Las moléculas de ADN recombinante ( ADNr ) son moléculas de ADN formadas mediante métodos de laboratorio de recombinación genética (como la clonación molecular ) que reúnen material genético de múltiples fuentes, creando secuencias que de otra manera no se encontrarían en el genoma .
El ADN recombinante es el nombre general que se le da a un fragmento de ADN que se ha creado mediante la combinación de dos o más fragmentos de diferentes fuentes. El ADN recombinante es posible porque las moléculas de ADN de todos los organismos comparten la misma estructura química, diferenciándose solo en la secuencia de nucleótidos . Las moléculas de ADN recombinante a veces se denominan ADN quimérico porque pueden estar hechas de material de dos especies diferentes, como la mítica quimera . La tecnología del ADN recombinante utiliza secuencias palindrómicas y conduce a la producción de extremos pegajosos y romos .
Las secuencias de ADN utilizadas en la construcción de moléculas de ADN recombinante pueden proceder de cualquier especie . Por ejemplo, el ADN vegetal se puede unir al ADN bacteriano, o el ADN humano se puede unir al ADN fúngico. Además, mediante la síntesis química del ADN se pueden crear secuencias de ADN que no existen en ningún lugar de la naturaleza e incorporarlas a moléculas de ADN recombinante. Mediante la tecnología del ADN recombinante y el ADN sintético, se puede crear cualquier secuencia de ADN e introducirla en organismos vivos.
Las proteínas que pueden resultar de la expresión de ADN recombinante dentro de células vivas se denominan proteínas recombinantes . Cuando el ADN recombinante que codifica una proteína se introduce en un organismo huésped, la proteína recombinante no se produce necesariamente. [1] La expresión de proteínas extrañas requiere el uso de vectores de expresión especializados y, a menudo, necesita una reestructuración significativa mediante secuencias codificantes extrañas. [2]
El ADN recombinante se diferencia de la recombinación genética en que el primero es el resultado de métodos artificiales, mientras que la segunda es un proceso biológico normal que da lugar a la remezcla de secuencias de ADN existentes en prácticamente todos los organismos.
La clonación molecular es el proceso de laboratorio que se utiliza para producir ADN recombinante. [3] [4] [5] [6] Es uno de los dos métodos más utilizados, junto con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que se utiliza para dirigir la replicación de cualquier secuencia de ADN específica elegida por el experimentador. Hay dos diferencias fundamentales entre los métodos. Una es que la clonación molecular implica la replicación del ADN dentro de una célula viva, mientras que la PCR replica el ADN en el tubo de ensayo, libre de células vivas. La otra diferencia es que la clonación implica cortar y pegar secuencias de ADN, mientras que la PCR amplifica copiando una secuencia existente.
La formación de ADN recombinante requiere un vector de clonación , una molécula de ADN que se replica dentro de una célula viva. Los vectores generalmente se derivan de plásmidos o virus y representan segmentos relativamente pequeños de ADN que contienen señales genéticas necesarias para la replicación, así como elementos adicionales para facilitar la inserción de ADN extraño, la identificación de células que contienen ADN recombinante y, cuando sea apropiado, la expresión del ADN extraño. La elección del vector para la clonación molecular depende de la elección del organismo huésped, el tamaño del ADN que se va a clonar y si se va a expresar el ADN extraño y cómo. [7] Los segmentos de ADN se pueden combinar utilizando una variedad de métodos, como la clonación con enzimas de restricción/ligasa o el ensamblaje de Gibson . [ cita requerida ]
En los protocolos de clonación estándar, la clonación de cualquier fragmento de ADN implica esencialmente siete pasos: (1) Elección del organismo huésped y del vector de clonación, (2) Preparación del ADN del vector, (3) Preparación del ADN que se va a clonar, (4) Creación de ADN recombinante, (5) Introducción de ADN recombinante en el organismo huésped, (6) Selección de organismos que contienen ADN recombinante, y (7) Selección de clones con insertos de ADN y propiedades biológicas deseadas. [6] Estos pasos se describen con cierto detalle en un artículo relacionado ( clonación molecular ).
La expresión del ADN requiere la transfección de células hospedadoras adecuadas. Normalmente, se utilizan células bacterianas, de levadura, de insectos o de mamíferos (como las células de riñón embrionario humano o las células CHO ). [8]
Después del trasplante en el organismo huésped, el ADN extraño contenido dentro del constructo de ADN recombinante puede o no expresarse . Es decir, el ADN puede simplemente replicarse sin expresión, o puede transcribirse y traducirse y se produce una proteína recombinante. En términos generales, la expresión de un gen extraño requiere la reestructuración del gen para incluir secuencias que se requieren para producir una molécula de ARNm que pueda ser utilizada por el aparato de traducción del huésped (por ejemplo, promotor , señal de inicio de la traducción y terminador de la transcripción ). [9] Se pueden realizar cambios específicos en el organismo huésped para mejorar la expresión del gen ectópico. Además, también pueden ser necesarios cambios en las secuencias codificantes para optimizar la traducción, hacer que la proteína sea soluble, dirigir la proteína recombinante a la ubicación celular o extracelular adecuada y estabilizar la proteína frente a la degradación. [10] [11] [12]
En la mayoría de los casos, los organismos que contienen ADN recombinante tienen fenotipos aparentemente normales . Es decir, su apariencia, comportamiento y metabolismo no suelen variar, y la única forma de demostrar la presencia de secuencias recombinantes es examinar el ADN mismo, generalmente mediante una prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). [13] Existen excepciones significativas, que se analizan a continuación.
Si las secuencias de ADNr codifican un gen que se expresa, entonces se puede detectar la presencia de productos de ARN y/o proteínas del gen recombinante, típicamente utilizando métodos de RT-PCR o hibridación Western . [13] Los cambios fenotípicos macroscópicos no son la norma, a menos que el gen recombinante haya sido elegido y modificado de manera tal de generar actividad biológica en el organismo huésped. [14] Los fenotipos adicionales que se encuentran incluyen toxicidad para el organismo huésped inducida por el producto del gen recombinante, especialmente si se sobreexpresa o se expresa dentro de células o tejidos inadecuados. [ cita requerida ]
En algunos casos, el ADN recombinante puede tener efectos nocivos incluso si no se expresa. Un mecanismo por el cual esto sucede es la inactivación por inserción , en la que el ADNr se inserta en el gen de una célula huésped. En algunos casos, los investigadores utilizan este fenómeno para " eliminar " genes y determinar su función biológica e importancia. [15] Otro mecanismo por el cual la inserción del ADNr en el ADN cromosómico puede afectar la expresión génica es mediante la activación inapropiada de genes de la célula huésped previamente no expresados. Esto puede suceder, por ejemplo, cuando un fragmento de ADN recombinante que contiene un promotor activo se ubica junto a un gen de la célula huésped previamente silenciado, o cuando un gen de la célula huésped que funciona para restringir la expresión génica sufre una inactivación por inserción por parte del ADN recombinante. [ cita requerida ]
El ADN recombinante se utiliza ampliamente en biotecnología , medicina e investigación . Hoy en día, las proteínas recombinantes y otros productos que resultan del uso de la tecnología del ADN se encuentran prácticamente en todas las farmacias, consultorios médicos o veterinarios, laboratorios de pruebas médicas y laboratorios de investigación biológica occidentales. Además, los organismos que han sido manipulados mediante tecnología del ADN recombinante, así como los productos derivados de esos organismos, han llegado a muchas granjas, supermercados , botiquines caseros e incluso tiendas de mascotas, como las que venden GloFish y otros animales modificados genéticamente .
La aplicación más común del ADN recombinante es en la investigación básica, en la que la tecnología es importante para la mayoría de los trabajos actuales en las ciencias biológicas y biomédicas. [13] El ADN recombinante se utiliza para identificar, mapear y secuenciar genes, y para determinar su función. Las sondas de ADN recombinante se emplean para analizar la expresión génica dentro de células individuales y en todos los tejidos de organismos completos. Las proteínas recombinantes se utilizan ampliamente como reactivos en experimentos de laboratorio y para generar sondas de anticuerpos para examinar la síntesis de proteínas dentro de células y organismos. [4]
Se encuentran muchas otras aplicaciones prácticas del ADN recombinante en la industria, la producción de alimentos, la medicina humana y veterinaria, la agricultura y la bioingeniería. [4] A continuación se identifican algunos ejemplos específicos.
Presente en el cuajo , la quimosina es la enzima responsable de la hidrólisis de la κ - caseína para producir para- κ -caseína y glicomacropéptido , que es el primer paso en la formación del queso , y posteriormente de la cuajada y el suero . [16] Fue el primer aditivo alimentario genéticamente modificado utilizado comercialmente. Tradicionalmente, los procesadores obtenían la quimosina del cuajo, una preparación derivada del cuarto estómago de terneros alimentados con leche. Los científicos diseñaron una cepa no patógena (K-12) de la bacteria E. coli para la producción de la enzima en laboratorio a gran escala. Esta enzima recombinante producida microbiológicamente, idéntica estructuralmente a la enzima derivada del ternero, cuesta menos y se produce en cantidades abundantes. Hoy en día, alrededor del 60% del queso duro estadounidense se elabora con quimosina genéticamente modificada. En 1990, la FDA otorgó a la quimosina el estatus de " generalmente reconocida como segura " (GRAS) basándose en datos que mostraban que la enzima era segura. [17]
La insulina humana recombinante ha reemplazado casi por completo a la insulina obtenida de fuentes animales (por ejemplo, cerdos y ganado) para el tratamiento de la diabetes tipo 1. Se utilizan ampliamente diversas preparaciones de insulina recombinante. [18] La insulina recombinante se sintetiza insertando el gen de la insulina humana en E. coli o levadura (Saccharomyces cerevisiae) [19] que luego produce insulina para uso humano. [20] La insulina producida por E. coli requiere modificaciones postraduccionales adicionales (por ejemplo, glicosilación), mientras que las levaduras pueden realizar estas modificaciones por sí mismas en virtud de ser organismos hospedadores más complejos. La ventaja de la insulina humana recombinante es que después del uso crónico, los pacientes no desarrollan una defensa inmunológica contra ella de la forma en que la insulina de origen animal estimula el sistema inmunológico humano. [21]
Se administra a pacientes cuya glándula pituitaria genera cantidades insuficientes para mantener un crecimiento y desarrollo normales. Antes de que la HGH recombinante estuviera disponible, la HGH para uso terapéutico se obtenía de las glándulas pituitarias de cadáveres. Esta práctica insegura llevó a algunos pacientes a desarrollar la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob . La HGH recombinante eliminó este problema y ahora se usa con fines terapéuticos. [22] También se ha utilizado indebidamente como droga para mejorar el rendimiento por parte de deportistas y otros. [23] [24]
Es la forma recombinante del factor VIII , una proteína de coagulación sanguínea que se administra a pacientes con el trastorno hemorrágico hemofilia , que no pueden producir factor VIII en cantidades suficientes para mantener la coagulación sanguínea normal. [25] Antes del desarrollo del factor VIII recombinante, la proteína se obtenía procesando grandes cantidades de sangre humana de múltiples donantes, lo que conllevaba un riesgo muy alto de transmisión de enfermedades infecciosas transmitidas por la sangre , por ejemplo, VIH y hepatitis B.
La infección por hepatitis B se puede controlar con éxito mediante el uso de una vacuna de subunidad recombinante contra la hepatitis B , que contiene una forma del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B que se produce en células de levadura. El desarrollo de la vacuna de subunidad recombinante fue un avance importante y necesario porque el virus de la hepatitis B, a diferencia de otros virus comunes como el virus de la polio , no se puede cultivar in vitro . [26]
Los anticuerpos recombinantes (ARB) se producen in vitro mediante sistemas de expresión basados en células de mamíferos. Su unión monoespecífica a un epítopo específico hace que los ARB sean aptos no solo para fines de investigación, sino también como opciones terapéuticas contra ciertos tipos de cáncer, infecciones y enfermedades autoinmunes. [27]
Cada uno de los tres métodos ampliamente utilizados para diagnosticar la infección por VIH se ha desarrollado utilizando ADN recombinante. La prueba de anticuerpos ( ELISA o Western blot ) utiliza una proteína recombinante del VIH para comprobar la presencia de anticuerpos que el cuerpo ha producido en respuesta a una infección por VIH. La prueba de ADN busca la presencia de material genético del VIH mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). El desarrollo de la prueba RT-PCR fue posible gracias a la clonación molecular y al análisis de secuencias de los genomas del VIH. Página sobre la prueba del VIH de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de EE. UU.
El arroz dorado es una variedad recombinante de arroz que ha sido diseñada para expresar las enzimas responsables de la biosíntesis de β-caroteno . [14] Esta variedad de arroz es muy prometedora para reducir la incidencia de la deficiencia de vitamina A en la población mundial. [28] El arroz dorado no se utiliza actualmente, a la espera de la resolución de cuestiones regulatorias y de propiedad intelectual. [29]
Se han desarrollado variedades comerciales de cultivos agrícolas importantes (incluidos soja, maíz, sorgo, canola, alfalfa y algodón) que incorporan un gen recombinante que genera resistencia al herbicida glifosato (nombre comercial Roundup ) y simplifica el control de malezas mediante la aplicación de glifosato. [30] Estos cultivos son de uso comercial común en varios países.
Bacillus thuringiensis es una bacteria que produce de forma natural una proteína ( toxina Bt ) con propiedades insecticidas. [28] La bacteria se ha aplicado a los cultivos como estrategia de control de insectos durante muchos años, y esta práctica ha sido ampliamente adoptada en la agricultura y la jardinería. Recientemente, se han desarrollado plantas que expresan una forma recombinante de la proteína bacteriana, que puede controlar eficazmente algunos insectos depredadores. Los problemas ambientales asociados con el uso de estos cultivos transgénicos no se han resuelto por completo. [31]
La idea del ADN recombinante fue propuesta por primera vez por Peter Lobban, un estudiante de posgrado del profesor Dale Kaiser en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford. [32] Las primeras publicaciones que describen la producción exitosa y la replicación intracelular del ADN recombinante aparecieron en 1972 y 1973, de Stanford y la UCSF . [33] [34] [35] [36] En 1980, Paul Berg , profesor del Departamento de Bioquímica de Stanford y autor de uno de los primeros artículos [33], recibió el Premio Nobel de Química por su trabajo sobre los ácidos nucleicos "con especial atención al ADN recombinante". Werner Arber , Hamilton Smith y Daniel Nathans compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1978 por el descubrimiento de las endonucleasas de restricción que mejoraron las técnicas de la tecnología del ADN recombinante. [ cita requerida ]
El 4 de noviembre de 1974, la Universidad de Stanford solicitó una patente estadounidense sobre ADN recombinante, enumerando a los inventores como Herbert W. Boyer (profesor de la Universidad de California, San Francisco ) y Stanley N. Cohen (profesor de la Universidad de Stanford ); esta patente, US 4.237.224A, fue otorgada el 2 de diciembre de 1980. [37] [38] El primer fármaco autorizado generado utilizando tecnología de ADN recombinante fue la insulina humana, desarrollada por Genentech y autorizada por Eli Lilly and Company . [39]
Los científicos asociados con el desarrollo inicial de los métodos de ADN recombinante reconocieron que existía la posibilidad de que los organismos que contenían ADN recombinante tuvieran propiedades indeseables o peligrosas. En la Conferencia de Asilomar sobre ADN recombinante de 1975 , se discutieron estas preocupaciones y se inició una moratoria voluntaria sobre la investigación del ADN recombinante para los experimentos que se consideraban particularmente riesgosos. Esta moratoria se observó ampliamente hasta que los Institutos Nacionales de Salud (EE. UU.) desarrollaron y emitieron pautas formales para el trabajo con ADN recombinante. Hoy en día, las moléculas de ADN recombinante y las proteínas recombinantes no suelen considerarse peligrosas. Sin embargo, persisten las preocupaciones sobre algunos organismos que expresan ADN recombinante, en particular cuando salen del laboratorio y se introducen en el medio ambiente o la cadena alimentaria. Estas preocupaciones se analizan en los artículos sobre organismos genéticamente modificados y controversias sobre alimentos genéticamente modificados . Además, existen preocupaciones sobre los subproductos en la producción biofarmacéutica, donde el ADN recombinante da como resultado productos proteicos específicos. El principal subproducto, denominado proteína de la célula huésped , proviene del sistema de expresión del huésped y representa una amenaza para la salud del paciente y el medio ambiente en general. [40] [41]
