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Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa

RT-PCR

La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa ( RT-PCR ) es una técnica de laboratorio que combina la transcripción inversa de ARN en ADN (en este contexto llamado ADN complementario o ADNc) y la amplificación de objetivos de ADN específicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). [1] Se utiliza principalmente para medir la cantidad de un ARN específico. Esto se logra monitoreando la reacción de amplificación mediante fluorescencia, una técnica llamada PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR). Puede surgir confusión porque algunos autores utilizan el acrónimo RT-PCR para indicar PCR en tiempo real. En este artículo, RT-PCR denotará PCR de transcripción inversa. La RT-PCR y la qPCR combinadas se utilizan habitualmente para el análisis de la expresión genética y la cuantificación del ARN viral en entornos clínicos y de investigación.

La estrecha asociación entre RT-PCR y qPCR ha llevado al uso metonímico del término qPCR para referirse a RT-PCR. Tal uso puede resultar confuso, [2] ya que la RT-PCR se puede utilizar sin qPCR, por ejemplo, para permitir la clonación molecular , la secuenciación o la detección simple de ARN. Por el contrario, la qPCR se puede utilizar sin RT-PCR, por ejemplo, para cuantificar el número de copias de un fragmento específico de ADN.

Nomenclatura

La técnica combinada de RT-PCR y qPCR se ha descrito como RT-PCR cuantitativa [3] o RT-PCR en tiempo real [4] (a veces incluso llamada RT-PCR cuantitativa en tiempo real [5] ), y se ha abreviado de diversas formas como qRT-PCR, [6] RT-qPCR, [7] RRT-PCR, [8] y rRT-PCR. [9] Para evitar confusiones, las siguientes abreviaturas se utilizarán de forma coherente a lo largo de este artículo:

No todos los autores, especialmente los anteriores, utilizan esta convención y el lector debe tener cuidado al seguir enlaces. La RT-PCR se ha utilizado para indicar tanto la PCR en tiempo real (qPCR) como la PCR con transcripción inversa (RT-PCR).

Historia

Desde su introducción en 1977, la transferencia Northern se ha utilizado ampliamente para la cuantificación de ARN a pesar de sus deficiencias: (a) una técnica que consume mucho tiempo, (b) requiere una gran cantidad de ARN para la detección y (c) es cuantitativamente inexacta en la baja abundancia de Contenido de ARN. [10] [11] Sin embargo, desde que Kary Mullis inventó la PCR en 1983, la RT PCR ha desplazado desde entonces a la transferencia Northern como método de elección para la detección y cuantificación de ARN. [12]

La RT-PCR se ha convertido en la tecnología de referencia para la detección y/o comparación de niveles de ARN por varias razones: (a) no requiere procesamiento posterior a la PCR, (b) una amplia gama (>10 7 veces ) de ARN la abundancia se puede medir, y (c) proporciona información sobre datos tanto cualitativos como cuantitativos. [5] Debido a su simplicidad, especificidad y sensibilidad, la RT-PCR se utiliza en una amplia gama de aplicaciones , desde experimentos tan simples como la cuantificación de células de levadura en vino hasta usos más complejos como herramientas de diagnóstico para detectar agentes infecciosos como la gripe aviar. virus y SARS-CoV-2 . [13] [14] [15]

Principios

En la RT-PCR, el molde de ARN se convierte primero en un ADN complementario (ADNc) utilizando una transcriptasa inversa (RT). Luego, el ADNc se utiliza como plantilla para la amplificación exponencial mediante PCR. El uso de RT-PCR para la detección de transcritos de ARN ha revolucionado el estudio de la expresión genética de las siguientes maneras importantes:

RT-PCR de un paso frente a RT-PCR de dos pasos

RT-PCR de un paso frente a dos pasos

La cuantificación de ARNm mediante RT-PCR se puede lograr como una reacción de un paso o de dos pasos. La diferencia entre los dos enfoques radica en la cantidad de tubos utilizados al realizar el procedimiento. La reacción de dos pasos requiere que la reacción de transcriptasa inversa y la amplificación por PCR se realicen en tubos separados. La desventaja del enfoque de dos pasos es la susceptibilidad a la contaminación debido a una manipulación más frecuente de las muestras. [19] Por otro lado, toda la reacción desde la síntesis de ADNc hasta la amplificación por PCR ocurre en un solo tubo en el enfoque de un solo paso. Se cree que el enfoque de un solo paso minimiza la variación experimental al contener todas las reacciones enzimáticas en un solo entorno. Elimina los pasos de pipetear el producto de ADNc, que requiere mucha mano de obra y es propenso a la contaminación, hasta la reacción de PCR. El uso adicional de polimerasas tolerantes a inhibidores, potenciadores de polimerasas con una condición de RT-PCR de un solo paso optimizada, respalda la transcripción inversa del ARN de muestras crudas o no purificadas, como sangre completa y suero . [20] [21] Sin embargo, las plantillas de ARN iniciales son propensas a degradarse en el enfoque de un solo paso, y no se recomienda el uso de este enfoque cuando se requieren ensayos repetidos de la misma muestra. Además, se informa que el enfoque de un paso es menos preciso en comparación con el enfoque de dos pasos. También es el método de análisis preferido cuando se utilizan colorantes de unión al ADN como SYBR Green, ya que la eliminación de los dímeros de cebador se puede lograr mediante un simple cambio en la temperatura de fusión . Sin embargo, el enfoque de un solo paso es una solución relativamente conveniente para la detección rápida del ARN diana directamente en biodetección. [ cita necesaria ]

RT-PCR de punto final frente a RT-PCR en tiempo real

La cuantificación de productos de RT-PCR se puede dividir en gran medida en dos categorías: de punto final y en tiempo real. [22] Se prefiere el uso de RT-PCR de punto final para medir los cambios en la expresión genética en una pequeña cantidad de muestras, pero la RT-PCR en tiempo real se ha convertido en el método estándar de oro para validar resultados cuantitativos obtenidos de análisis de matrices o expresión genética. cambios a escala global. [23]

RT-PCR de punto final

Los enfoques de medición de la RT-PCR de punto final requieren la detección de niveles de expresión génica mediante el uso de tintes fluorescentes como bromuro de etidio , [24] [25] marcaje con P32 de productos de PCR utilizando fosforimager , [26] o mediante recuento de centelleo . [18] La RT-PCR de punto final se logra comúnmente utilizando tres métodos diferentes: relativo, competitivo y comparativo. [27] [28]

RT-PCR relativa
Las cuantificaciones relativas de RT-PCR implican la coamplificación de un control interno simultáneamente con el gen de interés. El control interno se utiliza para normalizar las muestras. Una vez normalizado, se puede realizar una comparación directa de la abundancia relativa de transcripciones en múltiples muestras de ARNm. Una precaución a tener en cuenta es que el control interno debe elegirse de modo que no se vea afectado por el tratamiento experimental. El nivel de expresión debe ser constante en todas las muestras y con el ARNm de interés para que los resultados sean precisos y significativos. Debido a que la cuantificación de los resultados se analiza comparando el rango lineal de la amplificación objetivo y de control, es fundamental tener en cuenta la concentración inicial de las moléculas objetivo y su tasa de amplificación antes de iniciar el análisis. Los resultados del análisis se expresan como las relaciones entre la señal genética y la señal de control interno, cuyos valores pueden luego usarse para la comparación entre las muestras en la estimación de la expresión relativa del ARN diana. [25] [28] [29]
RT-PCR competitiva
Se utiliza la técnica competitiva de RT-PCR para la cuantificación absoluta. Implica el uso de un ARN “competidor” sintético que puede distinguirse del ARN objetivo por una pequeña diferencia de tamaño o secuencia. Es importante que el diseño del ARN sintético sea idéntico en secuencia pero ligeramente más corto que el ARN objetivo para obtener resultados precisos. Una vez diseñado y sintetizado, se añade una cantidad conocida del ARN competidor a las muestras experimentales y se coamplifica con el objetivo mediante RT-PCR. Luego, se produce una curva de concentración del ARN competidor y se usa para comparar las señales de RT-PCR producidas a partir de las transcripciones endógenas para determinar la cantidad de diana presente en la muestra. [28] [30]
RT-PCR comparativa
La RT-PCR comparativa es similar a la RT-PCR competitiva en que el ARN objetivo compite por los reactivos de amplificación dentro de una única reacción con un estándar interno de secuencia no relacionada. Una vez que se completa la reacción, los resultados se comparan con una curva estándar externa para determinar la concentración de ARN objetivo. En comparación con los métodos de cuantificación relativa y competitiva, la RT-PCR comparativa se considera el método más conveniente de usar ya que no requiere que el investigador realice un experimento piloto; en RT-PCR relativa, el rango de amplificación exponencial del ARNm debe estar predeterminado y en RT-PCR competitiva, se debe sintetizar un ARN competidor sintético. [28] [31] [32] [33] [34]

RT-PCR en tiempo real

La aparición de nuevas técnicas de etiquetado de ADN fluorescente en los últimos años ha permitido el análisis y la detección de productos de PCR en tiempo real y, en consecuencia, ha llevado a la adopción generalizada de RT-PCR en tiempo real para el análisis de la expresión génica. [35] La RT-PCR en tiempo real no solo es ahora el método de elección para la cuantificación de la expresión genética, sino que también es el método preferido para obtener resultados de análisis de matrices y expresiones genéticas a escala global. [36] Actualmente, hay cuatro sondas de ADN fluorescentes diferentes disponibles para la detección por RT-PCR en tiempo real de productos de PCR: SYBR Green , TaqMan , balizas moleculares y sondas de escorpión. Todas estas sondas permiten la detección de productos de PCR generando una señal fluorescente. Mientras que el tinte verde SYBR emite su señal fluorescente simplemente uniéndose al ADN bicatenario en solución, la generación de fluorescencia de las sondas TaqMan, las balizas moleculares y los escorpiones depende del acoplamiento de la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) de la molécula del tinte y un resto inhibidor de los sustratos oligonucleotídicos. [37]

SYBR Verde
Cuando SYBR Green se une al ADN bicatenario de los productos de PCR, emitirá luz al excitarse. La intensidad de la fluorescencia aumenta a medida que se acumulan los productos de la PCR. Esta técnica es fácil de utilizar ya que no es necesario diseñar sondas dada la falta de especificidad de su unión. Sin embargo, dado que el colorante no discrimina el ADN bicatenario de los productos de la PCR y los de los dímeros del cebador, la sobreestimación de la concentración objetivo es un problema común. Cuando una cuantificación precisa sea absolutamente necesaria, se deben realizar más ensayos para validar los resultados. Sin embargo, entre los métodos de detección de productos por RT-PCR en tiempo real, SYBR Green es el más económico y fácil de usar. [22] [23]
Sondas Taqman
Sondas TaqMan
Las sondas TaqMan son oligonucleótidos que tienen una sonda fluorescente unida al extremo 5' y un desactivador al extremo 3'. Durante la amplificación por PCR, estas sondas se hibridarán con las secuencias objetivo ubicadas en el amplicón y, a medida que la polimerasa replica la plantilla con TaqMan unido, también escinde la sonda fluorescente debido a la actividad de la polimerasa 5'-nucleasa. Debido a que la estrecha proximidad entre la molécula de extinción y la sonda fluorescente normalmente impide que se detecte la fluorescencia a través de FRET, el desacoplamiento da como resultado un aumento de la intensidad de la fluorescencia proporcional al número de ciclos de escisión de la sonda. Aunque las sondas TaqMan bien diseñadas producen resultados precisos de RT-PCR en tiempo real, su síntesis es costosa y lleva mucho tiempo cuando se deben fabricar sondas separadas para cada objetivo de ARNm analizado. [22] [16] [38] Además, estas sondas son sensibles a la luz y deben congelarse cuidadosamente como alícuotas para evitar la degradación.
Sondas de baliza molecular
De manera similar a las sondas TaqMan, las balizas moleculares también utilizan la detección FRET con sondas fluorescentes unidas al extremo 5' y un extintor unido al extremo 3' de un sustrato oligonucleotídico. Sin embargo, mientras que las sondas fluorescentes TaqMan se escinden durante la amplificación, las sondas de baliza molecular permanecen intactas y se vuelven a unir a un nuevo objetivo durante cada ciclo de reacción. Cuando está libre en solución, la proximidad de la sonda fluorescente y la molécula extintor evita la fluorescencia a través de FRET. Sin embargo, cuando las sondas de baliza molecular se hibridan con un objetivo, el tinte fluorescente y el extintor se separan, lo que da como resultado la emisión de luz tras la excitación. Al igual que con las sondas TaqMan, las balizas moleculares son costosas de sintetizar y requieren sondas separadas para cada objetivo de ARN. [19]
sondas escorpion
Las sondas de escorpión, al igual que las balizas moleculares, no serán fluorescentes activas en un estado no hibridado, nuevamente, debido a que la sonda fluorescente en el extremo 5' es apagada por el resto en el extremo 3' de un oligonucleótido. Sin embargo, en Scorpions, el extremo 3' también contiene una secuencia complementaria al producto de extensión del cebador en el extremo 5'. Cuando la extensión Scorpion se une a su complemento en el amplicón, la estructura Scorpion se abre, evita FRET y permite medir la señal fluorescente. [39]
Sondas multiplex
Las sondas TaqMan, las balizas moleculares y los scorpions permiten la medición simultánea de productos de PCR en un solo tubo. Esto es posible porque cada uno de los diferentes tintes fluorescentes puede asociarse a un espectro de emisión específico. El uso de sondas multiplex no sólo ahorra tiempo y esfuerzo sin comprometer la utilidad de la prueba, sino que su aplicación en amplias áreas de investigación, como el análisis de deleción genética, el análisis de mutaciones y polimorfismos, el análisis cuantitativo y la detección de ARN, la convierten en una técnica invaluable para los laboratorios de muchas disciplinas. [39] [40] [41]

Habitualmente se emplean dos estrategias para cuantificar los resultados obtenidos mediante RT-PCR en tiempo real; el método de la curva estándar y el método del umbral comparativo. [42]

Solicitud

La amplificación exponencial mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa proporciona una técnica altamente sensible en la que se puede detectar un número de copias muy bajo de moléculas de ARN. La RT-PCR se utiliza ampliamente en el diagnóstico de enfermedades genéticas y, de forma semicuantitativa, en la determinación de la abundancia de diferentes moléculas de ARN específicas dentro de una célula o tejido como medida de la expresión genética .

Métodos de búsqueda

La RT-PCR se utiliza habitualmente en métodos de investigación para medir la expresión genética. Por ejemplo, Lin et al. utilizó qRT-PCR para medir la expresión de genes Gal en células de levadura. En primer lugar, Lin et al. diseñaron una mutación de una proteína que se sospecha participa en la regulación de los genes Gal. Se planteó la hipótesis de que esta mutación suprimiría selectivamente la expresión de Gal. Para confirmar esto, se analizaron los niveles de expresión génica de las células de levadura que contienen esta mutación mediante qRT-PCR. Los investigadores pudieron determinar de manera concluyente que la mutación de esta proteína reguladora reducía la expresión de Gal. [43] El análisis de transferencia Northern se utiliza para estudiar más a fondo la expresión genética del ARN.

Inserción genética

La RT-PCR también puede resultar muy útil en la inserción de genes eucariotas en procariotas . Debido a que la mayoría de los genes eucarióticos contienen intrones , que están presentes en el genoma pero no en el ARNm maduro, el ADNc generado a partir de una reacción de RT-PCR es la secuencia de ADN exacta (sin tener en cuenta la naturaleza propensa a errores de las transcriptasas inversas) que sería traducido directamente a proteína después de la transcripción . Cuando estos genes se expresan en células procarióticas con el fin de producir o purificar proteínas, el ARN producido directamente a partir de la transcripción no necesita someterse a corte y empalme ya que la transcripción solo contiene exones . (Los procariotas, como E. coli, carecen del mecanismo de empalme de ARNm de los eucariotas).

Diagnóstico de enfermedades genéticas.

La RT-PCR se puede utilizar para diagnosticar enfermedades genéticas como el síndrome de Lesch-Nyhan . Esta enfermedad genética es causada por un mal funcionamiento en el gen HPRT1 , que clínicamente conduce a cálculos urinarios fatales de ácido úrico y síntomas similares a los de la gota . [6] [ se necesita aclaración ] El análisis de los niveles de expresión de ARNm de HPRT1 en una madre embarazada y un feto revelará si la madre es portadora y si es probable que el feto desarrolle el síndrome de Lesch-Nyhan. [44]

Detección de cáncer

Los científicos están trabajando en formas de utilizar la RT-PCR en la detección del cáncer para ayudar a mejorar el pronóstico y monitorear la respuesta a la terapia. Las células tumorales circulantes producen transcripciones de ARNm únicas según el tipo de cáncer. El objetivo es determinar qué transcripciones de ARNm sirven como los mejores biomarcadores para un tipo de célula cancerosa en particular y luego analizar sus niveles de expresión con RT-PCR. [45]

La RT-PCR se usa comúnmente para estudiar los genomas de virus cuyos genomas están compuestos de ARN, como el Influenzavirus A , retrovirus como el VIH y el SARS-CoV-2 . [46]

Desafíos

A pesar de sus importantes ventajas, la RT-PCR no está exenta de inconvenientes. El crecimiento exponencial del ADN complementario (cDNA) con transcripción inversa durante los múltiples ciclos de PCR produce una cuantificación inexacta del punto final debido a la dificultad para mantener la linealidad. [47] Para proporcionar una detección y cuantificación precisas del contenido de ARN en una muestra, se desarrolló qRT-PCR utilizando una modificación basada en fluorescencia para monitorear los productos de amplificación durante cada ciclo de PCR. La extrema sensibilidad de la técnica puede ser un arma de doble filo, ya que incluso la más mínima contaminación del ADN puede provocar resultados indeseables. [48] ​​Un método simple para la eliminación de resultados falsos positivos es incluir anclajes o etiquetas en la región 5' de un cebador específico de gen. [49] Además, la planificación y el diseño de estudios de cuantificación pueden ser técnicamente desafiantes debido a la existencia de numerosas fuentes de variación, incluida la concentración de la plantilla y la eficiencia de la amplificación. [31] Se pueden utilizar como controles agregar una cantidad conocida de ARN a una muestra, agregar una serie de diluciones de ARN que generen una curva estándar y agregar una muestra sin copia de plantilla (sin ADNc).

Protocolo

La RT-PCR se puede realizar mediante el protocolo RT-PCR de un paso o el protocolo RT-PCR de dos pasos.

RT-PCR de un solo paso

La RT-PCR de un solo paso somete objetivos de ARNm (hasta 6 kb) a una transcripción inversa seguida de una amplificación por PCR en un solo tubo de ensayo. Es importante señalar que el uso de ARN intacto y de alta calidad y un cebador específico de secuencia producirá los mejores resultados.

Una vez que se selecciona un kit de RT-PCR de un solo paso con una mezcla de transcriptasa inversa, ADN polimerasa Taq y una polimerasa de corrección y se obtienen todos los materiales y equipos necesarios, se debe preparar una mezcla de reacción. La mezcla de reacción incluye dNTP, cebadores, plantilla de ARN, enzimas necesarias y una solución tampón. La mezcla de reacción se agrega a un tubo de PCR para cada reacción, seguida del ARN molde. Luego, los tubos de PCR se colocan en un termociclador para comenzar el ciclo. En el primer ciclo se produce la síntesis de ADNc. El segundo ciclo es la desnaturalización inicial en la que se inactiva la transcriptasa inversa. Los 40 a 50 ciclos restantes son la amplificación, que incluye desnaturalización, hibridación y elongación. Cuando se completa la amplificación, los productos de RT-PCR se pueden analizar con electroforesis en gel . [50] [51]

(Manual de Aplicaciones PCR y Bioherramientas)

RT-PCR de dos pasos

La RT-PCR de dos pasos, como su nombre indica, se produce en dos pasos. Primero la transcripción inversa y luego la PCR. Este método es más sensible que el método de un solo paso. Los kits también son útiles para RT-PCR de dos pasos. Al igual que con la PCR de un solo paso, utilice únicamente ARN intacto y de alta calidad para obtener mejores resultados. El cebador para la PCR de dos pasos no tiene por qué ser específico de secuencia.

Paso uno

Primero combine el ARN plantilla, el cebador, la mezcla de dNTP y el agua libre de nucleasas en un tubo de PCR. Luego, agregue un inhibidor de RNasa y transcriptasa inversa al tubo de PCR. A continuación, coloque el tubo de PCR en un ciclador térmico durante un ciclo en el que se produce la hibridación, extensión e inactivación de la transcriptasa inversa. Finalmente, proceda directamente al paso dos, que es la PCR, o almacene el producto en hielo hasta que se pueda realizar la PCR.

Segundo paso

Agregue la mezcla maestra que contiene tampón, mezcla de dNTP, MgCl 2 , polimerasa Taq y agua libre de nucleasas a cada tubo de PCR. Luego agregue la imprimación necesaria a los tubos. A continuación, coloque los tubos de PCR en un termociclador durante 30 ciclos del programa de amplificación. Esto incluye: desnaturalización, recocido y elongación. Los productos de RT-PCR se pueden analizar con electroforesis en gel. [52]

Pautas de publicación

El ensayo cuantitativo de RT-PCR se considera el estándar de oro para medir el número de copias de objetivos de ADNc específicos en una muestra, pero está poco estandarizado. [53] Como resultado, si bien existen numerosas publicaciones que utilizan la técnica, muchas proporcionan detalles experimentales inadecuados y utilizan análisis de datos inadecuados para sacar conclusiones inapropiadas. Debido a la variabilidad inherente en la calidad de cualquier dato cuantitativo de PCR, los revisores no sólo tienen dificultades para evaluar estos manuscritos, sino que los estudios también se vuelven imposibles de replicar. [54] Reconociendo la necesidad de estandarizar la presentación de informes de las condiciones experimentales, un consorcio internacional de científicos académicos ha publicado las directrices sobre información mínima para la publicación de experimentos cuantitativos de PCR en tiempo real (MIQE, pronunciado mykee). Las directrices MIQE describen la información mínima necesaria para evaluar experimentos de PCR cuantitativa que se debe exigir para su publicación para fomentar mejores prácticas experimentales y garantizar la relevancia, precisión, interpretación correcta y repetibilidad de los datos de PCR cuantitativa. [55]

Además de las pautas para la presentación de informes, el MIQE enfatiza la necesidad de estandarizar la nomenclatura asociada con la PCR cuantitativa para evitar confusión; por ejemplo, la abreviatura qPCR debe usarse para PCR cuantitativa en tiempo real , mientras que RT-qPCR debe usarse para qPCR de transcripción inversa, y los genes utilizados para la normalización deben denominarse genes de referencia en lugar de genes de mantenimiento . También propone que no se utilicen términos derivados comercialmente como sondas TaqMan , sino que se los denomine sondas de hidrólisis . Además, se propone utilizar el ciclo de cuantificación (Cq) para describir el ciclo de PCR utilizado para la cuantificación en lugar del ciclo de umbral (Ct), el punto de cruce (Cp) y el punto de despegue (TOP), que se refieren al mismo valor pero fueron acuñado por diferentes fabricantes de instrumentos de tiempo real . [53]

La guía consta de los siguientes elementos: 1) diseño experimental, 2) muestra, 3) extracción de ácido nucleico, 4) transcripción inversa, 5) información objetivo de qPCR, 6) oligonucleótidos, 7) protocolo, 8) validación y 9) datos análisis. Los elementos específicos dentro de cada elemento llevan una etiqueta de E (esencial) o D (deseable). Los etiquetados con E se consideran críticos e indispensables, mientras que los etiquetados con D se consideran periféricos pero importantes para las mejores prácticas. [55]

Referencias

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