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Fluoróforo

Una célula humana marcada con fluoróforo .

Un fluoróforo (o fluorocromo , de manera similar a un cromóforo ) es un compuesto químico fluorescente que puede volver a emitir luz al ser excitado por la luz. Los fluoróforos suelen contener varios grupos aromáticos combinados o moléculas planares o cíclicas con varios enlaces π . [1]

Los fluoróforos se utilizan a veces solos, como trazadores en fluidos, como colorante para la tinción de ciertas estructuras, como sustrato de enzimas o como sonda o indicador (cuando su fluorescencia se ve afectada por aspectos ambientales como la polaridad o los iones). De manera más general, se unen covalentemente a macromoléculas y sirven como marcadores (o colorantes, o etiquetas, o reporteros) para reactivos afines o bioactivos ( anticuerpos , péptidos, ácidos nucleicos). Los fluoróforos se utilizan notablemente para teñir tejidos, células o materiales en una variedad de métodos analíticos, como la obtención de imágenes fluorescentes y la espectroscopia .

La fluoresceína , a través de su derivado isotiocianato reactivo con amina , el isotiocianato de fluoresceína (FITC), ha sido uno de los fluoróforos más populares. Desde el etiquetado de anticuerpos, las aplicaciones se han extendido a los ácidos nucleicos gracias a la carboxifluoresceína . Otros fluoróforos históricamente comunes son los derivados de la rodamina (TRITC), la cumarina y la cianina . [2] Las generaciones más nuevas de fluoróforos, muchas de las cuales son patentadas, a menudo funcionan mejor, siendo más fotoestables, más brillantes o menos sensibles al pH que los colorantes tradicionales con excitación y emisión comparables. [3] [4]

Fluorescencia

El fluoróforo absorbe energía luminosa de una longitud de onda específica y reemite luz a una longitud de onda más larga. Las longitudes de onda absorbidas , la eficiencia de transferencia de energía y el tiempo antes de la emisión dependen tanto de la estructura del fluoróforo como de su entorno químico, ya que la molécula en su estado excitado interactúa con las moléculas circundantes. Las longitudes de onda de máxima absorción (≈ excitación) y emisión (por ejemplo, Absorción/Emisión = 485 nm/517 nm) son los términos típicos utilizados para referirse a un fluoróforo determinado, pero puede ser importante considerar todo el espectro. El espectro de longitud de onda de excitación puede ser una banda muy estrecha o más amplia, o puede estar todo más allá de un nivel de corte. El espectro de emisión suele ser más nítido que el espectro de excitación, y es de una longitud de onda más larga y, en consecuencia, de menor energía. Las energías de excitación varían desde el ultravioleta hasta el espectro visible , y las energías de emisión pueden continuar desde la luz visible hasta la región del infrarrojo cercano .

Las principales características de los fluoróforos son:

Estas características determinan otras propiedades, como el fotoblanqueo o la fotorresistencia (pérdida de fluorescencia tras la excitación continua con luz). Se deben tener en cuenta otros parámetros, como la polaridad de la molécula de fluoróforo, el tamaño y la forma del fluoróforo (es decir, para el patrón de fluorescencia de polarización ) y otros factores que pueden cambiar el comportamiento de los fluoróforos.

Los fluoróforos también se pueden utilizar para apagar la fluorescencia de otros colorantes fluorescentes o para transmitir su fluorescencia a longitudes de onda aún más largas .

Tamaño (peso molecular)

La mayoría de los fluoróforos son pequeñas moléculas orgánicas de 20 a 100 átomos (200 a 1000 Dalton ; el peso molecular puede ser mayor dependiendo de las modificaciones injertadas y las moléculas conjugadas), pero también hay fluoróforos naturales mucho más grandes que son proteínas : la proteína fluorescente verde (GFP) tiene 27 kDa , y varias ficobiliproteínas (PE, APC...) tienen ≈240 kDa. En 2020, se afirmaba que el fluoróforo más pequeño conocido era el 3-hidroxiisonicotinaldehído , un compuesto de 14 átomos y solo 123 Da. [8]

Las partículas fluorescentes como los puntos cuánticos (de 2 a 10 nm de diámetro y de 100 a 100 000 átomos) también se consideran fluoróforos. [9]

El tamaño del fluoróforo podría obstaculizar estéricamente la molécula marcada y afectar la polaridad de la fluorescencia.

Familias

Fluorescencia de diferentes sustancias bajo luz ultravioleta. El verde es fluoresceína , el rojo es rodamina B , el amarillo es rodamina 6G , el azul es quinina , el violeta es una mezcla de quinina y rodamina 6g. Las soluciones tienen una concentración de aproximadamente 0,001 % en agua.

Las moléculas fluoróforas pueden utilizarse solas o servir como motivo fluorescente de un sistema funcional. En función de la complejidad molecular y los métodos sintéticos, las moléculas fluoróforas pueden clasificarse en cuatro categorías: proteínas y péptidos, compuestos orgánicos pequeños, oligómeros y polímeros sintéticos y sistemas multicomponentes. [10] [11]

Las proteínas fluorescentes GFP, YFP y RFP (verde, amarilla y roja, respectivamente) se pueden unir a otras proteínas específicas para formar una proteína de fusión , sintetizada en las células después de la transfección de un portador de plásmido adecuado .

Los fluoróforos orgánicos no proteicos pertenecen a las siguientes familias químicas principales:

Estos fluoróforos emiten fluorescencia debido a electrones deslocalizados que pueden saltar una banda y estabilizar la energía absorbida. Por ejemplo, el benceno , uno de los hidrocarburos aromáticos más simples, se excita a 254 nm y emite a 300 nm. [12] Esto diferencia a los fluoróforos de los puntos cuánticos, que son nanopartículas semiconductoras fluorescentes .

Se pueden unir a las proteínas a grupos funcionales específicos, como grupos amino ( éster activo , carboxilato , isotiocianato , hidrazina ), grupos carboxilo ( carbodiimida ), tiol ( maleimida , bromuro de acetilo ) y azida orgánica (a través de química clic o de forma no específica ( glutaraldehído )).

Además, pueden estar presentes varios grupos funcionales para alterar sus propiedades, como la solubilidad, o conferir propiedades especiales, como el ácido borónico que se une a los azúcares o múltiples grupos carboxilo para unirse a ciertos cationes. Cuando el colorante contiene un grupo donador de electrones y un grupo aceptor de electrones en extremos opuestos del sistema aromático, este colorante probablemente será sensible a la polaridad del entorno ( solvatocrómico ), por lo que se lo denomina sensible al medio ambiente. A menudo, los colorantes se utilizan dentro de las células, que son impermeables a las moléculas cargadas; como resultado de esto, los grupos carboxilo se convierten en un éster, que es eliminado por esterasas dentro de las células, por ejemplo, fura-2AM y diacetato de fluoresceína.

Las siguientes familias de tintes son grupos de marcas comerciales y no necesariamente comparten similitudes estructurales.

Núcleos de células endoteliales de la arteria pulmonar bovina teñidos de azul con DAPI , mitocondrias teñidas de rojo con MitoTracker Red CMXRos y F-actina teñida de verde con faloidina Alexa Fluor 488 e imagenadas en un microscopio fluorescente.

Ejemplos de fluoróforos que se encuentran frecuentemente

Colorantes reactivos y conjugados

Abreviaturas:

Colorantes de ácidos nucleicos

Colorantes de función celular

Proteínas fluorescentes

Proteínas fluorescentes avanzadas

StayGold y mStayGold son proteínas fluorescentes avanzadas que han contribuido significativamente al campo de la obtención de imágenes de células vivas. StayGold, conocida por su alta fotoestabilidad y brillo, fue diseñada originalmente como una proteína fluorescente dimérica, que, si bien era efectiva, planteaba desafíos relacionados con la agregación y la precisión del etiquetado. [15] Para abordar estas limitaciones, mStayGold fue diseñada como una variante monomérica, lo que mejora su utilidad en el etiquetado preciso de proteínas. mStayGold exhibe una fotoestabilidad superior, mantiene la fluorescencia en condiciones de alta irradiancia y demuestra un mayor brillo en comparación con su variante anterior StayGold. Además, madura más rápido, lo que permite una obtención de imágenes más rápida después de la transfección. Estos avances hacen de mStayGold una herramienta versátil para una variedad de aplicaciones, incluido el seguimiento de moléculas individuales y la obtención de imágenes de alta resolución de procesos celulares dinámicos, lo que amplía las capacidades de la proteína fluorescente en la investigación biológica. [16]

Abreviaturas:

Aplicaciones

Los fluoróforos tienen particular importancia en el campo de la bioquímica y los estudios de proteínas , por ejemplo, en inmunofluorescencia , análisis de células, [17] inmunohistoquímica , [3] [18] y sensores de moléculas pequeñas . [19] [20]

Usos fuera de las ciencias de la vida

Tinte marino fluorescente

Los colorantes fluorescentes encuentran un amplio uso en la industria, recibiendo el nombre de "colores neón", como por ejemplo:

Véase también

Referencias

  1. ^ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). "Capítulo 3 Colorantes y Fluorocromos". Microscopía de fluorescencia en ciencias de la vida . Bentham Science Publishers. págs. 61–95. ISBN 978-1-68108-519-7. Recuperado el 24 de diciembre de 2017 .
  2. ^ Rietdorf J (2005). Técnicas microscópicas. Avances en ingeniería bioquímica/biotecnología. Berlín: Springer. pp. 246–9. ISBN 3-540-23698-8. Recuperado el 13 de diciembre de 2008 .
  3. ^ ab Tsien RY; Waggoner A (1995). "Fluoróforos para microscopía confocal". En Pawley JB (ed.). Manual de microscopía confocal biológica . Nueva York: Plenum Press. págs. 267–74. ISBN 0-306-44826-2. Recuperado el 13 de diciembre de 2008 .
  4. ^ Lakowicz, JR (2006). Principios de espectroscopia de fluorescencia (3.ª ed.). Springer. pág. 954. ISBN 978-0-387-31278-1.
  5. ^ Pons T, Medintz IL, Farrell D, Wang X, Grimes AF, English DS, Berti L, Mattoussi H (2011). "Los estudios de colocalización de moléculas individuales arrojan luz sobre la idea de puntos cuánticos individuales totalmente emisores versus oscuros". Small . 7 (14): 2101–2108. doi :10.1002/smll.201100802. PMID  21710484.
  6. ^ Koner AL, Krndija D, Hou Q, Sherratt DJ, Howarth M (2013). "Las nanopartículas de polímero conjugado con terminación hidroxi tienen una fracción brillante cercana a la unidad y revelan la dependencia del colesterol de los nanodominios de IGF1R". ACS Nano . 7 (2): 1137–1144. doi : 10.1021/nn3042122 . PMC 3584654 . PMID  23330847. 
  7. ^ Garcia-Parajo MF, Segers-Nolten GM, Veerman JA, Greve J, van Hulst NF (2000). "Dinámica en tiempo real impulsada por la luz de la emisión de fluorescencia en moléculas de proteína fluorescente verde individuales". PNAS . 97 (13): 7237–7242. Bibcode :2000PNAS...97.7237G. doi : 10.1073/pnas.97.13.7237 . PMC 16529 . PMID  10860989. 
  8. ^ Cozens, Tom (16 de diciembre de 2020). "Una molécula fluorescente rompe el récord de tamaño de los tintes que emiten luz verde". chemistryworld.com . Consultado el 3 de diciembre de 2021 .
  9. ^ Li Z, Zhao X, Huang C, Gong X (2019). "Avances recientes en la fabricación ecológica de concentradores solares luminiscentes utilizando puntos cuánticos no tóxicos como fluoróforos". J. Mater. Chem. C . 7 (40): 12373–12387. doi :10.1039/C9TC03520F. S2CID  203003761.
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  11. ^ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). "Capítulo 4 Etiquetas fluorescentes". Microscopía de fluorescencia en ciencias de la vida . Bentham Science Publishers. págs. 96–134. ISBN 978-1-68108-519-7. Recuperado el 24 de diciembre de 2017 .
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