La ADP-ribosilación es la adición de uno o más restos de ADP-ribosa a una proteína . [1] [2] Es una modificación postraduccional reversible que está involucrada en muchos procesos celulares, incluida la señalización celular , la reparación del ADN , la regulación genética y la apoptosis . [3] [4] La ribosilación inadecuada de ADP se ha implicado en algunas formas de cáncer. [5] También es la base de la toxicidad de compuestos bacterianos como la toxina del cólera , la toxina de la difteria y otros. [6]
La primera sugerencia de ribosilación de ADP surgió a principios de la década de 1960. En ese momento, Pierre Chambon y sus compañeros observaron la incorporación de ATP en el extracto de núcleos de hígado de gallina. [7] Después de extensos estudios sobre la fracción insoluble en ácido, varios laboratorios de investigación diferentes pudieron identificar la ADP-ribosa , derivada de NAD + , como el grupo incorporado. Varios años más tarde, se identificaron las enzimas responsables de esta incorporación y se les dio el nombre de poli(ADP-ribosa)polimerasa. Originalmente, se pensaba que este grupo era una secuencia lineal de unidades ADP-ribosa unidas covalentemente a través de un enlace glicosídico de ribosa. Más tarde se informó que la ramificación puede ocurrir cada 20 a 30 residuos de ADP. [8]
La primera aparición de la mono(ADP-ribosil)ación se produjo un año después, durante un estudio sobre toxinas: se demostró que la toxina diftérica de Corynebacterium diphtheriae dependía del NAD + para ser completamente eficaz, [9] lo que llevó a la descubrimiento de la conjugación enzimática de un único grupo ADP-ribosa por la mono(ADP-ribosil)transferasa.
Inicialmente se pensó que la ribosilación de ADP era una modificación postraduccional implicada únicamente en la regulación genética. Sin embargo, a medida que se descubrieron más enzimas con capacidad de ribosilar ADP proteínas, la naturaleza multifuncional de la ribosilación de ADP se hizo evidente. La primera enzima de mamíferos con actividad poli(ADP-ribosa)transferasa se descubrió a finales de los años 1980. Durante los siguientes 15 años, se pensó que era la única enzima capaz de añadir una cadena de ADP-ribosa en células de mamíferos. [10] A finales de la década de 1980, se descubrieron las ADP-ribosil ciclasas, que catalizan la adición de grupos ADP-ribosa cíclico a las proteínas. Finalmente, se descubrió que las sirtuinas , una familia de enzimas que también poseen actividad de desacilación dependiente de NAD + , también poseen actividad mono(ADP-ribosil)transferasa. [11] [12]
La fuente de ADP-ribosa para la mayoría de las enzimas que realizan esta modificación es el cofactor redox NAD + . En esta reacción de transferencia, se escinde el enlace N -glucosídico del NAD + que une la molécula de ADP-ribosa y el grupo nicotinamida, seguido del ataque nucleofílico de la cadena lateral del aminoácido objetivo. Las (ADP-ribosil)transferasas pueden realizar dos tipos de modificaciones: mono(ADP-ribosil)ación y poli(ADP-ribosil)ación.
Las mono(ADP-ribosil)transferasas comúnmente catalizan la adición de ADP-ribosa a las cadenas laterales de arginina utilizando un motivo RS-EXE altamente conservado de la enzima. [13] La reacción procede rompiendo el enlace entre la nicotinamida y la ribosa para formar un ion oxonio . A continuación, la cadena lateral de arginina de la proteína objetivo actúa como nucleófilo, atacando el carbono electrófilo adyacente al ion oxonio. Para que se produzca este paso, el nucleófilo de arginina es desprotonado por un residuo de glutamato en la enzima catalizadora [ disputado ] . Otro residuo de glutamato conservado forma un enlace de hidrógeno con uno de los grupos hidroxilo de la cadena de ribosa para facilitar aún más este ataque nucleofílico. Como resultado de la reacción de escisión, se libera nicotinamida. La modificación puede revertirse mediante (ADP-ribosil)hidrolasas, que escinden el enlace N -glucosídico entre la arginina y la ribosa para liberar ADP-ribosa y proteína no modificada; NAD + no se restaura mediante la reacción inversa.
Las poli(ADP-ribosa)polimerasas (PARP) se encuentran principalmente en eucariotas y catalizan la transferencia de múltiples moléculas de ADP-ribosa a proteínas diana. Al igual que con la mono(ADP-ribosil)ación, la fuente de ADP-ribosa es NAD + . Los PARP utilizan una tríada catalítica de His-Tyr-Glu para facilitar la unión de NAD + y el posicionamiento del extremo de la cadena de poli(ADP-ribosa) existente en la proteína diana; el Glu facilita la catálisis y la formación de un enlace O -glucosídico (1''→2') entre dos moléculas de ribosa. Hay varias otras enzimas que reconocen cadenas de poli(ADP-ribosa), las hidrolizan o forman ramificaciones; se han anotado más de 800 proteínas que contienen el motivo de unión de poli(ADP-ribosa) vagamente definido; por lo tanto, además de que esta modificación altera la conformación y estructura de la proteína objetivo, también puede usarse como etiqueta para reclutar otras proteínas o para la regulación de la proteína objetivo. [14]
Se han descrito muchas cadenas laterales de aminoácidos diferentes como aceptores de ADP-ribosa. Desde una perspectiva química, esta modificación representa la glicosilación de proteínas : la transferencia de ADP-ribosa se produce a cadenas laterales de aminoácidos con oxígeno, nitrógeno o azufre nucleofílicos, lo que da como resultado un enlace glicosídico N , O o S a la ribosa de la ADP-ribosa. [15] Originalmente, los aminoácidos ácidos ( glutamato y aspartato ) se describieron como los principales sitios de ribosilación del ADP. Sin embargo, muchos otros sitios aceptores de ADP-ribosa como serina , [16] [17] arginina , [18] cisteína , [19] lisina , [20] diftamida , [21] fosfoserina , [22] y asparagina [23] tienen identificados en trabajos posteriores.
Durante el daño del ADN o el estrés celular, los PARP se activan, lo que provoca un aumento en la cantidad de poli (ADP-ribosa) y una disminución en la cantidad de NAD + . [24] Durante más de una década se pensó que PARP1 era la única poli(ADP-ribosa)polimerasa en células de mamíferos, por lo que esta enzima ha sido la más estudiada. Las caspasas son una familia de cisteína proteasas que se sabe que desempeñan un papel esencial en la muerte celular programada . Esta proteasa escinde PARP-1 en dos fragmentos, dejándolo completamente inactivo, para limitar la producción de poli(ADP-ribosa). Uno de sus fragmentos migra desde el núcleo al citoplasma y se cree que se convierte en un objetivo de la autoinmunidad.
Durante la apoptosis independiente de caspasa , también llamada parthanatos, la acumulación de poli(ADP-ribosa) puede ocurrir debido a la activación de PARP o la inactivación de la poli(ADP-ribosa)glicohidrolasa , una enzima que hidroliza la poli(ADP-ribosa) para producir ADP-libre. ribosa. Los estudios han demostrado que la poli (ADP-ribosa) impulsa la translocación de la proteína del factor inductor de apoptosis al núcleo, donde mediará en la fragmentación del ADN . Se ha sugerido que si ocurriera una falla en la activación de caspasas en condiciones de estrés, se produciría necroptosis. La sobreactivación de las PARP ha provocado una muerte celular necrótica regulada por la proteína del factor de necrosis tumoral . Aunque aún no se comprende el mecanismo, se ha demostrado que los inhibidores de PARP afectan la necroptosis. [25]
La ribosilación de ADP puede afectar la expresión genética en casi todos los niveles de regulación, incluida la organización de la cromatina, el reclutamiento y unión del factor de transcripción y el procesamiento del ARNm.
La organización de los nucleosomas es clave para la regulación de la expresión genética: el espaciamiento y la organización de los nucleosomas cambian las regiones del ADN que están disponibles para que la maquinaria de transcripción se una y transcriba el ADN. Se ha demostrado que PARP1 , una poli-ADP ribosa polimerasa, afecta la estructura de la cromatina y promueve cambios en la organización de los nucleosomas mediante la modificación de histonas .
Se ha demostrado que los PARP afectan la estructura de los factores de transcripción y provocan el reclutamiento de muchos factores de transcripción para formar complejos en el ADN y provocar la transcripción. También se ha demostrado que las mono(ADP-ribosil)transferasas afectan la unión del factor de transcripción en los promotores. Por ejemplo, se ha demostrado que PARP14, una mono (ADP-ribosil)transferasa, afecta la unión del factor de transcripción STAT .
Se ha demostrado que otras (ADP-ribosil)transferasas modifican las proteínas que se unen al ARNm , lo que puede provocar el silenciamiento de la transcripción de ese gen. [26]
Las poli (ADP-ribosa) polimerasas (PARP) pueden funcionar en la reparación del ADN de roturas de una sola cadena y de doble cadena. En la reparación de roturas de una sola hebra ( reparación por escisión de base ), el PARP puede facilitar la eliminación de un azúcar oxidado o la escisión de la hebra. PARP1 une las roturas de una sola hebra y acerca los intermedios de reparación por escisión de la base cercanos. Estos intermediarios incluyen XRCC1 y APLF y pueden reclutarse directamente o mediante el dominio PBZ de APLF. [27] Esto conduce a la síntesis de poli (ADP-ribosa). El dominio PBZ está presente en muchas proteínas implicadas en la reparación del ADN y permite la unión de PARP y, por tanto, la ribosilación de ADP, que recluta factores de reparación para que interactúen en el sitio de rotura. PARP2 responde secundariamente al daño del ADN, pero sirve para proporcionar redundancia funcional en la reparación del ADN. [28]
Existen muchos mecanismos para la reparación del ADN bicatenario dañado. PARP1 puede funcionar como un factor de sinapsis en la unión de extremos alternativos no homólogos. Además, se ha propuesto que PARP1 es necesario para ralentizar las bifurcaciones de replicación después de un daño en el ADN y promueve la recombinación homóloga en las bifurcaciones de replicación que pueden ser disfuncionales. Es posible que PARP1 y PARP3 trabajen juntos en la reparación del ADN bicatenario y se ha demostrado que PARP3 es fundamental para la resolución de roturas de doble cadena. Existen dos hipótesis por las que coinciden PARP1 y PARP3. La primera hipótesis afirma que las dos (ADP-ribosil)transferasas sirven para funcionar para la inactividad de la otra. Si se pierde PARP3, se producen roturas de una sola cadena y, por tanto, el reclutamiento de PARP1. Una segunda hipótesis sugiere que las dos enzimas trabajan juntas; PARP3 cataliza la mono(ADP-ribosil)ación y la poli(ADP-ribosil)ación corta y sirve para activar PARP1. [28]
Los PARP tienen muchas dianas proteicas en el sitio del daño del ADN. La proteína KU y las DNA-PKcs son componentes de reparación de roturas de doble cadena con sitios desconocidos de ribosilación de ADP. Las histonas son otra proteína objetivo de las PARP. Todas las histonas centrales y la histona enlazadora H1 están ribosiladas con ADP después de un daño en el ADN. La función de estas modificaciones aún se desconoce, pero se ha propuesto que la ribosilación de ADP modula la estructura de la cromatina de orden superior en un esfuerzo por facilitar sitios más accesibles para que los factores de reparación migren al daño del ADN.
El sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) ocupa un lugar destacado en la degradación de proteínas. El proteasoma 26S consta de una subunidad catalítica (la partícula central 20S) y una subunidad reguladora (la tapa 19S). [29] Las cadenas de poliubiquitina marcan las proteínas para su degradación por el proteosoma, lo que provoca la hidrólisis de las proteínas marcadas en péptidos más pequeños.
Fisiológicamente, PI31 ataca el dominio catalítico 20S del proteasoma 26S, lo que resulta en una disminución de la actividad del proteasoma. (ADP-ribosil)transferasa Tankyrase (TNKS) causa ADP-ribosilación de PI31 que a su vez aumenta la actividad del proteosoma. La inhibición de las TNK muestra además el ensamblaje reducido del proteasoma 26S. Por lo tanto, la ribosilación de ADP promueve la actividad del proteasoma 26S tanto en células de Drosophila como en células humanas. [30]
La actividad de algunas enzimas está regulada por la ribosilación de ADP. Por ejemplo, la actividad de la dinitrogenasa-reductasa de Rodospirillum rubrum se desactiva mediante la ribosilación de ADP de un residuo de arginina y se reactiva mediante la eliminación del grupo ribosil ADP. [31]
PARP1 participa en la reparación por escisión de bases (BER), la reparación de roturas de una y dos cadenas y la estabilidad cromosómica. También participa en la regulación transcripcional al facilitar las interacciones proteína-proteína . PARP1 utiliza NAD + para realizar su función en la apoptosis. Si una PARP se vuelve hiperactiva, la célula tendrá niveles reducidos de cofactor NAD + así como niveles reducidos de ATP y, por lo tanto, sufrirá necrosis . Esto es importante en la carcinogénesis porque podría conducir a la selección de células deficientes en PARP1 (pero no agotadas) debido a su ventaja de supervivencia durante el crecimiento del cáncer. [32]
La susceptibilidad a la carcinogénesis bajo la deficiencia de PARP1 depende significativamente del tipo de daño en el ADN ocurrido. Hay muchas implicaciones de que varios PARP estén involucrados en la prevención de la carcinogénesis. Como se indicó anteriormente, PARP1 y PARP2 participan en la BER y la estabilidad cromosómica. PARP3 participa en la regulación del centrosoma . La tankirasa es otra polimerasa (ADP-ribosil) que participa en la regulación de la longitud de los telómeros . [5]
La inhibición de PARP1 también se ha estudiado ampliamente en terapias contra el cáncer. El mecanismo de acción de un inhibidor de PARP1 es mejorar el daño causado por la quimioterapia en el ADN canceroso al impedir la función reparadora de PARP1 en individuos con deficiencia de BRCA1/2.
PARP14 es otra enzima ribosiladora de ADP que ha sido bien estudiada con respecto a objetivos de terapia contra el cáncer; es un transductor de señal y activador de la proteína que interactúa con la transcripción STAT6 , y se demostró que está asociado con la agresividad de los linfomas de células B. [32]
Las exotoxinas bacterianas ADP-ribosilantes (bARE) transfieren covalentemente un resto ADP-ribosa de NAD + a proteínas diana de eucariotas infectados, para producir nicotinamida y un ion de hidrógeno libre. Los bARE se producen como precursores de enzimas y constan de dominios "A" y "B": el dominio "A" es responsable de la actividad de ribosilación de ADP; y el dominio "B" para la translocación de la enzima a través de la membrana de la célula. Estos dominios pueden existir conjuntamente en tres formas: primero, como cadenas polipeptídicas individuales con los dominios A y B unidos covalentemente; en segundo lugar, en complejos multiproteicos con dominios A y B unidos por interacciones no covalentes; y, tercero, en complejos multiproteicos con dominios A y B que no interactúan directamente, antes del procesamiento. [6]
Tras la activación, los bAREs ADP-ribosilan cualquier número de proteínas eucariotas; dicho mecanismo es crucial para la instigación de los estados patológicos asociados con la ribosilación de ADP. Las proteínas de unión a GTP , en particular, están bien establecidas en la fisiopatología de bAREs. Por ejemplo, el cólera y la enterotoxina termolábil se dirigen a la subunidad α de G de las proteínas heterotriméricas de unión a GTP . Como la subunidad α está ribosilada con ADP, se encuentra permanentemente en un estado "activo", unido a GTP; La activación posterior del AMP cíclico intracelular estimula la liberación de líquido e iones de las células epiteliales intestinales. Además, C. Botulinum C3 ADP-ribosila las proteínas de unión a GTP Rho y Ras , y la toxina pertussis ADP-ribosila Gi , Go y Gt. La toxina diftérica ADP-ribosilatos del factor de elongación ribosómica EF-2 , que atenúa la síntesis de proteínas. [6]
Hay una variedad de bacterias que emplean bARE en la infección: la toxina CARDS de Mycoplasma pneumoniae , la toxina del cólera de Vibrio cholerae ; enterotoxina termolábil de E. coli ; exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa ; toxina pertussis de B. pertussis ; toxina C3 de C. botulinum ; y toxina diftérica de Corynebacterium diphtheriae . [33]