En bioquímica y biología celular , la centrifugación diferencial (también conocida como centrifugación de velocidad diferencial ) es un procedimiento común utilizado para separar orgánulos y otras partículas subcelulares en función de su velocidad de sedimentación . Aunque se aplica a menudo en análisis biológicos, la centrifugación diferencial es una técnica general que también es adecuada para la purificación bruta de partículas suspendidas no vivas (por ejemplo, nanopartículas , partículas coloidales , virus ). En un caso típico en el que se utiliza la centrifugación diferencial para analizar fenómenos biológicos celulares (por ejemplo, distribución de orgánulos), primero se lisa una muestra de tejido para romper las membranas celulares y liberar los orgánulos y el citosol . Luego, el lisado se somete a centrifugaciones repetidas , donde las partículas que sedimentan lo suficientemente rápido a una fuerza centrífuga determinada durante un tiempo determinado forman una "gránulo" compacta en el fondo del tubo de centrifugación. [1]
Después de cada centrifugación, el sobrenadante (solución no granulada) se retira del tubo y se vuelve a centrifugar con una fuerza y/o tiempo centrífugo aumentado. La centrifugación diferencial es adecuada para separaciones de crudo en función de la velocidad de sedimentación, pero se pueden realizar purificaciones de grano más fino en función de la densidad mediante una centrifugación en gradiente de densidad en equilibrio . [2] Así, el método de centrifugación diferencial consiste en la sedimentación sucesiva de partículas del sobrenadante anterior, utilizando fuerzas de centrifugación cada vez mayores. [3] Los orgánulos celulares separados por centrifugación diferencial mantienen un grado relativamente alto de funcionamiento normal, siempre que no estén sujetos a condiciones desnaturalizantes durante el aislamiento. [4] [5]
En un fluido viscoso, la velocidad de sedimentación de una determinada partícula suspendida (siempre que la partícula sea más densa que el fluido) es en gran medida función de los siguientes factores:
Las partículas más grandes se sedimentan más rápidamente y con fuerzas centrífugas más bajas. Si una partícula es menos densa que el fluido (por ejemplo, grasas en el agua), la partícula no sedimentará, sino que flotará, independientemente de la intensidad de la fuerza g experimentada por la partícula. La fuerza centrífuga separa los componentes no sólo en función de la densidad, sino también del tamaño y la forma de las partículas. Por el contrario, una centrifugación en gradiente de densidad de equilibrio más especializada produce un perfil de separación que depende únicamente de la densidad de las partículas y, por lo tanto, es adecuada para separaciones de grano más fino.
La alta fuerza g hace que la sedimentación de partículas pequeñas sea mucho más rápida que la difusión browniana , incluso para partículas muy pequeñas (a nanoescala). Cuando se utiliza una centrífuga, se debe modificar la ley de Stokes para tener en cuenta la variación de la fuerza g con la distancia desde el centro de rotación. [6]
dónde
La centrifugación diferencial se puede utilizar con partículas intactas (por ejemplo, células biológicas, micropartículas, nanopartículas) o para separar los componentes de una partícula determinada. [7] Usando el ejemplo de una separación de orgánulos eucariotas de células intactas, la célula primero debe ser lisada y homogeneizada (idealmente mediante una técnica suave, como la homogeneización Dounce ; las técnicas más duras o la homogeneización excesiva conducirán a una proporción más baja de orgánulos intactos). ). Una vez obtenido el extracto crudo de orgánulos, se puede someter a diferentes velocidades de centrifugación para separar los orgánulos:
La muestra lisada ahora está lista para su centrifugación en una ultracentrífuga . Una ultracentrífuga consta de una cámara refrigerada de baja presión que contiene un rotor impulsado por un motor eléctrico capaz de girar a alta velocidad. Las muestras se colocan en tubos dentro del rotor o unidos a él. La velocidad de rotación puede alcanzar hasta 100.000 rpm para el modelo de piso, 150.000 rpm para el modelo de mesa (Beckman Optima Max-XP o Sorvall MTX150 o himac CS150NX), creando fuerzas de velocidad centrífuga de 800.000 ga 1.000.000 g. Esta fuerza provoca la sedimentación de macromoléculas e incluso puede provocar distribuciones no uniformes de moléculas pequeñas. [8]
Dado que diferentes fragmentos de una célula tienen diferentes tamaños y densidades, cada fragmento se asentará en un gránulo con diferentes fuerzas centrífugas mínimas. Por lo tanto, la separación de la muestra en diferentes capas se puede realizar centrifugando primero el lisado original bajo fuerzas débiles, retirando el sedimento y luego exponiendo los sobrenadantes posteriores a campos centrífugos secuencialmente mayores. Cada vez, una porción de diferente densidad se sedimenta en el fondo del recipiente y se extrae, y la aplicación repetida produce una fila de capas que incluye diferentes partes de la muestra original. Se pueden tomar medidas adicionales para refinar aún más cada uno de los gránulos obtenidos.
La sedimentación depende de la masa, la forma y el volumen específico parcial de una macromolécula, así como de la densidad del disolvente, el tamaño del rotor y la velocidad de rotación. La velocidad de sedimentación se puede controlar durante el experimento para calcular el peso molecular . Se pueden calcular los valores del coeficiente de sedimentación (S). Valores grandes de S (velocidad de sedimentación más rápida) corresponden a un peso molecular mayor. Las partículas densas se sedimentan más rápidamente. Las proteínas alargadas tienen coeficientes de fricción más grandes y sedimentan más lentamente para garantizar la precisión. [9]
La diferencia entre las técnicas de centrifugación diferencial y de gradiente de densidad es que el último método utiliza soluciones de diferentes densidades (por ejemplo, sacarosa , Ficoll , Percoll ) o geles a través de los cuales pasa la muestra. Esto separa la muestra en capas por densidad relativa, basándose en el principio de que las moléculas se asientan bajo una fuerza centrífuga hasta alcanzar un medio con la misma densidad que la suya. [10] El grado de separación o número de capas depende de la solución o gel. La centrifugación diferencial, por otro lado, no utiliza un gradiente de densidad y la centrifugación se realiza a velocidades crecientes. Las diferentes velocidades de centrifugación a menudo crean una separación en no más de dos fracciones, por lo que el sobrenadante se puede separar aún más en pasos de centrifugación adicionales. Para ello, en cada paso se debe aumentar la velocidad de centrifugación hasta que se separen las partículas deseadas. Por el contrario, la centrifugación en gradiente de densidad se realiza normalmente con una sola velocidad de centrifugación. [11]
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