La centrifugación es un proceso mecánico que implica el uso de la fuerza centrífuga para separar partículas de una solución según su tamaño, forma, densidad, viscosidad del medio y velocidad del rotor. [1] Los componentes más densos de la mezcla migran lejos del eje de la centrífuga , mientras que los componentes menos densos de la mezcla migran hacia el eje. Los químicos y biólogos pueden aumentar la fuerza gravitacional efectiva del tubo de ensayo para que el precipitado (gránulo) viaje rápidamente y completamente al fondo del tubo. El líquido restante que se encuentra por encima del precipitado se llama sobrenadante o supernadante.
Existe una correlación entre el tamaño y la densidad de una partícula y la velocidad con la que la partícula se separa de una mezcla heterogénea, cuando la única fuerza aplicada es la de la gravedad. Cuanto mayor sea el tamaño y la densidad de las partículas, más rápido se separarán de la mezcla. Al aplicar una fuerza gravitacional efectiva mayor a la mezcla, como lo hace una centrífuga, se acelera la separación de las partículas. Esto es ideal en entornos industriales y de laboratorio porque las partículas que se separarían naturalmente durante un largo período de tiempo pueden separarse en mucho menos tiempo. [2]
La velocidad de centrifugación se especifica mediante la velocidad angular, generalmente expresada como revoluciones por minuto (RPM), o la aceleración expresada como g . El factor de conversión entre RPM y g depende del radio del rotor de la centrífuga. La velocidad de sedimentación de las partículas en la centrifugación es una función de su tamaño y forma, la aceleración centrífuga, la fracción de volumen de sólidos presentes, la diferencia de densidad entre la partícula y el líquido y la viscosidad . La aplicación más común es la separación de sólidos de suspensiones altamente concentradas, que se utiliza en el tratamiento de lodos de depuradora para deshidratación donde se produce sedimento menos consistente. [3]
El método de centrifugación tiene una amplia variedad de aplicaciones industriales y de laboratorio; no solo se utiliza este proceso para separar dos sustancias miscibles, sino también para analizar las propiedades hidrodinámicas de las macromoléculas. [4] Es uno de los métodos de investigación más importantes y comúnmente utilizados en bioquímica , biología celular y molecular . En las industrias química y alimentaria, las centrífugas especiales pueden procesar una corriente continua de partículas que se convierten en un líquido separado como el plasma. La centrifugación también es el método más común utilizado para el enriquecimiento de uranio , basándose en la ligera diferencia de masa entre los átomos de U-238 y U-235 en el gas hexafluoruro de uranio . [5]
En una suspensión líquida, muchas partículas o células caerán gradualmente al fondo del recipiente debido a la gravedad ; sin embargo, la cantidad de tiempo que se necesita para tales separaciones no es factible. Otras partículas, que son muy pequeñas, no se pueden aislar en absoluto en solución hasta que se exponen a una alta fuerza centrífuga . A medida que la suspensión gira a una cierta velocidad o revoluciones por minuto (RPM), la fuerza centrífuga permite que las partículas se alejen radialmente del eje de rotación. La fórmula general para calcular las revoluciones por minuto (RPM) de una centrífuga es:
,
donde g representa la fuerza centrífuga relativa (RCF) y r el radio desde el centro del rotor hasta un punto en la muestra. [6]
Sin embargo, dependiendo del modelo de centrífuga utilizado, el ángulo respectivo del rotor y el radio pueden variar, por lo que la fórmula se modifica. Por ejemplo, el rotor Sorvall #SS-34 tiene un radio máximo de 10,8 cm, por lo que la fórmula se convierte en , que puede simplificarse aún más a . [6]
En comparación con la gravedad, la fuerza de las partículas se denomina «fuerza centrífuga relativa» (RCF). Es la fuerza perpendicular ejercida sobre el contenido del rotor como resultado de la rotación, siempre relativa a la gravedad de la Tierra, que mide la fuerza de rotores de diferentes tipos y tamaños. Por ejemplo, la RCF de 1000 xg significa que la fuerza centrífuga es 1000 veces más fuerte que la fuerza gravitatoria de la Tierra. La RCF depende de la velocidad de rotación en rpm y de la distancia de las partículas al centro de rotación. La fórmula más común utilizada para calcular la RCF es: [7]
,
donde es una constante; r es el radio, expresado en centímetros , entre el eje de rotación y un punto de la muestra; y rpm es la velocidad en revoluciones por minuto. [7]
Históricamente, muchas separaciones se han llevado a cabo a una velocidad de 3000 rpm; una guía aproximada de la fuerza "g" ejercida a esta velocidad es multiplicar el radio de centrifugación por un factor de 10, por lo que un radio de 160 mm da aproximadamente 1600 x g. [8] Este es un enfoque bastante arbitrario, ya que la RCF aplicada depende linealmente del radio, por lo que un radio 10% mayor significa que se aplica una RCF 10% mayor a la misma velocidad. Aproximadamente, la fórmula anterior se puede simplificar a , con un error de solo 0,62%.
Las microcentrífugas son modelos de sobremesa especialmente diseñados con rotores ligeros de pequeño volumen capaces de una aceleración muy rápida de hasta aproximadamente 17.000 rpm. Son dispositivos ligeros que se utilizan principalmente para la centrifugación de corta duración de muestras de hasta alrededor de 0,2–2,0 ml. Sin embargo, debido a su pequeña escala, son fácilmente transportables y, si es necesario, pueden funcionar en una cámara frigorífica. [9] Pueden estar refrigeradas o no. La microcentrífuga se utiliza normalmente en laboratorios de investigación donde se requiere que pequeñas muestras de moléculas biológicas, células o núcleos se sometan a una RCF alta durante intervalos de tiempo relativamente cortos. [9] Las microcentrífugas diseñadas para un funcionamiento a alta velocidad pueden alcanzar hasta 35.000 rpm, lo que da una RCF de hasta 30.000 × g, y se denominan microcentrífugas de alta velocidad. [10]
Las centrífugas de baja velocidad se utilizan para recolectar precipitados químicos, células intactas (animales, vegetales y algunos microorganismos), núcleos, cloroplastos, mitocondrias grandes y fragmentos más grandes de membrana plasmática. En estas centrífugas también se utilizan gradientes de densidad para purificar las células. Los rotores de cubeta oscilante tienden a usarse muy ampliamente debido a la enorme flexibilidad del tamaño de la muestra mediante el uso de adaptadores. [9] Estas máquinas tienen velocidades máximas de rotor de menos de 10 000 rpm y varían desde centrífugas pequeñas de sobremesa hasta centrífugas grandes de suelo. [11]
Las centrífugas de alta velocidad se utilizan normalmente para recolectar microorganismos, virus , mitocondrias , lisosomas , peroxisomas y membranas tubulares intactas del aparato de Golgi. La mayoría de las tareas de peletización simples se llevan a cabo en rotores de ángulo fijo. Algunos trabajos de gradiente de densidad para purificar células y orgánulos se pueden llevar a cabo en rotores de cangilones oscilantes o, en el caso de los gradientes de Percoll , en rotores de ángulo fijo. [9] Las centrífugas de alta velocidad o supervelocidad pueden manejar volúmenes de muestra más grandes, desde unas pocas decenas de mililitros hasta varios litros. Además, las centrífugas más grandes también pueden alcanzar velocidades angulares más altas (alrededor de 30.000 rpm). Los rotores pueden venir con diferentes adaptadores para sujetar varios tamaños de tubos de ensayo , botellas o placas de microtitulación .
La ultracentrifugación hace uso de una alta fuerza centrífuga para estudiar las propiedades de las partículas biológicas a velocidades excepcionalmente altas. Las ultracentrífugas actuales pueden girar hasta 150.000 rpm (equivalente a 1.000.000 xg). [12] Se utilizan para recolectar todas las vesículas de membrana derivadas de la membrana plasmática, el retículo endoplasmático (RE) y la membrana de Golgi , endosomas , ribosomas , subunidades ribosómicas, plásmidos , ADN , ARN y proteínas en rotores de ángulo fijo. [9] En comparación con las microcentrífugas o las centrífugas de alta velocidad, las ultracentrífugas pueden aislar partículas mucho más pequeñas y, además, mientras que las microcentrífugas y las supercentrífugas separan las partículas en lotes (se deben manipular volúmenes limitados de muestras manualmente en tubos de ensayo o botellas), las ultracentrífugas pueden separar moléculas en lotes o sistemas de flujo continuo. [ cita requerida ]
La ultracentrifugación se utiliza para la separación de macromoléculas/estudios cinéticos de unión de ligandos, la separación de varias fracciones de lipoproteínas del plasma y la desprotonización de fluidos fisiológicos para el análisis de aminoácidos. [1]
Son las centrífugas más utilizadas para la purificación por gradiente de densidad de todas las partículas, excepto las células, y, si bien tradicionalmente se han utilizado cestillos basculantes para este fin, también se utilizan rotores de ángulo fijo y rotores verticales, en particular para gradientes autogenerados, y pueden mejorar en gran medida la eficiencia de la separación. Existen dos tipos de ultracentrífugas: la analítica y la preparativa.
La ultracentrifugación analítica (AUC) se puede utilizar para determinar las propiedades de las macromoléculas, como la forma, la masa, la composición y la conformación. Es una técnica de análisis biomolecular de uso común que se utiliza para evaluar la pureza de las muestras, caracterizar los mecanismos de ensamblaje y desensamblaje de los complejos biomoleculares , determinar las estequiometrías de las subunidades , identificar y caracterizar los cambios conformacionales macromoleculares y calcular las constantes de equilibrio y los parámetros termodinámicos para los sistemas autoasociados y heteroasociados. [13] Las ultracentrífugas analíticas incorporan un sistema de detección óptica basado en luz visible / ultravioleta de barrido para el seguimiento en tiempo real del progreso de la muestra durante un centrifugado. [14]
Las muestras se centrifugan con una solución de alta densidad, como sacarosa , cloruro de cesio o iodixanol . La solución de alta densidad puede tener una concentración uniforme en todo el tubo de ensayo ("cojín") o una concentración variable (" gradiente "). Las propiedades moleculares se pueden modelar mediante el análisis de la velocidad de sedimentación o el análisis del equilibrio de sedimentación. Durante la ejecución, las partículas o moléculas migrarán a través del tubo de ensayo a diferentes velocidades según sus propiedades físicas y las propiedades de la solución, y eventualmente formarán un pellet en el fondo del tubo o bandas a diferentes alturas.
Las ultracentrífugas preparativas se utilizan a menudo para separar partículas según sus densidades, aislar y/o recolectar partículas más densas para su recogida en el pellet y clarificar suspensiones que contienen partículas. A veces, los investigadores también utilizan ultracentrífugas preparativas si necesitan la flexibilidad de cambiar el tipo de rotor en el instrumento. Las ultracentrífugas preparativas pueden estar equipadas con una amplia gama de diferentes tipos de rotores, que pueden hacer girar muestras de diferentes cantidades, en diferentes ángulos y a diferentes velocidades. [14]
En la investigación biológica, el fraccionamiento celular generalmente incluye el aislamiento de los componentes celulares, conservando las funciones individuales de cada componente. Generalmente, la muestra celular se almacena en una suspensión que es:
La centrifugación es el primer paso en la mayoría de los fraccionamientos . Mediante la centrifugación a baja velocidad, se pueden eliminar los restos celulares, dejando un sobrenadante que preserva el contenido de la célula. La centrifugación repetida a velocidades progresivamente más altas fraccionará los homogenizados de células en sus componentes. En general, cuanto menor sea el componente subcelular, mayor será la fuerza centrífuga necesaria para sedimentarlo. [15] La fracción soluble de cualquier lisado puede luego separarse aún más en sus constituyentes utilizando una variedad de métodos.
La centrifugación diferencial es el método más simple de fraccionamiento por centrifugación, [9] comúnmente utilizada para separar orgánulos y membranas que se encuentran en las células. Los orgánulos generalmente difieren entre sí en densidad y tamaño, lo que hace posible el uso de la centrifugación diferencial, y la centrifugación en general. Los orgánulos pueden luego identificarse mediante pruebas de indicadores que son exclusivos de los orgánulos específicos. [6] La aplicación más utilizada de esta técnica es producir fracciones subcelulares crudas a partir de un homogeneizado de tejido como el del hígado de rata. [9] Las partículas de diferentes densidades o tamaños en una suspensión se sedimentan a diferentes velocidades, y las partículas más grandes y densas sedimentan más rápido. Estas velocidades de sedimentación se pueden aumentar mediante el uso de la fuerza centrífuga. [16]
Una suspensión de células se somete a una serie de ciclos de fuerza centrífuga creciente para producir una serie de pellets que comprenden células con una velocidad de sedimentación decreciente. El homogeneizado incluye núcleos, mitocondrias, lisosomas, peroxisomas, láminas de membrana plasmática y una amplia gama de vesículas derivadas de varios compartimentos de membrana intracelular y también de la membrana plasmática, típicamente en un medio tamponado. [9]
Se sabe que la centrifugación en gradiente de densidad es uno de los métodos más eficientes para separar partículas suspendidas y se utiliza tanto como técnica de separación como método para medir la densidad de partículas o moléculas en una mezcla. [17]
Se utiliza para separar partículas en función de su tamaño, forma y densidad mediante un medio de densidades graduadas. Durante una centrifugación relativamente corta o lenta, las partículas se separan por tamaño, y las partículas más grandes sedimentan más lejos que las más pequeñas. Durante una centrifugación larga o rápida, las partículas viajan a lugares en el gradiente donde la densidad del medio es la misma que la densidad de la partícula; (ρp – ρm) → 0. Por lo tanto, una partícula pequeña y densa inicialmente sedimenta con menor facilidad que una partícula grande y de baja densidad. Las partículas grandes alcanzan su posición de densidad de equilibrio antes, mientras que las partículas pequeñas migran lentamente a través de la zona de partículas grandes y, en última instancia, adoptan una posición de equilibrio más profunda en el gradiente. [18]
Un tubo, después de ser centrifugado por este método, tiene partículas ordenadas por densidad en función de la altura. El objeto o partícula de interés residirá en la posición dentro del tubo correspondiente a su densidad. [19] Sin embargo, todavía es posible que se produzcan algunas sedimentaciones no ideales al utilizar este método. El primer problema potencial es la agregación no deseada de partículas, pero esto puede ocurrir en cualquier centrifugación. La segunda posibilidad se produce cuando sedimentan gotitas de solución que contienen partículas. Esto es más probable que ocurra cuando se trabaja con una solución que tiene una capa de suspensión flotando sobre un líquido denso, que de hecho tiene poco o ningún gradiente de densidad. [17]
Una centrífuga se puede utilizar para aislar pequeñas cantidades de sólidos retenidos en suspensión de líquidos, como en la separación de polvo de tiza del agua. En la investigación biológica, se puede utilizar en la purificación de células de mamíferos, fraccionamiento de orgánulos subcelulares, fraccionamiento de vesículas de membrana, fraccionamiento de macromoléculas y complejos macromoleculares, etc. [9] La centrifugación se utiliza de muchas formas diferentes en la industria alimentaria . Por ejemplo, en la industria láctea, se utiliza típicamente en la clarificación y desnatado de la leche , extracción de nata, producción y recuperación de caseína , producción de queso , eliminación de contaminantes bacterianos, etc. Esta técnica de procesamiento también se utiliza en la producción de bebidas, zumos, café, té, cerveza, vino , leche de soja , procesamiento/recuperación de aceite y grasa, manteca de cacao , producción de azúcar, etc. [20] También se utiliza en la clarificación y estabilización del vino .
En los laboratorios forenses y de investigación, se puede utilizar en la separación de componentes de orina y sangre . También ayuda en la separación de proteínas utilizando técnicas de purificación como la salazón , por ejemplo, la precipitación con sulfato de amonio. [6] La centrifugación también es una técnica importante en el tratamiento de residuos , siendo uno de los procesos más comunes utilizados para la deshidratación de lodos . [21] Este proceso también juega un papel en la separación ciclónica , donde las partículas se separan de un flujo de aire sin el uso de filtros . En un colector ciclónico, el aire se mueve en un camino helicoidal. Las partículas con alta inercia se separan por la fuerza centrífuga, mientras que las partículas más pequeñas continúan con el flujo de aire. [22]
Las centrífugas también se han utilizado en pequeña medida para aislar compuestos más ligeros que el agua, como el petróleo. En tales situaciones, la descarga acuosa se obtiene en la salida opuesta de la cual los sólidos con una gravedad específica mayor que uno son las sustancias objetivo para la separación. [23]
En 1923, Theodor Svedberg y su alumno H. Rinde habían analizado con éxito los soles de grano grande en términos de su sedimentación gravitacional. [24] Los soles consisten en una sustancia distribuida uniformemente en otra sustancia, también conocida como coloide . [25] Sin embargo, los soles de grano más pequeño, como los que contienen oro, no se pudieron analizar. [24] Para investigar este problema, Svedberg desarrolló una centrífuga analítica, equipada con un sistema de absorción fotográfica, que ejercería un efecto centrífugo mucho mayor. [24] Además, desarrolló la teoría necesaria para medir el peso molecular. [25] Durante este tiempo, la atención de Svedberg pasó del oro a las proteínas. [24]
En 1900, se aceptaba en general que las proteínas estaban compuestas de aminoácidos; sin embargo, todavía se debatía si las proteínas eran coloides o macromoléculas . [26] Una proteína que se estaba investigando en ese momento era la hemoglobina . Se determinó que tenía 712 átomos de carbono, 1130 de hidrógeno, 243 de oxígeno, dos átomos de azufre y al menos un átomo de hierro. Esto le dio a la hemoglobina un peso resultante de aproximadamente 16 000 dalton (Da), pero no se sabía con certeza si este valor era un múltiplo de uno o de cuatro (dependiendo del número de átomos de hierro presentes). [27]
A través de una serie de experimentos que utilizan la técnica de equilibrio de sedimentación , se hicieron dos observaciones importantes: la hemoglobina tiene un peso molecular de 68.000 Da, lo que sugiere que hay cuatro átomos de hierro presentes en lugar de uno, y que, sin importar de dónde se aisló la hemoglobina, tenía exactamente el mismo peso molecular. [24] [25] Cómo se pudo encontrar de manera constante algo de una masa molecular tan grande, independientemente de dónde se muestreó en el cuerpo, no tenía precedentes y favoreció la idea de que las proteínas son macromoléculas en lugar de coloides. [26] Para investigar este fenómeno, se necesitaba una centrífuga con velocidades aún mayores, y así se creó la ultracentrífuga para aplicar la teoría de la sedimentación-difusión. [24] Se determinó la misma masa molecular, y la presencia de un límite de expansión sugirió que era una sola partícula compacta. [24] La aplicación posterior de la centrifugación mostró que, en diferentes condiciones, las partículas homogéneas grandes se podían descomponer en subunidades discretas. [24] El desarrollo de la centrifugación supuso un gran avance en la ciencia experimental de las proteínas.
En 1937, Linderstorm-Lang descubrió que los tubos de gradiente de densidad podían utilizarse para las mediciones de densidad. Lo descubrió cuando trabajaba con el virus del enanismo amarillo de la patata. [17] Este método también se utilizó en el famoso experimento de Meselson y Stahl en el que demostraron que la replicación del ADN es semiconservativa utilizando diferentes isótopos de nitrógeno. Utilizaron la centrifugación en gradiente de densidad para determinar qué isótopo o isótopos de nitrógeno estaban presentes en el ADN después de los ciclos de replicación. [19]
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