Las DARPins (un acrónimo de proteínas repetidas de anquirina diseñadas ) son proteínas miméticas de anticuerpos genéticamente modificadas que normalmente exhiben una unión a proteínas diana altamente específica y de alta afinidad . Se derivan de proteínas repetidas anquirinas naturales , una de las clases más comunes de proteínas de unión en la naturaleza, que son responsables de diversas funciones como la señalización celular, la regulación y la integridad estructural de la célula. Los DARPin constan de al menos tres motivos o módulos repetidos , de los cuales los módulos más N y C-terminales se denominan "caps", ya que protegen el núcleo hidrofóbico de la proteína. El número de módulos internos se indica como número (p. ej. N1C, N2C, N3C,...) mientras que las tapas se indican con "N" o "C", respectivamente. La masa molecular de, por ejemplo, 14 o 18 kDa ( kilodaltons ) para DARPins repetidos de cuatro (N2C) o cinco (N3C) es bastante pequeña para un producto biológico (aproximadamente el 10% del tamaño de una IgG ).
Las DARPins constituyen una nueva clase de terapias de proteínas pequeñas potentes, específicas y versátiles, y se utilizan como herramientas de investigación en diversas aplicaciones de investigación, diagnóstico y terapéuticas . [1] Molecular Partners AG , una empresa biofarmacéutica en etapa clínica con varias moléculas DARPin en desarrollo clínico y preclínico, está actualmente persiguiendo el desarrollo propio de DARPins terapéuticos ( integración directa ). Athebio AG continúa mejorando el andamio DARPin para un enfoque de modelo de asociación . [2]
Además, las DARPin se pueden utilizar como chaperonas de cristalización para proteínas solubles y de membrana, incluidos los receptores acoplados a proteínas G (GPCR), ya sea como socios de unión o como fusiones rígidas a la proteína objetivo, un concepto que ahora se está extendiendo a la determinación de la estructura mediante crioEM. [3] [4] [5] [6]
La plataforma DARPin fue descubierta y desarrollada en el laboratorio de Andreas Plückthun en la Universidad de Zurich , Suiza , mientras estudiaba ingeniería y bibliotecas de anticuerpos recombinantes. [7] Las DARPins se derivan de proteínas anquirinas naturales, una clase de proteínas que media las interacciones proteína-proteína de alta afinidad en la naturaleza.
Las bibliotecas DARPin se diseñaron mediante alineamientos de secuencias de varios miles de motivos repetidos de anquirina natural (de aproximadamente 33 aminoácidos cada uno) combinados con diseño basado en estructuras y métodos de ADN recombinante . [7] Estas proteínas consisten en unidades estructurales repetitivas que forman un dominio proteico estable con una gran superficie potencial de interacción objetivo. Normalmente, los DARPin comprenden cuatro o cinco repeticiones, de las cuales la primera (repetición de limitación N) y la última (repetición de limitación C) sirven para proteger el núcleo de la proteína hidrofóbica del entorno acuoso. Los DARPin corresponden al tamaño promedio de los dominios de proteínas repetidas de anquirina naturales. Las proteínas con menos de tres repeticiones (es decir, las repeticiones de protección y una repetición interna) no forman una estructura terciaria lo suficientemente estable. [8] La masa molecular de un DARPin depende del número total de repeticiones, como se muestra en el siguiente cuadro:
Se han generado a nivel de ADN bibliotecas de DARPins con posibles residuos aleatorios de interacción objetivo, con diversidades de más de 10 12 variantes. A partir de estas bibliotecas, los bioquímicos pueden seleccionar DARPins para unirse al objetivo de elección con afinidad picomolar y la especificidad se puede seleccionar mediante la presentación de ribosomas [9] o la presentación de fagos [10] utilizando secuencias señal que permiten la secreción cotraduccional. [11] Las DARPins pueden diseñarse para actuar como agonistas de receptores , antagonistas , agonistas inversos , inhibidores de enzimas o aglutinantes de proteínas diana simples. [1]
Las DARPins se expresan en el citoplasma de Escherichia coli en niveles elevados (más de 10 g/l en fermentación, 1 g/l en matraz agitado) en forma soluble . [12] Las proteínas exhiben una alta estabilidad térmica y termodinámica ( punto medio de desnaturalización : generalmente desarrollo del equilibrio : ∆G > 9,5 kcal/mol ) que aumenta con el número de repeticiones. [7] [13] [14] Las DARPins son estables en el suero sanguíneo humano y pueden diseñarse para que no contengan epítopos de células T.
Debido a la alta especificidad, estabilidad, potencia y afinidad, así como a su arquitectura flexible, los DARPins tienen un modo de unión al cuerpo rígido . [1] [9] Las construcciones multiespecíficas o multivalentes obtenidas mediante fusión genética sugieren que las DARPin fusionadas tienen propiedades de unión similares a las de las DARPin de dominio único. [1] La ausencia de cisteínas en la estructura permite la ingeniería de cisteínas específicas del sitio, lo que permite el acoplamiento de sustancias químicas a la molécula dirigido al sitio. Se pueden introducir aminoácidos no naturales con el mismo fin. [15]
Potencialmente, DARPins puede proporcionar un beneficio clínico al superar las limitaciones de los enfoques terapéuticos convencionales, que generalmente se dirigen a una única vía de enfermedad y, por lo tanto, pueden comprometer la eficacia. En muchos casos, la complejidad de una enfermedad se debe a la desregulación de múltiples vías. La tecnología DARPin se puede aprovechar para generar rápidamente miles de "multi-DARPin" diferentes donde los dominios de unión están conectados (es decir, mediante enlazadores), lo que permite atacar varias vías de enfermedades. Los DARPins y multi-DARPins también se pueden fusionar con elementos que no son DARPin, como una toxina, [16] para generar terapias dirigidas, y su fabricación se ve facilitada por la resistencia de los DARPins contra la agregación. La diversidad de formatos y la solidez de los DARPin múltiples facilita un enfoque empírico (como mediante la detección basada en resultados) para identificar de manera eficiente los DARPin con actividad potencial en vías de enfermedades específicas.
Los beneficios potenciales de los DARPin se deben en gran medida a sus características estructurales y biofísicas. Se cree que su pequeño tamaño (14-18 kDa) permite una mayor penetración en los tejidos, y su alta potencia (<5-100 pM) hace que las DARPins sean activas en concentraciones bajas. [17] Las DARPins son solubles a >100 g/L, y su alta estabilidad y solubilidad se consideran propiedades deseables para los compuestos farmacológicos. Las DARPin se pueden producir de forma rápida y rentable (es decir, a partir de E. coli ). Sus propiedades farmacocinéticas (PK) se pueden ajustar mediante la fusión con moléculas que prolongan la vida media, como el polietilenglicol (PEG), o con DARPins que se unen a la albúmina sérica humana. Debido a sus propiedades biofísicas favorables, [1] los DARPin se consideran altamente desarrollables mediante procesos estándar y potencialmente exhiben un comportamiento de clase robusto.
Los DARPin se han utilizado como herramientas de investigación, [1] como agentes de diagnóstico [17] y como agentes terapéuticos. [18] [19] [20] [21] MP0112, el primer candidato a DARPin en la clínica, es un inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y entró en ensayos clínicos para el tratamiento de la degeneración macular húmeda relacionada con la edad (DMAE húmeda, también conocida como degeneración macular neovascular relacionada con la edad) [16] y edema macular diabético [22] a principios de 2010.
Actualmente, MP0112 se está investigando en tres ensayos clínicos diferentes. Los dos primeros ensayos son estudios de seguridad y eficacia de abicipar en pacientes con DMAE húmeda para establecer la comparabilidad entre pacientes japoneses y no japoneses. [18] [20] El tercer estudio tiene como objetivo probar la seguridad y eficacia de abicipar en pacientes con EMD. [19]
En julio de 2014, Molecular Partners inició un primer estudio en humanos para investigar la seguridad, tolerabilidad y niveles en sangre de MP0250, un segundo candidato a DARPin, en pacientes con cáncer. [21]
Molecular Partners AG tiene varios DARPin adicionales en desarrollo preclínico con indicaciones potenciales en diversas áreas de enfermedades, incluidas oftalmología , oncología , inmunooncología e inmunología .