El análisis de partículas individuales es un grupo de técnicas de procesamiento de imágenes computarizadas relacionadas que se utilizan para analizar imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM). [1] Estos métodos se desarrollaron para mejorar y ampliar la información que se puede obtener a partir de imágenes TEM de muestras de partículas, típicamente proteínas u otras entidades biológicas grandes como virus . Las imágenes individuales de partículas teñidas o no teñidas son muy ruidosas y muy difíciles de interpretar. La combinación de varias imágenes digitalizadas de partículas similares da una imagen con características más fuertes y más fácilmente interpretables. Una extensión de esta técnica utiliza métodos de partícula única para construir una reconstrucción tridimensional de la partícula. Utilizando la microscopía crioelectrónica ha sido posible generar reconstrucciones con resolución subnanométrica y resolución casi atómica [2] [3] primero en el caso de virus altamente simétricos y ahora también en proteínas más pequeñas y asimétricas. [4] El análisis de partículas individuales también se puede realizar mediante espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS).
El análisis de partículas individuales se puede realizar en muestras de criomicroscopía electrónica de transmisión (CryoTEM) teñidas negativamente y vítreas incrustadas en hielo . Los métodos de análisis de partículas individuales dependen, en general, de que la muestra sea homogénea, aunque se están desarrollando técnicas para abordar la heterogeneidad conformacional [5] .
Las imágenes (micrografías) se toman con un microscopio electrónico utilizando detectores de dispositivos de carga acoplada (CCD) acoplados a una capa fosforescente (en el pasado, se recogían en película y se digitalizaban mediante escáneres de alta calidad). El procesamiento de imágenes se lleva a cabo utilizando programas de software especializados, a menudo ejecutados en grupos de computadoras multiprocesador . Dependiendo de la muestra o de los resultados deseados, se pueden realizar varios pasos de procesamiento bidimensional o tridimensional.
Además, el análisis de partículas individuales también se puede realizar en modo de partículas individuales utilizando una unidad ICP-MS.
Las muestras biológicas, y especialmente las muestras incrustadas en hielo vítreo fino , son muy sensibles a la radiación, por lo que sólo se pueden utilizar dosis bajas de electrones para obtener imágenes de la muestra. Esta baja dosis, así como las variaciones en el tinte metálico utilizado (si se utiliza) [6] significa que las imágenes tienen un alto ruido en relación con la señal dada por la partícula que se observa. Al alinear varias imágenes similares entre sí para que estén registradas y luego promediarlas, se puede obtener una imagen con una relación señal-ruido más alta. Como el ruido se distribuye mayoritariamente de forma aleatoria y las características de la imagen subyacente son constantes, al promediar la intensidad de cada píxel en varias imágenes solo se refuerzan las características constantes. Normalmente, la alineación óptima (una traslación y una rotación en el plano) para asignar una imagen a otra se calcula mediante correlación cruzada .
Sin embargo, una micrografía a menudo contiene partículas en múltiples orientaciones y/o conformaciones diferentes y, por lo tanto, para obtener promedios de imágenes más representativos, se requiere un método para agrupar imágenes de partículas similares en múltiples conjuntos. Esto normalmente se lleva a cabo utilizando uno de varios algoritmos de análisis de datos y clasificación de imágenes, como el análisis estadístico multivariado y la clasificación jerárquica ascendente, o agrupamiento de k -medias . [ cita necesaria ]
A menudo se utilizan conjuntos de datos de decenas de miles de imágenes de partículas, y para alcanzar una solución óptima se utiliza un procedimiento iterativo de alineación y clasificación, mediante el cual fuertes promedios de imágenes producidos por la clasificación se utilizan como imágenes de referencia para una alineación posterior de todo el conjunto de datos. .
El filtrado de imágenes ( filtrado de paso de banda ) se utiliza a menudo para reducir la influencia de información de frecuencia espacial alta y/o baja en las imágenes, que puede afectar los resultados de los procedimientos de alineación y clasificación. Esto es particularmente útil en imágenes de tinciones negativas . Los algoritmos utilizan transformadas rápidas de Fourier ( FFT ), a menudo empleando máscaras de bordes suaves con forma gaussiana en un espacio recíproco para suprimir ciertos rangos de frecuencia. Los filtros de paso alto eliminan las frecuencias espaciales bajas (como los efectos de rampa o gradiente), dejando intactas las frecuencias más altas. Los filtros de paso bajo eliminan características de alta frecuencia espacial y tienen un efecto borroso en los detalles finos.
Debido a la naturaleza de la formación de imágenes en el microscopio electrónico, las imágenes TEM de campo brillante se obtienen utilizando un subenfoque significativo . Esto, junto con las características inherentes al sistema de lentes del microscopio, crea imágenes borrosas visibles como una función de dispersión de puntos . Los efectos combinados de las condiciones de imagen se conocen como función de transferencia de contraste (CTF) y pueden aproximarse matemáticamente como una función en el espacio recíproco. Las técnicas especializadas de procesamiento de imágenes, como el cambio de fase y la corrección de amplitud/ filtrado de Wiener, pueden (al menos parcialmente) [7] corregir el CTF y permitir reconstrucciones de alta resolución.
Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión son proyecciones del objeto que muestran la distribución de la densidad a través del objeto, similar a las radiografías médicas. Al hacer uso del teorema del corte de proyección, se puede generar una reconstrucción tridimensional del objeto combinando muchas imágenes (proyecciones 2D) del objeto tomadas desde una variedad de ángulos de visión. Idealmente, las proteínas en el hielo vítreo adoptan una distribución aleatoria de orientaciones (o ángulos de visión), lo que permite una reconstrucción bastante isotrópica si se utiliza una gran cantidad de imágenes de partículas. Esto contrasta con la tomografía electrónica , donde los ángulos de visión están limitados debido a la geometría de la muestra/imagen configurada, lo que proporciona una reconstrucción anisotrópica . La retroproyección filtrada es un método comúnmente utilizado para generar reconstrucciones 3D en análisis de partículas individuales, aunque existen muchos algoritmos alternativos. [3]
Antes de poder realizar una reconstrucción, es necesario estimar la orientación del objeto en cada imagen. Se han desarrollado varios métodos para calcular los ángulos relativos de Euler de cada imagen. Algunos se basan en líneas comunes (proyecciones 1D y sinogramas comunes ), otros utilizan algoritmos iterativos de coincidencia de proyecciones. Este último funciona comenzando con un modelo inicial 3D simple de baja resolución, compara las imágenes experimentales con proyecciones del modelo y crea un nuevo 3D para avanzar hacia una solución.
También hay métodos disponibles para realizar reconstrucciones 3D de muestras helicoidales (como el virus del mosaico del tabaco ), aprovechando la simetría helicoidal inherente . Para estas muestras se pueden utilizar tanto métodos de espacio real (tratando secciones de la hélice como partículas individuales) como métodos de espacio recíproco (usando patrones de difracción).
La platina de muestra del microscopio se puede inclinar (normalmente a lo largo de un solo eje), lo que permite la técnica de una sola partícula conocida como inclinación cónica aleatoria. [8] Se toma una imagen de un área de la muestra con inclinación cero y alta (~60-70 grados), o en el caso del método relacionado de reconstrucción de inclinación ortogonal, [9] +45 y −45 grados. Se seleccionan pares de partículas correspondientes al mismo objeto en dos inclinaciones diferentes (pares de inclinación) y, siguiendo los parámetros utilizados en los pasos posteriores de alineación y clasificación, se puede generar una reconstrucción tridimensional con relativa facilidad. Esto se debe a que el ángulo de visión (definido como tres ángulos de Euler ) de cada partícula se conoce a partir de la geometría de inclinación.
Las reconstrucciones 3D a partir de una inclinación cónica aleatoria adolecen de información faltante como resultado de un rango restringido de orientaciones. Conocido como el cono faltante [10] (debido a la forma en el espacio recíproco), esto provoca distorsiones en los mapas 3D. Sin embargo, el problema del cono faltante a menudo puede solucionarse combinando varias reconstrucciones de inclinación. Los métodos de inclinación son más adecuados para muestras teñidas negativamente y pueden usarse para partículas que se adsorben en la película de soporte de carbono en orientaciones preferidas. El fenómeno conocido como carga o movimiento inducido por haz [11] dificulta la recopilación de imágenes de gran inclinación de muestras en hielo vítreo.
Hay varios programas de software disponibles que permiten ver los mapas en 3D. Estos a menudo permiten al usuario acoplar manualmente coordenadas de proteínas (estructuras de cristalografía de rayos X o RMN) de subunidades en la densidad de electrones. Varios programas también pueden ajustarse a subunidades computacionalmente. [12] [13]
Para estructuras de mayor resolución, es posible construir la macromolécula directamente, sin conocimientos estructurales previos procedentes de otros métodos. También se han desarrollado algoritmos informáticos para esta tarea. [14]
Como los modelos crio-EM de alta resolución son relativamente nuevos, las herramientas de control de calidad no son tan abundantes como lo son para los modelos de rayos X. Sin embargo, las versiones crio-EM ("espacio real") del mapa de densidad de diferencia , [15] validación cruzada utilizando un mapa "libre" (comparable al uso de un factor R libre ), [16] [17] y Han comenzado a aparecer diversas herramientas de validación de estructuras .
La espectroscopía de masas de plasma acoplado inducida por partículas individuales (SP-ICP-MS) se utiliza en varias áreas donde existe la posibilidad de detectar y cuantificar partículas suspendidas en muestras de fluidos ambientales, evaluar su migración, evaluar el tamaño de las partículas y su distribución. , y también determinar su estabilidad en un entorno determinado. SP-ICP-MS fue diseñado para suspensiones de partículas en 2000 por Claude Degueldre. Probó por primera vez esta nueva metodología en el Instituto Forel de la Universidad de Ginebra y presentó este nuevo enfoque analítico en el simposio 'Colloid 2oo2' durante la reunión de primavera de 2002 del EMRS, y en las actas de 2003. [18] Este estudio presenta la teoría de SP ICP-MS y los resultados de las pruebas realizadas con partículas de arcilla (montmorillonita), así como con otras suspensiones de coloides. Luego, este método fue probado en nanopartículas de dióxido de torio por Degueldre & Favarger (2004), [19] dióxido de circonio por Degueldre et al (2004) [20] y nanopartículas de oro, que se utilizan como sustrato en nanofarmacia, y publicado por Degueldre et al. otros (2006). [21] Posteriormente, el estudio de las nanopartículas y micropartículas de dióxido de uranio dio lugar a una publicación detallada, Ref. Degueldre et al (2006). [22] Desde 2010, el interés por SP ICP-MS se ha disparado.
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