Forma de microscopía electrónica de transmisión (TEM)
La microscopía electrónica criogénica ( crio-EM ) es una técnica de criomicroscopía que se aplica a muestras enfriadas a temperaturas criogénicas . En el caso de los especímenes biológicos, la estructura se conserva incrustándola en un entorno de hielo vítreo . Se aplica una solución de muestra acuosa a una rejilla y se congela por inmersión en etano líquido o una mezcla de etano líquido y propano . [1] Si bien el desarrollo de la técnica comenzó en la década de 1970, los avances recientes en la tecnología de detectores y los algoritmos de software han permitido la determinación de estructuras biomoleculares con una resolución casi atómica. [2] Esto ha atraído una gran atención al enfoque como una alternativa a la cristalografía de rayos X o la espectroscopia de RMN para la determinación de la estructura macromolecular sin la necesidad de cristalización. [3]
En la década de 1960, el uso de la microscopía electrónica de transmisión para métodos de determinación de estructuras estaba limitado debido al daño por radiación causado por los haces de electrones de alta energía. Los científicos plantearon la hipótesis de que examinar especímenes a bajas temperaturas reduciría el daño por radiación inducido por el haz. [6] Tanto el helio líquido (-269 °C o 4 K o -452,2 °F ) como el nitrógeno líquido (-195,79 °C o 77 K o -320 °F) se consideraron criógenos. En 1980, Erwin Knapek y Jacques Dubochet publicaron comentarios sobre el daño del haz a temperaturas criogénicas compartiendo observaciones que:
Se descubrió que los cristales finos montados sobre una película de carbono eran entre 30 y 300 veces más resistentes a los rayos a 4 K que a temperatura ambiente... La mayoría de nuestros resultados pueden explicarse suponiendo que la crioprotección en la región de 4 K depende en gran medida de la temperatura. [7]
Sin embargo, estos resultados no fueron reproducibles y solo dos años después se publicaron enmiendas en Nature informando que la resistencia del haz era menos significativa de lo previsto inicialmente. La protección obtenida a 4 K fue más cercana a "diez veces para muestras estándar de L- valina ", [8] de lo que se había indicado anteriormente.
La década de 2010 estuvo marcada por avances drásticos en las cámaras electrónicas. En particular, las mejoras realizadas en los detectores de electrones directos han llevado a una "revolución de la resolución" [11] empujando la barrera de resolución por debajo del límite crucial de ~2-3 Å para resolver la posición y orientación de los aminoácidos. [12]
Más recientemente, los avances en el uso de estructuras de imágenes basadas en proteínas están ayudando a resolver los problemas del sesgo de orientación de la muestra y el límite de tamaño. Las proteínas de menos de ~50 kDa generalmente tienen una SNR insuficiente para poder resolver las partículas de proteínas en la imagen, lo que dificulta o imposibilita la reconstrucción 3D. [13] Los andamios de imágenes aumentan la SNR de proteínas más pequeñas al unirlas a un objeto más grande, el andamio. El grupo de Yeates en UCLA pudo crear una imagen más clara de tres variantes de KRAS (de aproximadamente 19 kDa de tamaño) utilizando un andamio de imágenes rígido y usando DARPins como dominio de unión modular entre el andamio y la proteína de interés. [14]
Premio Nobel de Química 2017
En reconocimiento al impacto que la crio-EM ha tenido en la bioquímica, tres científicos, Jacques Dubochet , Joachim Frank y Richard Henderson , recibieron el Premio Nobel de Química "por desarrollar la microscopía crioelectrónica para la determinación de la estructura de alta resolución de biomoléculas en solución". ". [4]
Comparaciones con la cristalografía de rayos X
Tradicionalmente, la cristalografía de rayos X ha sido la técnica más popular para determinar las estructuras tridimensionales de moléculas biológicas. [15] Sin embargo, las mejoras antes mencionadas en crio-EM han aumentado su popularidad como herramienta para examinar los detalles de moléculas biológicas. Desde 2010, los depósitos anuales de estructuras crio-EM han superado a la cristalografía de rayos X. [16] Aunque la cristalografía de rayos X tiene un número drásticamente mayor de depósitos totales debido a una historia de décadas más larga, se proyecta que los depósitos totales de los dos métodos se eclipsarán alrededor de 2035. [16]
La resolución de la cristalografía de rayos X está limitada por la homogeneidad del cristal, [17] y lograr que moléculas biológicas con condiciones de cristalización ideales desconocidas alcancen un estado cristalino puede llevar mucho tiempo y, en casos extremos, meses o incluso años. [18] Por el contrario, la preparación de muestras en crio-EM puede requerir varias rondas de detección y optimización para superar problemas como la agregación de proteínas y las orientaciones preferidas, [19] [20] pero no requiere que la muestra forme un cristal, sino más bien Las muestras para crio-EM se congelan instantáneamente y se examinan en sus estados casi nativos. [21]
Según Proteopedia , la resolución media lograda por cristalografía de rayos X (al 19 de mayo de 2019) en el Banco de datos de proteínas es 2,05 Å , [17] y la resolución más alta lograda hasta el momento (al 30 de septiembre de 2022) es 0,48 A. [22] A partir de 2020, la mayoría de las estructuras proteicas determinadas por crio-EM tienen una resolución más baja de 3 a 4 Å. [23] Sin embargo, a partir de 2020, la mejor resolución crio-EM se ha registrado en 1,22 Å, [20] lo que la convierte en un competidor en resolución en algunos casos.
El Instituto Federal de Tecnología , la Universidad de Lausana y la Universidad de Ginebra abrieron el Centro Dubochet de Imágenes (DCI) a finales de noviembre de 2021, con el fin de aplicar y seguir desarrollando la crio-EM. [25] Menos de un mes después de la primera identificación de la variante Omicron del SARS-CoV-2 , los investigadores del DCI pudieron definir su estructura, identificar las mutaciones cruciales para eludir las vacunas individuales y proporcionar información para nuevos enfoques terapéuticos. [26]
La Instalación Nacional Danesa de crio-EM, también conocida como EMBION, se inauguró el 1 de diciembre de 2016. EMBION es un consorcio de crio-EM entre universidades danesas (anfitriona de la Universidad de Aarhus y coanfitrión de la Universidad de Copenhague).
Métodos avanzados
Tomografía electrónica criogénica (crio-ET), una aplicación especializada en la que se toman muchas imágenes de muestras individuales en varios ángulos de inclinación, lo que da como resultado una reconstrucción 3D de una sola muestra. [27]
Análisis de partículas individuales crio-EM, un método de promediado para determinar la estructura de proteínas a partir de muestras monodispersas. [32]
^ Tivol WF, Briegel A, Jensen GJ (octubre de 2008). "Un criógeno mejorado para la congelación por inmersión". Microscopía y Microanálisis . 14 (5): 375–379. Código Bib : 2008MiMic..14..375T. doi :10.1017/S1431927608080781. PMC 3058946 . PMID 18793481.
^ Cheng Y, Grigorieff N, Penczek PA, Walz T (abril de 2015). "Una introducción a la microscopía crioelectrónica de una sola partícula". Celúla . 161 (3): 438–449. doi :10.1016/j.cell.2015.03.050. PMC 4409659 . PMID 25910204.
^ Stoddart C (1 de marzo de 2022). "Biología estructural: cómo las proteínas obtuvieron su primer plano". Revista Conocible . doi : 10.1146/conocible-022822-1 . S2CID 247206999 . Consultado el 25 de marzo de 2022 .
^ ab "El Premio Nobel de Química 2017". Premio Nobel.org . Consultado el 30 de septiembre de 2022 .
^ Doerr A (enero de 2017). "Tomografía crioelectrónica". Métodos de la naturaleza . 14 (1): 34. doi :10.1038/nmeth.4115. ISSN 1548-7091. S2CID 27162203.
^ Dubochet J, Knapek E (abril de 2018). "Altibajos en la criomicroscopía electrónica temprana". Más biología . 16 (4): e2005550. doi : 10.1371/journal.pbio.2005550 . PMC 5929567 . PMID 29672565.
^ Knapek E, Dubochet J (agosto de 1980). "El daño del haz al material orgánico se reduce considerablemente en la microscopía crioelectrónica". Revista de biología molecular . 141 (2): 147–161. doi :10.1016/0022-2836(80)90382-4. PMID 7441748.
^ Newmark P (30 de septiembre de 1982). "Microscopía de criotransmisión. Esperanzas desvanecidas". Naturaleza . 299 (5882): 386–387. Código Bib :1982Natur.299..386N. doi : 10.1038/299386c0 .
^ Dubochet J, McDowall AW (diciembre de 1981). "Vitrificación de agua pura para microscopía electrónica". Revista de microscopía . 124 (3): 3–4. doi : 10.1111/j.1365-2818.1981.tb02483.x .
^ Adrian M, Dubochet J, Lepault J, McDowall AW (marzo de 1984). "Microscopía crioelectrónica de virus". Naturaleza . 308 (5954): 32–36. Código Bib :1984Natur.308...32A. doi :10.1038/308032a0. PMID 6322001. S2CID 4319199.
^ ab Kühlbrandt, Werner (28 de marzo de 2014). "La revolución de la resolución". Ciencia . 343 (6178): 1443–1444. Código Bib : 2014 Ciencia... 343.1443K. doi : 10.1126/ciencia.1251652. ISSN 0036-8075. PMID 24675944. S2CID 35524447.
^ Kuster, Daniel J.; Liu, Chengyu; Colmillo, Zheng; Reflexione, Jay W.; Marshall, Garland R. (20 de abril de 2015). "Estructuras cristalinas de alta resolución de hélices de proteínas reconciliadas con enlaces de hidrógeno de tres centros y electrostática multipolar". MÁS UNO . 10 (4): e0123146. Código Bib : 2015PLoSO..1023146K. doi : 10.1371/journal.pone.0123146 . ISSN 1932-6203. PMC 4403875 . PMID 25894612.
^ Herzik, Mark A.; Wu, Mengyu; Lander, Gabriel C. (4 de marzo de 2019). "Determinación de la estructura de alta resolución de complejos de menos de 100 kDa mediante crio-EM convencional". Comunicaciones de la naturaleza . 10 (1): 1032. Código bibliográfico : 2019NatCo..10.1032H. doi :10.1038/s41467-019-08991-8. ISSN 2041-1723. PMC 6399227 . PMID 30833564.
^ Castells-Graells R, Meador K, Arbing MA, Sawaya MR, Gee M, Cascio D, et al. (septiembre de 2023). "Determinación de la estructura crio-EM de pequeñas dianas proteicas terapéuticas con una resolución de 3 Å utilizando un andamio de imágenes rígido". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 120 (37): e2305494120. Código Bib : 2023PNAS..12005494C. doi :10.1073/pnas.2305494120. PMC 10500258 . PMID 37669364.
^ Smyth MS, Martin JH (febrero de 2000). "Cristalografía de rayos X". Patología Molecular . 53 (1): 8–14. doi :10.1136/mp.53.1.8. PMC 1186895 . PMID 10884915.
^ ab Chiu, Wah; Schmid, Michael F.; Pintilie, Grigore D.; Lawson, Catherine L. (enero de 2021). "Evolución de la estandarización y difusión de estructuras y datos crio-EM de forma conjunta por parte de la comunidad, PDB y EMDB". Revista de Química Biológica . 296 : 100560. doi : 10.1016/j.jbc.2021.100560 . ISSN 0021-9258. PMC 8050867 . PMID 33744287.
^ ab "Resolución - Proteopedia, vida en 3D". proteopedia.org . Consultado el 27 de octubre de 2020 .
^ Callaway E (febrero de 2020). "La revolucionaria crio-EM se está apoderando de la biología estructural". Naturaleza . 578 (7794): 201. Bibcode :2020Natur.578..201C. doi : 10.1038/d41586-020-00341-9 . PMID 32047310.
^ Lyumkis, Dmitry (29 de marzo de 2019). "Desafíos y oportunidades en el análisis de partículas individuales crio-EM". Revista de Química Biológica . 294 (13): 5181–5197. doi : 10.1074/jbc.rev118.005602 . ISSN 0021-9258. PMC 6442032 . PMID 30804214.
^ ab Nakane T, Kotecha A, Sente A, McMullan G, Masiulis S, Brown PM, et al. (noviembre de 2020). "Crio-EM de una sola partícula con resolución atómica". Naturaleza . 587 (7832): 152-156. Código Bib :2020Natur.587..152N. doi :10.1038/s41586-020-2829-0. PMC 7611073 . PMID 33087931.
^ Wang HW, Wang JW (enero de 2017). "Cómo se complementan entre sí la microscopía crioelectrónica y la cristalografía de rayos X". Ciencia de las proteínas . 26 (1): 32–39. doi :10.1002/pro.3022. PMC 5192981 . PMID 27543495.
^ Schmidt A, Teeter M, Weckert E, Lamzin VS (abril de 2011). "Estructura cristalina de la proteína pequeña crambina con una resolución de 0,48 Å". Acta Cristalográfica. Sección F, Biología estructural y comunicaciones de cristalización . 67 (parte 4): 424–428. doi :10.1107/S1744309110052607. PMC 3080141 . PMID 21505232.
^ Yip KM, Fischer N, Paknia E, Chari A, Stark H (noviembre de 2020). "Determinación de la estructura de proteínas de resolución atómica mediante crio-EM". Naturaleza . 587 (7832): 157–161. Código Bib :2020Natur.587..157Y. doi :10.1038/s41586-020-2833-4. PMID 33087927. S2CID 224823207.
^ Sartori-Rupp A, Cordero Cervantes D, Pepe A, Gousset K, Delage E, Corroyer-Dulmont S, et al. (Enero de 2019). "La microscopía crioelectrónica correlativa revela la estructura de los TNT en las células neuronales". Comunicaciones de la naturaleza . 10 (1): 342. Código bibliográfico : 2019NatCo..10..342S. doi :10.1038/s41467-018-08178-7. PMC 6341166 . PMID 30664666.
^ "Inauguración del Centro Dubochet de Imágenes (DCI) en los campus de UNIGE, UNIL y EPFL". unige.ch . 2021-11-30 . Consultado el 30 de abril de 2022 .
^ "Los científicos descubren los misterios de la variante Omicron utilizando microscopios". swissinfo.ch . 2021-12-30 . Consultado el 30 de abril de 2022 .
^ Bäuerlein, Félix JB; Baumeister, Wolfgang (1 de octubre de 2021). "Hacia la proteómica visual en alta resolución". Revista de biología molecular . De la secuencia de proteínas a la estructura a velocidad vertiginosa: cómo Alphafold impacta la biología. 433 (20): 167187. doi : 10.1016/j.jmb.2021.167187 . ISSN 0022-2836. PMID 34384780.
^ Nannenga BL, Shi D, Leslie AG, Gonen T (septiembre de 2014). "Determinación de estructuras de alta resolución mediante recopilación de datos de rotación continua en MicroED". Métodos de la naturaleza . 11 (9): 927–930. doi :10.1038/nmeth.3043. PMC 4149488 . PMID 25086503.
^ Jones CG, Martynowycz MW, Hattne J, Fulton TJ, Stoltz BM, Rodríguez JA, et al. (noviembre de 2018). "El método CryoEM MicroED como una herramienta poderosa para la determinación de la estructura de moléculas pequeñas". Ciencia Central ACS . 4 (11): 1587-1592. doi : 10.1021/acscentsci.8b00760. PMC 6276044 . PMID 30555912.
^ de la Cruz MJ, Hattne J, Shi D, Seidler P, Rodríguez J, Reyes FE, et al. (febrero de 2017). "Estructuras de resolución atómica a partir de cristales de proteínas fragmentados con el método crioEM MicroED". Métodos de la naturaleza . 14 (4): 399–402. doi :10.1038/nmeth.4178. PMC 5376236 . PMID 28192420.
^ Gruene T, Wennmacher JT, Zaubitzer C, Holstein JJ, Heidler J, Fecteau-Lefebvre A, et al. (Diciembre de 2018). "Determinación rápida de la estructura de compuestos moleculares microcristalinos mediante difracción de electrones". Angewandte Chemie . 57 (50): 16313–16317. doi :10.1002/anie.201811318. PMC 6468266 . PMID 30325568.
^ Cheng Y (agosto de 2018). "Cryo-EM de una sola partícula: ¿Cómo llegó aquí y a dónde irá?". Ciencia . 361 (6405): 876–880. Código Bib : 2018 Ciencia... 361..876C. doi : 10.1126/ciencia.aat4346. PMC 6460916 . PMID 30166484.
^ Xiao, C., Fischer, MG, Bolotaulo, DM, Ulloa-Rondeau, N., Avila, GA y Suttle, CA (2017) "La reconstrucción crio-EM de la cápside del virus Cafeteria roenbergensis sugiere una nueva vía de ensamblaje para virus gigantes ". Informes científicos , 7 : 5484. doi : 10.1038/s41598-017-05824-w.