Un enlace isopéptido es un tipo de enlace amida formado entre un grupo carboxilo de un aminoácido y un grupo amino de otro. Un enlace isopéptido es el enlace entre el grupo amino o carboxilo de la cadena lateral de un aminoácido con el grupo α-carboxilo, α-amino o la cadena lateral de otro aminoácido. En un enlace peptídico típico , también conocido como enlace eupeptídico, el enlace amida siempre se forma entre el grupo α-carboxilo de un aminoácido y el grupo α-amino del segundo aminoácido. Los enlaces isopeptídicos son más raros que los enlaces peptídicos normales. [1] Los enlaces isopeptídicos conducen a la ramificación en la secuencia primaria de una proteína. Las proteínas formadas a partir de enlaces peptídicos normales suelen tener una secuencia primaria lineal .
Los enlaces amida, y por tanto los enlaces isopéptidos, se estabilizan mediante resonancia ( deslocalización de electrones ) entre el oxígeno del carbonilo , el carbono del carbonilo y el átomo de nitrógeno . La fuerza de enlace de un enlace isopeptídico es similar a la de un péptido debido al tipo de enlace similar. La fuerza de enlace de un enlace peptídico es de 2,3-3,6 kcal/mol. [2]
Los aminoácidos como la lisina , el ácido glutámico , la glutamina , el ácido aspártico y la asparagina pueden formar enlaces isopeptídicos porque todos contienen un grupo amino o carboxilo en su cadena lateral. Por ejemplo, la formación de un enlace isopéptido entre las cadenas laterales de lisina y glutamina es la siguiente:
El grupo ε-amino de la lisina también puede reaccionar con el grupo α-carboxilo de cualquier otro aminoácido como en la siguiente reacción:
La formación de enlaces isopeptídicos puede ser catalizada por enzimas [3] o ocurrir de forma espontánea . [4] La reacción entre lisina y glutamina, como se muestra arriba, está catalizada por una transglutaminasa . Otro ejemplo de formación de enlaces isopeptídicos catalizada por enzimas es la formación de la molécula de glutatión . El glutatión, un tripéptido , contiene un enlace peptídico normal (entre cisteína y glicina ) y un enlace isopéptido (entre glutamato y cisteína). La formación del enlace isopéptido entre el grupo γ-carboxilo del glutamato y el grupo α-amino de la cisteína está catalizada por la enzima γ-glutamilcisteína sintetasa . [3] El enlace isopéptido se forma en lugar de un enlace eupeptídico porque las peptidasas intracelulares [3] son incapaces de reconocer este enlace y, por lo tanto, no hidrolizan el enlace. Se puede formar un enlace isopéptido espontáneamente como se observa en la maduración de la cápside del bacteriófago HK97 . [5] En este caso, el grupo ε-amino de la lisina reacciona autocatalíticamente con el grupo carboxamida de cadena lateral de la asparagina . [5] La formación espontánea de enlaces isopeptídicos entre lisina y asparagina también ocurre en los pili de bacterias Gram-positivas . [6]
Los enlaces isopeptídicos generados por enzimas tienen dos propósitos biológicos principales: señalización y estructura .
La bioseñal influye en la función de las proteínas, [7] la condensación de la cromatina, [8] y la vida media de las proteínas. [9] Las funciones bioestructurales de los enlaces isopeptídicos incluyen la coagulación sanguínea [10] (para la cicatrización de heridas), el mantenimiento de la matriz extracelular , [11] la vía de la apoptosis , [11] la modificación de los microtúbulos , [12] y la formación de pili patógenos [13] en bacterias. Los enlaces isopeptídicos contribuyen a la patogenicidad de Vibrio cholerae porque el dominio de entrecruzamiento de actina (ACD) forma un enlace intermolecular entre el grupo γ-carboxilo del glutamato y el grupo ε-amino de la lisina en la actina . [14] Este proceso detiene la polimerización de actina en la célula huésped . [14]
Para los enlaces isopeptídicos que unen una proteína a otra con el fin de transducir señales, la literatura está dominada por la ubiquitina y otras proteínas similares. La ubiquitina y sus proteínas relacionadas ( SUMO , Atg8 , Atg12 , etc.) tienden a seguir relativamente la misma vía de ligación de proteínas. [7]
El proceso de ligación de proteínas por ubiquitina y proteínas similares a ubiquitina tiene tres pasos principales. [7] En el paso inicial, la proteína activadora específica (E1 o proteína similar a E1) activa la ubiquitina adenilándola con ATP . [7] Luego, la ubiquitina adenilada se puede transferir a una cisteína conservada utilizando un enlace tioéster que se encuentra entre el grupo carboxilo de la glicina C-terminal de la ubiquitina y el azufre de la cisteína E1. [7] [15] [16] La enzima activadora E1 luego se une y transfiere la ubiquitina al siguiente nivel, la enzima E2 que acepta la proteína y una vez más forma un tioéster con un enlace conservado. El E2 actúa hasta cierto punto como un intermediario que luego se une a la enzima ligasa E3 para el nivel final, lo que conduce a la eventual transferencia de la ubiquitina o proteína relacionada con la ubiquitina a un sitio de lisina en la proteína objetivo, o más comúnmente para la ubiquitina, en la propia ubiquitina para formar cadenas de dicha proteína. [15]
Sin embargo, en el último nivel, también hay una divergencia, ya que dependiendo del tipo de ligasa E3, es posible que en realidad no esté causando la conjugación. Como están las ligasas E3 que contienen dominios HECT, en las que continúan esta "cadena de transferencia" aceptando una vez más la ubiquitina a través de otra cisteína conservada y luego dirigiéndola y transfiriéndola al objetivo deseado. Sin embargo, en el caso de que el dominio de dedo RING contenga enlaces de coordinación con iones de zinc para estabilizar sus estructuras, actúan más para dirigir la reacción. Con esto, se quiere decir que una vez que la ligasa E3 del dedo RING se une con el E2 que contiene la ubiquitina, simplemente actúa como un dispositivo de dirección que dirige al E2 para ligar directamente la proteína objetivo en el sitio de lisina. [15] [17]
Aunque en este caso la ubiquitina representa bien otras proteínas relacionadas con ella, cada proteína obviamente tendrá sus propias molestias, como SUMO, que tiende a ser ligasas con dominio de dedo RING, donde la E3 simplemente actúa como dispositivo de dirección para dirigir la ligadura por parte de la proteína. E2, y en realidad no realiza la reacción en sí, como las ligasas Ubiquitina E3-HECT. [16] Por lo tanto, aunque los mecanismos internos difieren, como la forma en que las proteínas participan en la cadena de transferencia, los aspectos químicos generales, como el uso de tioésteres y ligasas específicas para la focalización, siguen siendo los mismos.
La química enzimática involucrada en la formación de isopéptidos con fines estructurales es diferente del caso de la ubiquitina y las proteínas relacionadas con la ubiquitina. En eso, en lugar de pasos secuenciales que involucran múltiples enzimas para activar, conjugar y apuntar al sustrato. [18] La catálisis la realiza una enzima y el único paso precursor, si lo hay, generalmente es la escisión para activarlo a partir de un zimógeno. Sin embargo, la uniformidad que existe en el caso de la ubiquitina no es así aquí, ya que existen numerosas enzimas diferentes que realizan la reacción de formación del enlace isopeptídico.
El primer caso es el de las sortasas, una familia de enzimas que se encuentra repartida por numerosas bacterias grampositivas. Se ha demostrado que es un importante factor de patogenicidad y virulencia. La reacción general realizada por sortasas implica el uso de su propia marca de "tríada catalítica": es decir, histidina, arginina y cisteína para el mecanismo reactivo. His y Arg actúan para ayudar a crear el entorno reactivo, y Cys una vez más actúa como centro de reacción mediante el uso de un tioéster que ayuda a mantener un grupo carboxilo hasta que la amina de una lisina pueda realizar un ataque nucleofílico para transferir la proteína y formar el enlace isopéptido. Un ion que a veces puede desempeñar un papel importante, aunque indirecto, en la reacción enzimática es el calcio, que está unido por la sortasa. Desempeña un papel importante en mantener la estructura de la enzima en la conformación óptima para la catálisis. Sin embargo, hay casos en los que se ha demostrado que el calcio no es esencial para que se produzca la catálisis. [19]
Otro aspecto que distingue a las sortasas en general es que tienen un objetivo muy específico para su sustrato, ya que las sortasas generalmente tienen dos funciones, la primera es la fusión de proteínas a la pared celular de la bacteria y la segunda es la polimerización de pilina. Para el proceso de localización de proteínas en la pared celular existe un triple requisito: que la proteína contenga un dominio hidrofóbico, una región de cola cargada positivamente y una secuencia específica final utilizada para el reconocimiento. [20] La mejor estudiada de estas señales es la LPXTG, que actúa como el punto de escisión, donde la sortasa ataca entre Thr y Gly, conjugándose con el grupo carboxilo Thr. [19] Luego, el tioéster se resuelve mediante la transferencia del péptido a una amina primaria, y esto generalmente tiene una especificidad muy alta, lo que se ve en el ejemplo de B. cereus donde la enzima sortasa D ayuda a polimerizar la proteína BcpA a través de dos señales de reconocimiento, el LPXTG como punto de escisión y formación de tioéster, y el sitio YPKN que actúa como señal de reconocimiento donde se formará el isopéptido. [21] Si bien los detalles pueden variar entre bacterias, los fundamentos de la química enzimática de la sortasa siguen siendo los mismos.
El siguiente caso es el de las transglutaminasas (TGasas), que actúan principalmente en eucariotas fusionando diferentes proteínas por diversos motivos, como la cicatrización de heridas o la unión de proteínas a membranas lipídicas. [22] [23] Las propias TGasas también contienen su propia 'tríada catalítica' con histidina, aspartato y cisteína. Las funciones de estos residuos son análogas o iguales a las de las sortasas descritas anteriormente, en el sentido de que His y Asp desempeñan un papel de apoyo en la interacción con el residuo objetivo, mientras que Cys forma un tioéster con un grupo carboxilo para un ataque nucleofílico posterior por un primario. amina, en este caso por interés el de lisina. Aunque las similitudes con la sortasa catalíticamente comienzan a terminar ahí, ya que la enzima y la familia dependen del calcio, que desempeña un papel estructural crucial en el mantenimiento de una conformación estricta de la enzima. Las TGasas también tienen una especificidad de sustrato muy diferente, ya que se dirigen específicamente a la Gln media, en la secuencia 'Gln-Gln-Val'. La especificidad general del sustrato, es decir, la proteína específica, se debe a la estructura general de las diferentes TGasas que las dirige al sustrato. [24]
La especificidad se ha observado en las TGasas de modo que diferentes TGasas reaccionarán con diferentes Gln en la misma proteína, lo que significa que las enzimas tienen un objetivo inicial muy específico. [25] También se ha demostrado que tiene cierta especificidad en cuanto a a qué objetivo lisina transfiere la proteína, como en el caso del factor XIII, donde el residuo adyacente a Lys decide si se producirá la reacción. [23] Por lo tanto, si bien las TGasas pueden parecer inicialmente una sortasa eucariota, se mantienen por sí solas como un conjunto separado de enzimas.
Otro caso de enzima conectora de isopéptidos con fines estructurales es el dominio de entrecruzamiento de actina (ACD) de la proteína de la toxina MARTX generada por V. cholerae. Si bien se ha demostrado que el ACD, al realizar la catálisis, utiliza magnesio y ATP para la formación de enlaces cruzados, los detalles específicos del mecanismo son inciertos. Aunque un aspecto interesante del entrecruzamiento formado en este caso es que utiliza un Glu no terminal para ligarse a un Lys no terminal, lo que parece ser poco común en el proceso de formación de un enlace isopéptido. [26] Aunque la química de la ACD aún no se ha resuelto, muestra que la formación de enlaces isopeptídicos no depende simplemente de Asp/Asn para los enlaces isopeptídicos no terminales entre proteínas.
El último caso a analizar es el curioso caso de las modificaciones postraduccionales de la microtubilina (MT). MT contiene una amplia gama de modificaciones postraduccionales; sin embargo, los dos de mayor interés son la poliglutamilación y la poliglicilación. Ambas modificaciones son similares en el sentido de que son tramos repetidos del mismo aminoácido fusionados al grupo carboxilo de la cadena lateral del glutamato en la región c-terminal de la MT. Los mecanismos enzimáticos no están completamente desarrollados ya que no se sabe mucho sobre la enzima poliglicante. En el caso de la poliglutamilación, el mecanismo exacto también se desconoce, pero parece depender del ATP. [27] Aunque nuevamente hay una falta de claridad con respecto a la química enzimática, todavía hay información valiosa sobre la formación de enlaces isopeptídicos utilizando el grupo carboxilo R de Glu junto con el amino N-terminal de los péptidos modificadores.
La formación espontánea de enlaces isopeptídicos se ha aprovechado en el desarrollo de una etiqueta peptídica llamada SpyTag . SpyTag puede reaccionar de forma espontánea e irreversible con su compañero de unión (una proteína denominada SpyCatcher) a través de un enlace isopéptido covalente. [28] Esta herramienta molecular puede tener aplicaciones para la focalización de proteínas in vivo , microscopía fluorescente y unión irreversible para una micromatriz de proteínas . Después de esto, se desarrollaron otros sistemas Tag/Catcher como SnoopTag/SnoopCatcher [29] y SdyTag/SdyCatcher [30] que complementan SpyTag/SpyCatcher.