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Desoxirribozima

Las desoxirribozimas , también llamadas enzimas de ADN , ADNzimas o ADN catalítico , son oligonucleótidos de ADN que son capaces de realizar una reacción química específica , a menudo, pero no siempre, catalítica . Esto es similar a la acción de otras enzimas biológicas , como las proteínas o las ribozimas (enzimas compuestas de ARN ). [1] Sin embargo, en contraste con la abundancia de enzimas proteicas en los sistemas biológicos y el descubrimiento de las ribozimas biológicas en la década de 1980, [2] [3] solo hay poca evidencia de desoxirribozimas de origen natural. [4] [5] Las desoxirribozimas no deben confundirse con los aptámeros de ADN, que son oligonucleótidos que se unen selectivamente a un ligando objetivo , pero no catalizan una reacción química posterior.

Con la excepción de las ribozimas, las moléculas de ácido nucleico dentro de las células sirven principalmente como almacenamiento de información genética debido a su capacidad para formar pares de bases complementarias, lo que permite la copia y transferencia de información genética de alta fidelidad . Por el contrario, las moléculas de ácido nucleico están más limitadas en su capacidad catalítica, en comparación con las enzimas proteicas, a solo tres tipos de interacciones: enlace de hidrógeno , apilamiento pi y coordinación de iones metálicos . Esto se debe al número limitado de grupos funcionales de los monómeros de ácido nucleico : mientras que las proteínas se construyen a partir de hasta veinte aminoácidos diferentes con varios grupos funcionales, los ácidos nucleicos se construyen a partir de solo cuatro nucleobases químicamente similares . Además, el ADN carece del grupo hidroxilo 2' que se encuentra en el ARN, lo que limita la competencia catalítica de las desoxirribozimas incluso en comparación con las ribozimas. [6]

Además de la inferioridad inherente de la actividad catalítica del ADN, la aparente falta de desoxirribozimas naturales también puede deberse a la conformación principalmente bicatenaria del ADN en los sistemas biológicos, lo que limitaría su flexibilidad física y su capacidad para formar estructuras terciarias , y por lo tanto limitaría drásticamente la capacidad del ADN bicatenario para actuar como catalizador; [6] aunque hay algunos casos conocidos de ADN monocatenario biológico, como el ADN monocatenario multicopia (ADNms), ciertos genomas virales y la horquilla de replicación formada durante la replicación del ADN. Otras diferencias estructurales entre el ADN y el ARN también pueden desempeñar un papel en la falta de desoxirribozimas biológicas, como el grupo metilo adicional de la base del ADN timidina en comparación con la base del ARN uracilo o la tendencia del ADN a adoptar la hélice de forma B mientras que el ARN tiende a adoptar la hélice de forma A. [1] Sin embargo, también se ha demostrado que el ADN puede formar estructuras que el ARN no puede, lo que sugiere que, aunque existen diferencias en las estructuras que cada uno puede formar, ninguno es inherentemente más o menos catalítico debido a sus posibles motivos estructurales. [1]

En 2021, se lanzó la base de datos DNAmoreDB para catalogar las desoxirribozimas conocidas. [7]

Tipos

Ribonucleasas

La forma trans (dos cadenas separadas) de la ADNzima 17E. La mayoría de las ADNzimas ribonucleasas tienen una forma similar, que consiste en una cadena de enzima separada ( azul / cian ) y una cadena de sustrato ( negra ). Dos brazos de bases complementarias flanquean el núcleo catalítico ( cian ) en la cadena de enzima y el ribonucleótido único ( rojo ) en la cadena de sustrato. La flecha muestra el sitio de escisión del ribonucleótido.

La clase más abundante de desoxirribozimas son las ribonucleasas , que catalizan la escisión de un enlace fosfodiéster de ribonucleótido a través de una reacción de transesterificación , formando un extremo fosfato cíclico 2'3' y un extremo hidroxilo 5' . [6] [8] Las desoxirribozimas ribonucleasas suelen someterse a selección como oligonucleótidos largos de cadena sencilla que contienen una sola base de ribonucleótido para actuar como sitio de escisión. Una vez secuenciada, esta forma "cis" monocatenaria de la desoxirribozima se puede convertir en la forma "trans" bicatenaria separando el dominio del sustrato (que contiene el sitio de escisión del ribonucleótido) y el dominio enzimático (que contiene el núcleo catalítico) en cadenas separadas que pueden hibridar a través de dos brazos flanqueantes que consisten en pares de bases complementarios .

La primera desoxirribozima conocida fue una ribonucleasa, descubierta en 1994 por Ronald Breaker mientras era investigador postdoctoral en el laboratorio de Gerald Joyce en el Scripps Research Institute . [9] Esta desoxirribozima, posteriormente denominada GR-5, [10] cataliza la escisión dependiente de Pb 2+ de un único fosfoéster de ribonucleótido a una velocidad que es más de 100 veces comparada con la reacción no catalizada. [9] Posteriormente, se desarrollaron desoxirribozimas de escisión de ARN adicionales que incorporan diferentes cofactores metálicos, incluida la desoxirribozima E2 dependiente de Mg 2+ [11] y la desoxirribozima Mg5 dependiente de Ca 2+ . [12] Estas primeras desoxirribozimas no pudieron catalizar una cadena completa de sustrato de ARN, pero al incorporar la cadena completa de sustrato de ARN en el proceso de selección, se pudieron utilizar desoxirribozimas que funcionaban con sustratos que consistían en ARN completo o ADN completo con una sola base de ARN. [13] Las primeras de estas desoxirribozimas más versátiles, 8-17 y 10-23, son actualmente las desoxirribozimas más estudiadas. De hecho, se encontró que muchas desoxirribozimas descubiertas posteriormente contenían el mismo motivo central catalítico que 8-17, incluido el Mg5 descubierto anteriormente, lo que sugiere que este motivo representa la "solución más simple para el problema de la escisión del ARN". [8] [14] La ADNzima 10-23 contiene un núcleo catalítico de 15 nucleótidos que está flanqueado por dos dominios de reconocimiento de sustrato. Esta ADNzima escinde ARN complementarios de manera eficiente de una manera específica de secuencia entre una purina desapareada y una pirimidina apareada. Las ADNzimas dirigidas a AU o GU frente a GC o AC son más efectivas. Además, se ha demostrado que las tasas de escisión de ARN aumentan después de la introducción de intercaladores o la sustitución de desoxiguanina con desoxiinosina en la unión del bucle catalítico. Específicamente, la adición de modificaciones 2'-O-metil al catalizador demostró aumentar significativamente la tasa de escisión tanto in vitro como in vivo. [15] Además, estudios recientes se han centrado en desentrañar su cinética para comprender mejor su rendimiento. [16] Otras ribonucleasas desoxirribozimas notables son aquellas que son altamente selectivas para un cierto cofactor. Entre este grupo se encuentran las desoxirribozimas selectivas de metales como la 17E específica de Pb 2+ , [17] la 39E específica de UO 2 2+ , [18] y la A43 específica de Na + . [19]La primera estructura cristalina de una ADNzima se informó en 2016. [20] [21] Las ADNzimas basadas en el núcleo 10-23 y las respectivas MNAzimas que catalizan reacciones a temperatura ambiente se describieron en 2018 [22] y abren las puertas para el uso de estas enzimas basadas en ácidos nucleicos para muchas otras aplicaciones sin necesidad de calentamiento.

Una molécula de ADN con secuencia 5'-GGAGAACGCGAGGCAAGGCTGGGAGAAATGTGGATCACGATT-3' actúa como una desoxirribozima que utiliza la luz para reparar un dímero de timina , utilizando la serotonina como cofactor . [23]

Ligasas de ARN

De particular interés son las ligasas de ADN . [6] Estas moléculas han demostrado una notable quimioselectividad en las reacciones de ramificación del ARN. Aunque cada unidad repetida en una cadena de ARN posee un grupo hidroxilo libre , la ligasa de ADN toma solo una de ellas como punto de inicio de la ramificación. Esto no se puede hacer con la química orgánica tradicional .

Otras reacciones

Desde entonces, se han desarrollado muchas otras desoxirribozimas que catalizan la fosforilación del ADN, la adenilación del ADN , la desglicosilación del ADN , la metalación de la porfirina , la fotorreversión del dímero de timina [24] y la escisión del ADN.

Métodos

in vitroselección

Debido a que no se conocen desoxirribozimas naturales, la mayoría de las secuencias de desoxirribozimas conocidas se han descubierto a través de una técnica de selección in vitro de alto rendimiento, similar a SELEX . [25] [26] La selección in vitro utiliza un "pool" de una gran cantidad de secuencias de ADN aleatorias (normalmente 10 14 –10 15 hebras únicas) que se pueden examinar para una actividad catalítica específica. El pool se sintetiza a través de síntesis en fase sólida de modo que cada hebra tiene dos regiones constantes ( sitios de unión de cebadores para la amplificación por PCR) que flanquean una región aleatoria de una cierta longitud, normalmente de 25 a 50 bases de longitud. Por lo tanto, el número total de hebras únicas, llamado espacio de secuencia, es 4 N donde N denota el número de bases en la región aleatoria. Debido a que 4 25 ≈ 10 15 , no hay ninguna razón práctica para elegir regiones aleatorias de menos de 25 bases de longitud, mientras que superar este número de bases significa que no se puede examinar el espacio de secuencia total. Sin embargo, dado que es probable que existan muchos candidatos potenciales para una reacción catalítica dada dentro del espacio de secuencias, regiones aleatorias de 50 e incluso más han producido con éxito desoxirribozimas catalíticas. [26]

El pool se somete primero a un paso de selección, durante el cual las cadenas catalíticas se separan de las cadenas no catalíticas. El método de separación exacto dependerá de la reacción que se esté catalizando. Como ejemplo, el paso de separación para la escisión de ribonucleótidos a menudo utiliza cromatografía de afinidad , en la que una etiqueta biológica unida a cada cadena de ADN se elimina de cualquier cadena catalíticamente activa mediante la escisión de una base de ribonucleótido. Esto permite que las cadenas catalíticas se separen mediante una columna que se une específicamente a la etiqueta, ya que las cadenas no activas permanecerán unidas a la columna mientras que las cadenas activas (que ya no poseen la etiqueta) fluyen a través de ella. Una configuración común para esto es una etiqueta de biotina con una columna de afinidad de estreptavidina . [25] [26] También se puede utilizar la separación basada en electroforesis en gel en la que el cambio en el peso molecular de las cadenas tras la reacción de escisión es suficiente para provocar un cambio en la ubicación de las cadenas reactivas en el gel. [26] Después del paso de selección, el pool reactivo se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para regenerar y amplificar las cadenas reactivas, y el proceso se repite hasta que se obtiene un pool de reactividad suficiente. Se requieren múltiples rondas de selección porque algunas cadenas no catalíticas inevitablemente pasarán por cualquier paso de selección individual. Por lo general, se requieren de 4 a 10 rondas para una actividad catalítica inequívoca, [8] aunque a menudo se necesitan más rondas para condiciones catalíticas más estrictas. Después de un número suficiente de rondas, el pool final se secuencia y las cadenas individuales se prueban para su actividad catalítica. [26] La dinámica del pool se puede describir a través de modelos matemáticos, [27] que muestran cómo los oligonucleótidos experimentan una unión competitiva con los objetivos y cómo se puede mejorar el resultado evolutivo mediante un ajuste fino de los parámetros.

Las desoxirribozimas obtenidas mediante selección in vitro se optimizarán para las condiciones durante la selección, como la concentración de sal , el pH y la presencia de cofactores . Debido a esto, la actividad catalítica solo en presencia de cofactores específicos u otras condiciones se puede lograr utilizando pasos de selección positiva, así como pasos de selección negativa contra otras condiciones no deseadas.

in vitroevolución

Un método similar para obtener nuevas desoxirribozimas es mediante la evolución in vitro . Aunque este término se utiliza a menudo indistintamente con la selección in vitro , la evolución in vitro se refiere más apropiadamente a un procedimiento ligeramente diferente en el que el grupo inicial de oligonucleótidos se altera genéticamente en rondas posteriores a través de recombinación genética o mediante mutaciones puntuales . [25] [26] Para las mutaciones puntuales, el grupo se puede amplificar utilizando PCR propensa a errores para producir muchas hebras diferentes de varias mutaciones únicas aleatorias. Al igual que con la selección in vitro , las hebras evolucionadas con mayor actividad tenderán a dominar el grupo después de múltiples pasos de selección, y una vez que se alcanza una actividad catalítica suficiente, el grupo se puede secuenciar para identificar las hebras más activas.

El grupo inicial para la evolución in vitro puede derivarse de un subconjunto reducido del espacio de secuencias, como una ronda determinada de un experimento de selección in vitro , que a veces también se denomina reselección in vitro . [26] El grupo inicial también puede derivarse de la amplificación de una sola cadena de oligonucleótidos. Como ejemplo de esto último, un estudio reciente mostró que una desoxirribozima funcional puede seleccionarse mediante la evolución in vitro de una cadena precursora de oligonucleótidos no catalíticos. Un fragmento de ADN elegido arbitrariamente derivado de la transcripción de ARNm de albúmina de suero bovino se desarrolló mediante mutaciones puntuales aleatorias a lo largo de 25 rondas de selección. A través del análisis de secuenciación profunda de varias generaciones de grupos, se pudo rastrear la evolución de la cadena de desoxirribozima más catalítica a través de cada mutación individual posterior. [28] Esta primera evolución exitosa de ADN catalítico a partir de un precursor no catalítico podría brindar apoyo a la hipótesis del mundo del ARN . En otro estudio reciente, una ribozima de la ARN ligasa se convirtió en una desoxirribozima mediante la evolución in vitro del análogo desoxirribozima inactivo. La nueva desoxirribozima de la ARN ligasa contenía solo doce mutaciones puntuales, dos de las cuales no tenían efecto sobre la actividad, y tenía una eficiencia catalítica de aproximadamente 1/10 de la ribozima original, aunque los investigadores plantearon la hipótesis de que la actividad podría aumentarse aún más mediante una selección adicional. [29] Esta primera evidencia de transferencia de función entre diferentes ácidos nucleicos podría brindar apoyo a varias hipótesis anteriores al mundo del ARN .

¿Catálisis "verdadera"?

Debido a que la mayoría de las desoxirribozimas sufren inhibición del producto y, por lo tanto, exhiben un comportamiento de recambio único , a veces se argumenta que las desoxirribozimas no exhiben un comportamiento catalítico "verdadero", ya que no pueden experimentar catálisis de recambio múltiple como la mayoría de las enzimas biológicas . Sin embargo, la definición general de un catalizador solo requiere que la sustancia acelere la velocidad de una reacción química sin ser consumida por la reacción (es decir, no se altera químicamente de forma permanente y se puede reciclar). Por lo tanto, según esta definición, las desoxirribozimas de recambio único son de hecho catalizadores. [6] Además, muchas enzimas endógenas (tanto proteínas como ribozimas ) también exhiben un comportamiento de recambio único, [6] y, por lo tanto, la exclusión de las desoxirribozimas del rango de "catalizador" simplemente porque no presenta un comportamiento de recambio múltiple parece injustificada.

Aplicaciones

Aunque las enzimas de ARN se descubrieron antes que las enzimas de ADN, estas últimas tienen algunas ventajas distintivas. El ADN es más rentable y se puede fabricar con una longitud de secuencia más larga y con mayor pureza en la síntesis en fase sólida . [30] Varios estudios han demostrado el uso de las enzimas de ARN para inhibir la replicación de los virus de la influenza A y B en las células huésped. [31] [32] [33] [34] [35] [36] También se ha demostrado que las enzimas de ARN inhiben la replicación del coronavirus del SARS (SARS-CoV), [36] el virus respiratorio sincitial (VRS), [36] el rinovirus humano 14 [37] y el VHC [38]

Ensayos clínicos de medicamentos

El asma se caracteriza por una inflamación inducida por eosinófilos motivada por una célula T colaboradora de tipo 2 (Th2). Al dirigirse al factor de transcripción, GATA3, de la vía Th2, con DNAzyme, puede ser posible anular la inflamación. Se evaluó la seguridad y eficacia de SB010, una nueva DNAzyme 10-23, y se encontró que tiene la capacidad de escindir e inactivar el ARN mensajero GATA3 en ensayos clínicos de fase IIa. El tratamiento con SB010 compensó significativamente las respuestas asmáticas tardías y tempranas después del agravamiento del alérgeno en pacientes varones con asma alérgica. [39] El factor de transcripción GATA-3 también es un objetivo interesante, de la formulación tópica de DNAzyme SB012, para una nueva estrategia terapéutica en la colitis ulcerosa (CU). La CU es una enfermedad inflamatoria intestinal idiopática definida por inflamaciones crónicas recurrentes del tracto gastrointestinal, y caracterizada por una inflamación mucosa superficial y continua, que afecta predominantemente al intestino grueso. Los pacientes que no responden de manera efectiva a las estrategias actuales de tratamiento de la colitis ulcerosa presentan serios inconvenientes, uno de los cuales puede llevar a una cirugía colorrectal y puede resultar en una calidad de vida seriamente comprometida. Por lo tanto, los pacientes con colitis ulcerosa moderada o severa pueden beneficiarse significativamente de estas nuevas alternativas terapéuticas, de las cuales SB012 se encuentra en ensayos clínicos de fase I. [40] La dermatitis atópica (DA) es un trastorno cutáneo inflamatorio crónico, en el que los pacientes sufren eczema, a menudo prurito severo en la piel afectada, así como complicaciones e infecciones secundarias. La DA surge de una regulación positiva de las respuestas inmunitarias modificadas por Th2, por lo tanto, un nuevo enfoque de DA que utiliza ADNzimas dirigidas a GATA-3 es una opción de tratamiento plausible. La ADNzima tópica SB011 se encuentra actualmente en ensayos clínicos de fase II. [41] La investigación de ADNzimas para el tratamiento del cáncer también está en marcha. El desarrollo de una enzima de ADN 10-23 que pueda bloquear la expresión de IGF-I (factor de crecimiento similar a la insulina I, un factor que contribuye al crecimiento celular normal y a la tumorogénesis) al dirigirse a su ARNm podría ser útil para bloquear la secreción de IGF-I de las células primarias de la tormenta prostática, inhibiendo en última instancia el desarrollo del tumor prostático. Además, con este tratamiento se espera que también se inhiba la metástasis hepática, a través de la inhibición de IGF-I en el hígado (la principal fuente de IGF-I sérico). [15]

Sensores

Las ADNzimas han encontrado un uso práctico en biosensores de metales. [42] [43] Se utilizó un biosensor basado en ADNzimas para iones de plomo para detectar iones de plomo en agua en las escuelas públicas de St. Paul en Minnesota. [44] Además, las ADNzimas se han utilizado en combinación con aptámeros y biorreceptores de ácidos nucleicos para el desarrollo de un bioensayo multiplex. [45]

Síntesis asimétrica

La quiralidad es otra propiedad que puede aprovechar una ADNzima. El ADN se presenta en la naturaleza como una doble hélice dextrógira y, en la síntesis asimétrica, un catalizador quiral es una herramienta valiosa para la síntesis de moléculas quirales a partir de una fuente aquiral. En una aplicación, se preparó un catalizador de ADN artificial uniéndole un ion de cobre a través de un espaciador. [46] El complejo cobre-ADN catalizó una reacción de Diels-Alder en agua entre ciclopentadieno y una aza-chalcona. Se descubrió que los productos de reacción (endo y exo) estaban presentes en un exceso enantiomérico del 50%. Más tarde se descubrió que se podía inducir un exceso enantiomérico del 99% y que tanto la velocidad como la enantioselectividad estaban relacionadas con la secuencia de ADN.

Bioconjugación con la ADNzima hGQ

La ADNzima hemina/G-Quadruplex consiste en ADN formador de G-Quadruplex que puede unirse al cofactor hemina (también conocido como Fe(III)Protoporfirina IX), formando un complejo que puede realizar cierta reacción de oxidación en presencia de peróxido de hidrógeno. [47] Esta ADNzima puede oxidar moléculas pequeñas, como la dopamina y el trifosfato de adenosina, [48] pero también puede usarse para la modificación de péptidos [49] y proteínas [50] [51] uniendo moléculas pequeñas.

Otros usos

Otros usos del ADN en química son la síntesis con plantillas de ADN , la catálisis enantioselectiva, [52] los nanocables de ADN y la computación del ADN . [53]

Véase también

Referencias

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