCK-M, y no la PEPCK-C, se expresaba en niveles suficientes para desempeñar un papel metabólico relevante. [1] [23] Por lo tanto, la PEPCK-M podría tener un papel en las células cancerosas, especialmente en condiciones de limitación de nutrientes u otras condiciones de estrés.
La producción y activación de PEPCK-C se ve potenciada por numerosos factores. La transcripción del gen PEPCK-C es estimulada por el glucagón , los glucocorticoides , el ácido retinoico y el adenosín 3',5'-monofosfato ( cAMP ), mientras que es inhibida por la insulina . [24] De estos factores, la insulina, una hormona deficiente en el caso de la diabetes mellitus tipo 1, se considera dominante, ya que inhibe la transcripción de muchos de los elementos estimuladores. [24] La actividad de PEPCK también es inhibida por el sulfato de hidrazina , y por tanto la inhibición disminuye la tasa de gluconeogénesis. [25]
En la acidosis prolongada , la PEPCK-C se regula positivamente en las células del borde en cepillo del túbulo proximal renal , con el fin de secretar más NH 3 y, por lo tanto, producir más HCO 3 − . [26]
La actividad específica de GTP de PEPCK es máxima cuando hay Mn 2+ y Mg 2+ disponibles. [21] Además, la cisteína hiperreactiva (C307) está involucrada en la unión de Mn 2+ al sitio activo. [10]
Como se discutió anteriormente, la abundancia de PEPCK aumentó cuando las plantas se regaron con cloruro de amonio de pH bajo, aunque el pH alto no tuvo este efecto. [20]
Está clasificado con el número CE 4.1.1. Existen tres tipos principales, que se distinguen según la fuente de energía que impulsa la reacción:
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