En biología molecular , el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción ( RFLP ) es una técnica que explota las variaciones en secuencias de ADN homólogas , conocidas como polimorfismos , poblaciones o especies, o para señalar las ubicaciones de los genes dentro de una secuencia. El término puede referirse a un polimorfismo en sí mismo, tal como se detecta a través de las diferentes ubicaciones de los sitios de enzimas de restricción , o a una técnica de laboratorio relacionada mediante la cual se pueden ilustrar tales diferencias. En el análisis RFLP , una muestra de ADN se digiere en fragmentos por una o más enzimas de restricción , y los fragmentos de restricción resultantes luego se separan por electroforesis en gel según su tamaño.
El análisis RFLP está ahora en gran medida obsoleto debido a la aparición de tecnologías de secuenciación de ADN de bajo costo , pero fue la primera técnica de perfil de ADN lo suficientemente económica como para tener una aplicación generalizada. El análisis RFLP fue una herramienta temprana importante en el mapeo del genoma , la localización de genes para trastornos genéticos , la determinación del riesgo de enfermedades y las pruebas de paternidad .
La técnica básica para la detección de RFLP implica fragmentar una muestra de ADN con la aplicación de una enzima de restricción , que puede escindir selectivamente una molécula de ADN dondequiera que se reconozca una secuencia corta y específica en un proceso conocido como digestión por restricción . Los fragmentos de ADN producidos por la digestión se separan luego por longitud a través de un proceso conocido como electroforesis en gel de agarosa y se transfieren a una membrana mediante el procedimiento Southern blot . La hibridación de la membrana con una sonda de ADN marcada determina luego la longitud de los fragmentos que son complementarios a la sonda. Se dice que un polimorfismo de longitud de fragmento de restricción ocurre cuando la longitud de un fragmento detectado varía entre individuos, lo que indica homologías de secuencia no idénticas. Cada longitud de fragmento se considera un alelo , ya sea que contenga realmente una región codificante o no, y se puede utilizar en análisis genéticos posteriores.
Existen dos mecanismos comunes por los cuales el tamaño de un fragmento de restricción particular puede variar. En el primer esquema, una sonda de ADN detecta un pequeño segmento del genoma (línea más gruesa). En el alelo A , una enzima de restricción corta el genoma en tres sitios cercanos (triángulos), pero la sonda solo detectará el fragmento más a la derecha. En el alelo a , se perdió el sitio de restricción 2 por una mutación , por lo que la sonda ahora detecta el fragmento fusionado más grande que va desde los sitios 1 a 3. El segundo diagrama muestra cómo se vería esta variación del tamaño de los fragmentos en un Southern blot, y cómo cada alelo (dos por individuo) podría heredarse en los miembros de una familia.
En el tercer esquema, la sonda y la enzima de restricción se eligen para detectar una región del genoma que incluye un segmento de repetición en tándem de número variable (VNTR) (recuadros en el diagrama esquemático). En el alelo c , hay cinco repeticiones en el VNTR, y la sonda detecta un fragmento más largo entre los dos sitios de restricción. En el alelo d , solo hay dos repeticiones en el VNTR, por lo que la sonda detecta un fragmento más corto entre los mismos dos sitios de restricción. Otros procesos genéticos, como inserciones , deleciones , translocaciones e inversiones , también pueden conducir a polimorfismos. Las pruebas RFLP requieren muestras de ADN mucho más grandes que las pruebas de repetición en tándem corta (STR).
El análisis de la variación RFLP en los genomas era antiguamente una herramienta vital en el mapeo genómico y el análisis de enfermedades genéticas. Si los investigadores intentaban determinar inicialmente la ubicación cromosómica de un gen de una enfermedad en particular, analizaban el ADN de los miembros de una familia afectada por la enfermedad y buscaban alelos RFLP que mostraran un patrón de herencia similar al de la enfermedad (ver ligamiento genético ). Una vez localizado un gen de la enfermedad, el análisis RFLP de otras familias podía revelar quién corría riesgo de padecer la enfermedad o quién era probable que fuera portador de los genes mutantes. La prueba RFLP se utiliza en la identificación y diferenciación de organismos mediante el análisis de patrones únicos en el genoma. También se utiliza en la identificación de la tasa de recombinación en los loci entre los sitios de restricción.
El análisis RFLP también fue la base de los primeros métodos de huella genética , útiles en la identificación de muestras recuperadas de escenas de crímenes , en la determinación de la paternidad y en la caracterización de la diversidad genética o patrones de reproducción en poblaciones animales.
Sin embargo, la técnica de análisis RFLP es lenta y engorrosa. Requiere una gran cantidad de ADN de muestra, y el proceso combinado de etiquetado de la sonda, fragmentación del ADN, electroforesis, transferencia, hibridación, lavado y autorradiografía puede tardar hasta un mes en completarse. En 1985 se informó de una versión limitada del método RFLP que utilizaba sondas de oligonucleótidos. [1] Los resultados del Proyecto Genoma Humano han reemplazado en gran medida la necesidad de mapeo RFLP, y la identificación de muchos polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en ese proyecto (así como la identificación directa de muchos genes y mutaciones de enfermedades) ha reemplazado la necesidad de análisis de ligamiento de enfermedades RFLP (véase genotipado de SNP ). El análisis de alelos VNTR continúa, pero ahora se realiza habitualmente mediante métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Por ejemplo, los protocolos estándar para la huella genética del ADN implican el análisis de PCR de paneles de más de una docena de VNTR.
El RFLP todavía se utiliza en la selección asistida por marcadores. El polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal (TRFLP o, a veces, T-RFLP) es una técnica desarrollada inicialmente para caracterizar comunidades bacterianas en muestras de especies mixtas. La técnica también se ha aplicado a otros grupos, incluidos los hongos del suelo. El TRFLP funciona mediante la amplificación por PCR del ADN utilizando pares de cebadores que se han marcado con marcadores fluorescentes. Luego, los productos de PCR se digieren utilizando enzimas RFLP y los patrones resultantes se visualizan utilizando un secuenciador de ADN. Los resultados se analizan simplemente contando y comparando bandas o picos en el perfil TRFLP, o haciendo coincidir las bandas de una o más ejecuciones TRFLP con una base de datos de especies conocidas. Se han desarrollado varias herramientas de software diferentes para automatizar el proceso de coincidencia de bandas, comparación y creación de bases de datos de perfiles TRFLP. [2]
La técnica es similar en algunos aspectos a la electroforesis en gel de gradiente de temperatura o de gradiente desnaturalizante (TGGE y DGGE).
Los cambios de secuencia directamente relacionados con un RFLP también se pueden analizar más rápidamente mediante PCR. La amplificación se puede dirigir a través del sitio de restricción alterado y los productos se pueden digerir con la enzima de restricción. Este método se ha denominado secuencia polimórfica amplificada escindida (CAPS). Alternativamente, el segmento amplificado se puede analizar mediante sondas de oligonucleótidos específicos de alelo (ASO), un proceso que a menudo se puede realizar mediante un simple dot blot .