El ADN monocatenario multicopia (ADNms) es un tipo de ADN satélite extracromosómico que consiste en una molécula de ADN monocatenario unida covalentemente a través de un enlace fosfodiéster 2'-5' a una guanosina interna de una molécula de ARN . La quimera ADN/ARN resultante posee dos tallos-bucles unidos por una rama similar a las ramas que se encuentran en los intermediarios de empalme del ARN . La región codificante del ADNms, llamada " retrón ", también codifica un tipo de transcriptasa inversa , que es esencial para la síntesis del ADNms. [2]
Antes del descubrimiento del msADN en las mixobacterias , [3] [4] un grupo de bacterias que habitan en el suelo , se pensaba que las enzimas conocidas como transcriptasas inversas (RT) existían solo en eucariotas y virus . El descubrimiento condujo a un aumento en la investigación del área. Como resultado, se ha descubierto que el msADN está ampliamente distribuido entre las bacterias, incluidas varias cepas de Escherichia coli y bacterias patógenas. [5] Investigaciones posteriores descubrieron similitudes entre la transcriptasa inversa codificada por el VIH y un marco de lectura abierto (ORF) encontrado en la región codificante del msADN. Las pruebas confirmaron la presencia de actividad de transcriptasa inversa en lisados crudos de cepas que contienen retrones. [6] Aunque se identificó tentativamente un dominio de ARNasa H en el ORF del retron, más tarde se descubrió que la actividad de ARNasa H requerida para la síntesis de msADN en realidad es suministrada por el huésped. [7]
El descubrimiento del msDNA ha dado lugar a preguntas más amplias sobre el origen de la transcriptasa inversa, ya que se han encontrado genes que codifican la transcriptasa inversa (no necesariamente asociados con el msDNA) en procariotas, eucariotas, virus e incluso arqueas . Después de que se descubriera un fragmento de ADN que codifica la producción de msDNA en E. coli , [8] se conjeturó que los bacteriófagos podrían haber sido responsables de la introducción del gen RT en E. coli . [9] Estos descubrimientos sugieren que la transcriptasa inversa jugó un papel en la evolución de los virus a partir de bacterias, con una hipótesis que afirma que, con la ayuda de la transcriptasa inversa, los virus pueden haber surgido como un gen de msDNA separado que adquirió una capa de proteína. Dado que casi todos los genes RT funcionan en la replicación del retrovirus y/o el movimiento de elementos transponibles , es razonable imaginar que los retrones podrían ser elementos genéticos móviles, pero ha habido poca evidencia que respalde tal hipótesis, salvo el hecho observado de que el msADN está ampliamente pero esporádicamente disperso entre las especies bacterianas de una manera que sugiere una transferencia tanto horizontal como vertical. [5] [10] [11] Dado que no se sabe si las secuencias de retrones per se representan elementos móviles, los retrones se definen funcionalmente por su capacidad de producir msADN mientras que evitan deliberadamente la especulación sobre otras posibles actividades.
La función del msDNA sigue siendo desconocida a pesar de que existen muchas copias dentro de las células. Las mutaciones knockout que no expresan msDNA son viables, por lo que la producción de msDNA no es esencial para la vida en condiciones de laboratorio. La sobreexpresión de msDNA es mutagénica, aparentemente como resultado de la titulación de las proteínas reparadoras por los pares de bases desapareados que son típicos de su estructura. [10] Se ha sugerido que el msDNA puede tener algún papel en la patogenicidad o la adaptación a condiciones estresantes. [12] La comparación de secuencias de msDNA de Myxococcus xanthus , Stigmatella aurantiaca , [1] y muchas otras bacterias [5] [12] revela dominios conservados e hipervariables que recuerdan a las secuencias conservadas e hipervariables encontradas en las moléculas de alorreconocimiento. [13] Los principales msDNA de M. xanthus y S. aurantiaca , por ejemplo, comparten una homología de secuencia del 94%, excepto dentro de un dominio de 19 pares de bases que comparte una homología de secuencia de solo el 42%. [1] La presencia de dichos dominios es significativa porque las mixobacterias exhiben comportamientos sociales cooperativos complejos que incluyen enjambre y formación de cuerpos fructíferos, mientras que E. coli y otras bacterias patógenas forman biopelículas que exhiben una mayor resistencia a los antibióticos y detergentes. La sostenibilidad de los ensamblajes sociales que requieren una inversión individual significativa de energía generalmente depende de la evolución de mecanismos de alorreconocimiento que permiten a los grupos distinguir lo propio de lo ajeno. [14]
Se supone que la biosíntesis de msADN sigue una vía única que no se encuentra en ningún otro lugar de la bioquímica del ADN/ARN. Debido a la similitud de la unión de la ramificación 2'-5' con las uniones de la ramificación que se encuentran en los intermediarios de empalme del ARN, en un principio se podría haber esperado que la formación de la ramificación se realizara mediante la ligadura mediada por el espliceosoma o la ribozima . Sin embargo, sorprendentemente, los experimentos en sistemas libres de células que utilizan la transcriptasa inversa retrona purificada indican que la síntesis de ADNc se inicia directamente a partir del grupo 2'-OH del residuo G interno específico del ARN cebador. [15] La RT reconoce estructuras específicas de tallo-bucle en el ARN precursor, lo que hace que la síntesis de msADN por la RT sea altamente específica para su propio retrona. [16] La iniciación de la síntesis de msADN ofrece un desafío fascinante para nuestra comprensión de la síntesis de ADN. Las ADN polimerasas (que incluyen la RT) comparten características estructurales altamente conservadas, lo que significa que sus sitios catalíticos activos varían poco de una especie a otra, o incluso entre las ADN polimerasas que usan ADN como plantilla, en comparación con las ADN polimerasas que usan ARN como plantilla. La región catalítica de la transcriptasa inversa eucariota comprende tres dominios denominados "dedos", "palma" y "pulgar" que sostienen el cebador-plantilla de doble cadena en un agarre de mano derecha con el 3'-OH del cebador enterrado en el sitio activo de la polimerasa, [17] un grupo de residuos ácidos y polares altamente conservados situados en la palma entre lo que serían los dedos índice y medio. En las RT eucariotas, el dominio de la ARNasa H se encuentra en la muñeca debajo de la base del pulgar, pero las RT retrónas carecen de actividad de la ARNasa H. La hendidura de unión del ácido nucleico, que se extiende desde el sitio activo de la polimerasa hasta el sitio activo de la ARNasa H, tiene aproximadamente 60 Å de longitud en las RT eucariotas, lo que corresponde a casi dos vueltas helicoidales. [18] Cuando la RT eucariota extiende un cebador convencional, la doble hélice de ADN/ARN en crecimiento se mueve en espiral a lo largo de la hendidura y, a medida que la doble hélice pasa el dominio H de la ARNasa, el ARN molde se digiere para liberar la cadena naciente de ADNc. Sin embargo, en el caso de la extensión del cebador de ADNms, una larga cadena de ARN permanece unida al 3'-OH del G de cebado. Aunque es posible modelar un complejo de plantilla de cebador-RT que haría que el 2'-OH sea accesible para la reacción de cebado, [16] una mayor extensión de la cadena de ADN presenta un problema: a medida que progresa la síntesis de ADN, la voluminosa cadena de ARN que se extiende desde el 3'-OH necesita de alguna manera descender en espiral por la hendidura de unión sin ser bloqueada por un impedimento estérico . Para superar este problema, la transcriptasa inversa de ADNms claramente requeriría características especiales que no comparten otras RT. [10]