Los sideróforos (del griego: "transportador de hierro") son compuestos quelantes de hierro pequeños y de alta afinidad que son secretados por microorganismos como bacterias y hongos. Ayudan al organismo a acumular hierro. [2] [3] [4] [5] Aunque ahora se está apreciando una gama cada vez más amplia de funciones de los sideróforos, [6] los sideróforos se encuentran entre los agentes de unión de Fe 3+ más fuertes (de mayor afinidad) conocidos. Los fitosideróforos son sideróforos producidos por plantas.
A pesar de ser uno de los elementos más abundantes en la corteza terrestre, el hierro no es fácilmente biodisponible. En la mayoría de los ambientes aeróbicos, como el suelo o el mar, el hierro existe en estado férrico (Fe 3+ ), que tiende a formar sólidos insolubles similares al óxido. Para ser efectivos, los nutrientes no solo deben estar disponibles, sino que deben ser solubles. [7] Los microbios liberan sideróforos para extraer el hierro de estas fases minerales mediante la formación de complejos solubles de Fe 3+ que pueden ser absorbidos por mecanismos de transporte activo . Muchos sideróforos son péptidos no ribosómicos , [3] [8] aunque varios se biosintetizan de forma independiente. [9]
Los sideróforos también son importantes para algunas bacterias patógenas para su adquisición de hierro. [3] [4] [10] En los huéspedes mamíferos, el hierro está fuertemente unido a proteínas como la hemoglobina , la transferrina , la lactoferrina y la ferritina . La estricta homeostasis del hierro conduce a una concentración libre de aproximadamente 10 −24 mol L −1 , [11] por lo tanto, existen grandes presiones evolutivas sobre las bacterias patógenas para obtener este metal. Por ejemplo, el patógeno del ántrax Bacillus anthracis libera dos sideróforos, bacilibactina y petrobactina , para eliminar el ion férrico de las proteínas que contienen hierro. Si bien se ha demostrado que la bacilibactina se une a la proteína del sistema inmunológico siderocalina , [12] se supone que la petrobactina evade el sistema inmunológico y se ha demostrado que es importante para la virulencia en ratones. [13]
Los sideróforos se encuentran entre los aglutinantes más fuertes conocidos para Fe 3+ , siendo la enterobactina uno de los más fuertes. [11] Debido a esta propiedad, han atraído el interés de la ciencia médica en la terapia de quelación de metales , y el sideróforo desferrioxamina B está ganando un uso generalizado en tratamientos para el envenenamiento por hierro y la talasemia . [14]
Además de los sideróforos, algunas bacterias patógenas producen hemóforos ( proteínas que eliminan la unión del hemo ) o tienen receptores que se unen directamente a las proteínas de hierro/hemo. [15] En los eucariotas, otras estrategias para mejorar la solubilidad y la absorción del hierro son la acidificación del entorno (por ejemplo, utilizada por las raíces de las plantas) o la reducción extracelular de Fe 3+ en iones Fe 2+ más solubles .
Los sideróforos suelen formar un complejo octaédrico estable hexadentado preferentemente con Fe 3+ en comparación con otros iones metálicos abundantes de origen natural, aunque si hay menos de seis átomos donantes, el agua también puede coordinarse. Los sideróforos más eficaces son los que tienen tres ligandos bidentados por molécula, formando un complejo hexadentado y provocando un cambio entrópico menor que el causado por la quelación de un único ion férrico con ligandos separados. [16] El Fe 3+ es un ácido de Lewis fuerte , que prefiere bases de Lewis fuertes como átomos de oxígeno aniónicos o neutros para coordinarse. Los microbios suelen liberar el hierro del sideróforo por reducción a Fe 2+ que tiene poca afinidad con estos ligandos. [8] [2]
Los sideróforos se clasifican generalmente según los ligandos utilizados para quelar el hierro férrico. Los principales grupos de sideróforos incluyen los catecolatos (fenolatos), hidroxamatos y carboxilatos (por ejemplo, derivados del ácido cítrico ). [3] El ácido cítrico también puede actuar como sideróforo. [17] La amplia variedad de sideróforos puede deberse a las presiones evolutivas ejercidas sobre los microbios para producir sideróforos estructuralmente diferentes que no pueden ser transportados por los sistemas de transporte activo específicos de otros microbios o, en el caso de patógenos, desactivados por el organismo huésped. [3] [10]
Ejemplos de sideróforos producidos por diversas bacterias y hongos :
Sideróforos de hidroxamato
Sideróforos catecolados
Ligandos mixtos
Ligandos de amino carboxilato
En el Apéndice 1 se presenta una lista completa de estructuras de sideróforos (más de 250) como referencia. [3]
En respuesta a la limitación de hierro en su entorno, los genes implicados en la producción y captación de sideróforos microbianos se desreprimen , lo que lleva a la fabricación de sideróforos y las proteínas de captación adecuadas. En las bacterias, los represores dependientes de Fe2 + se unen al ADN aguas arriba de los genes implicados en la producción de sideróforos a altas concentraciones intracelulares de hierro. A bajas concentraciones, Fe2 + se disocia del represor, que a su vez se disocia del ADN, lo que lleva a la transcripción de los genes. En las bacterias gramnegativas y grampositivas ricas en AT, esto suele estar regulado por el represor Fur (regulador de la captación férrica), mientras que en las bacterias grampositivas ricas en GC (p. ej., Actinomycetota ) es DtxR (represor de la toxina diftérica), llamado así porque la producción de la peligrosa toxina diftérica por Corynebacterium diphtheriae también está regulada por este sistema. [8]
A esto le sigue la excreción del sideróforo al entorno extracelular, donde actúa para secuestrar y solubilizar el hierro. [3] [18] [19] [20] Los sideróforos son luego reconocidos por receptores específicos de la célula en la membrana externa de la célula. [2] [3] [21] En hongos y otros eucariotas, el complejo Fe-sideróforo puede reducirse extracelularmente a Fe 2+ , mientras que en muchos casos todo el complejo Fe-sideróforo se transporta activamente a través de la membrana celular. En las bacterias gramnegativas, estos se transportan al periplasma a través de receptores dependientes de TonB y se transfieren al citoplasma mediante transportadores ABC . [3] [8] [16] [22]
Una vez en el citoplasma de la célula, el complejo sideróforo Fe 3+ suele reducirse a Fe 2+ para liberar el hierro, especialmente en el caso de ligandos sideróforos "más débiles" como los hidroxamatos y carboxilatos. La descomposición del sideróforo u otros mecanismos biológicos también pueden liberar hierro, [16] especialmente en el caso de catecolatos como la enterobactina férrica, cuyo potencial de reducción es demasiado bajo para agentes reductores como el dinucleótido de flavina y adenina , por lo que se necesita una degradación enzimática para liberar el hierro. [11]
Aunque en la mayoría de los suelos hay suficiente hierro para el crecimiento de las plantas, la deficiencia de hierro en las plantas es un problema en los suelos calcáreos , debido a la baja solubilidad del hidróxido de hierro (III) . Los suelos calcáreos representan el 30% de las tierras agrícolas del mundo. En tales condiciones, las plantas gramíneas (pastos, cereales y arroz) secretan fitosideróforos en el suelo, [23] un ejemplo típico es el ácido desoximuginéico. Los fitosideróforos tienen una estructura diferente a la de los sideróforos fúngicos y bacterianos, ya que tienen dos centros de unión de α-aminocarboxilato, junto con una sola unidad de α-hidroxicarboxilato. Esta última función bidentada proporciona a los fitosideróforos una alta selectividad para el hierro (III). Cuando se cultivan en un suelo deficiente en hierro, las raíces de las plantas gramíneas secretan sideróforos en la rizosfera. Al eliminar el hierro (III), el complejo hierro-fitosideróforo se transporta a través de la membrana citoplasmática utilizando un mecanismo de simporte de protones. [24] Luego, el complejo hierro (III) se reduce a hierro (II) y el hierro se transfiere a la nicotianamina , que, aunque es muy similar a los fitosideróforos, es selectiva para el hierro (II) y no es secretada por las raíces. [25] La nicotianamina transloca el hierro en el floema a todas las partes de la planta.
El hierro es un nutriente importante para la bacteria Pseudomonas aeruginosa , sin embargo, el hierro no es fácilmente accesible en el medio ambiente. Para superar este problema, P. aeruginosa produce sideróforos para unir y transportar el hierro. [26] Pero la bacteria que produce los sideróforos no necesariamente recibe el beneficio directo de la ingesta de hierro. Más bien, todos los miembros de la población celular tienen la misma probabilidad de acceder a los complejos hierro-sideróforo. La producción de sideróforos también requiere que la bacteria gaste energía. Por lo tanto, la producción de sideróforos puede verse como un rasgo altruista porque es beneficioso para el grupo local pero costoso para el individuo. Esta dinámica altruista requiere que cada miembro de la población celular contribuya por igual a la producción de sideróforos. Pero a veces pueden ocurrir mutaciones que resulten en que algunas bacterias produzcan menores cantidades de sideróforo. Estas mutaciones dan una ventaja evolutiva porque la bacteria puede beneficiarse de la producción de sideróforos sin sufrir el costo de energía. Por lo tanto, se puede asignar más energía al crecimiento. Los miembros de la población celular que pueden producir eficientemente estos sideróforos se denominan comúnmente cooperadores; los miembros que producen pocos o ningún sideróforo a menudo se denominan tramposos. [27] La investigación ha demostrado que cuando los cooperadores y los tramposos crecen juntos, los cooperadores tienen una disminución en la aptitud mientras que los tramposos tienen un aumento en la aptitud. Se observa que la magnitud del cambio en la aptitud aumenta con el aumento de la limitación de hierro. [28] Con un aumento en la aptitud, los tramposos pueden superar a los cooperadores; esto conduce a una disminución general en la aptitud del grupo, debido a la falta de suficiente producción de sideróforos.
En un estudio reciente [29] se ha explorado la producción de pioverdina (PVD), un tipo de sideróforo, en la bacteria Pseudomonas aeruginosa . Este estudio se centró en la construcción, modelado y simulación dinámica de la biosíntesis de PVD, [30] un factor de virulencia, a través de un enfoque sistémico. Este enfoque considera que la vía metabólica de síntesis de PVD está regulada por el fenómeno de quorum-sensing (QS), un sistema de comunicación celular que permite a las bacterias coordinar su comportamiento en función de su densidad poblacional.
El estudio demostró que a medida que aumenta el crecimiento bacteriano, también lo hace la concentración extracelular de moléculas de señalización QS , emulando así el comportamiento natural de P. aeruginosa PAO1. Para llevar a cabo este estudio, se construyó un modelo de red metabólica de P. aeruginosa basado en el modelo iMO1056, la anotación genómica de la cepa P. aeruginosa PAO1 y la vía metabólica de síntesis de PVD. Este modelo incluyó la síntesis de PVD, reacciones de transporte, intercambio y moléculas de señalización QS.
El modelo resultante, denominado CCBM1146, [31] demostró que el fenómeno QS influye directamente en el metabolismo de P. aeruginosa hacia la biosíntesis de PVD en función del cambio en la intensidad de la señal QS. Este trabajo es el primer informe in silico de un modelo integrador que comprende la red reguladora del gen QS y la red metabólica de P. aeruginosa, proporcionando una visión detallada de cómo la producción de pioverdina y sideróforos en Pseudomonas aeruginosa se ve influenciada por el fenómeno quorum-sensing .
Además, la P. aeruginosa intratumoral puede absorber hierro mediante la producción de pioverdina, que protege indirectamente a las células tumorales de la ferroptosis ('muerte de hierro'), lo que pone de relieve la necesidad de utilizar inductores de ferroptosis (tiostreptona) para el tratamiento del cáncer. [32]
Los sideróforos adquieren importancia en el nicho ecológico definido por la baja disponibilidad de hierro, siendo este uno de los factores críticos que limitan el crecimiento de prácticamente todos los microorganismos aeróbicos. Existen cuatro hábitats ecológicos principales: el suelo y las aguas superficiales, el agua marina, el tejido vegetal (patógenos) y el tejido animal (patógenos).
El suelo es una fuente rica de géneros bacterianos y fúngicos. Las especies Gram-positivas comunes son aquellas pertenecientes a Actinomycetales y especies de los géneros Bacillus , Arthrobacter y Nocardia . Muchos de estos organismos producen y secretan ferrioxaminas que conducen a la promoción del crecimiento no solo de los organismos productores, sino también de otras poblaciones microbianas que pueden utilizar sideróforos exógenos. Los hongos del suelo incluyen Aspergillus y Penicillium que producen predominantemente ferricromos. Este grupo de sideróforos consiste en hexapéptidos cíclicos y, en consecuencia, son altamente resistentes a la degradación ambiental asociada con la amplia gama de enzimas hidrolíticas que están presentes en el suelo húmico. [33] Los suelos que contienen material vegetal en descomposición poseen valores de pH tan bajos como 3-4. Bajo tales condiciones, los organismos que producen sideróforos hidroxamato tienen una ventaja debido a la extrema estabilidad ácida de estas moléculas. La población microbiana del agua dulce es similar a la del suelo, de hecho, muchas bacterias son eliminadas del suelo. Además, los lagos de agua dulce contienen grandes poblaciones de especies de Pseudomonas , Azomonas , Aeromonas y Alcaligenes . [34] A medida que los sideróforos se secretan en los alrededores, los depredadores bacterívoros, incluido Caenorhabditis elegans , pueden detectarlos , lo que resulta en la migración de nematodos hacia la presa bacteriana. [35]
A diferencia de la mayoría de las fuentes de agua dulce, los niveles de hierro en el agua de mar superficial son extremadamente bajos (1 nM a 1 μM en los 200 m superiores) y mucho más bajos que los de V, Cr, Co, Ni, Cu y Zn. Virtualmente todo este hierro está en el estado de hierro (III) y complejado con ligandos orgánicos. [36] Estos bajos niveles de hierro limitan la producción primaria de fitoplancton y han llevado a la Hipótesis del Hierro [37] donde se propuso que una afluencia de hierro promovería el crecimiento del fitoplancton y, por lo tanto, reduciría el CO 2 atmosférico . Esta hipótesis se ha probado en más de 10 ocasiones diferentes y en todos los casos, se produjeron floraciones masivas. Sin embargo, las floraciones persistieron durante períodos de tiempo variables. Una observación interesante realizada en algunos de estos estudios fue que la concentración de los ligandos orgánicos aumentó en un corto período de tiempo para igualar la concentración de hierro añadido, lo que implica un origen biológico y en vista de su afinidad por el hierro, posiblemente de naturaleza siderófora o similar a la de un sideróforo. [38] Significativamente, también se encontró que las bacterias heterotróficas aumentaron notablemente en número en las floraciones inducidas por hierro. Por lo tanto, existe el elemento de sinergismo entre el fitoplancton y las bacterias heterotróficas. El fitoplancton requiere hierro (proporcionado por sideróforos bacterianos), y las bacterias heterotróficas requieren fuentes de carbono distintas del CO2 ( proporcionadas por el fitoplancton).
La naturaleza diluida del ambiente marino pelágico promueve grandes pérdidas difusivas y hace que la eficiencia de las estrategias normales de absorción de hierro basadas en sideróforos sea problemática. Sin embargo, muchas bacterias marinas heterotróficas producen sideróforos, aunque con propiedades diferentes de las producidas por los organismos terrestres. Muchos sideróforos marinos son activos en la superficie y tienden a formar agregados moleculares, por ejemplo, aquachelinas. La presencia de la cadena de acilo graso hace que las moléculas tengan una alta actividad superficial y una capacidad para formar micelas . [39] Por lo tanto, cuando se secretan, estas moléculas se unen a las superficies y entre sí, lo que reduce la velocidad de difusión fuera del organismo secretor y mantiene una concentración local de sideróforos relativamente alta. El fitoplancton tiene altos requerimientos de hierro y, sin embargo, la mayoría (y posiblemente todos) no producen sideróforos. Sin embargo, el fitoplancton puede obtener hierro de los complejos sideróforos con la ayuda de reductasas unidas a la membrana [40] y, sin duda, del hierro (II) generado mediante la descomposición fotoquímica de sideróforos de hierro (III). Por lo tanto, una gran proporción del hierro (posiblemente todo el hierro) absorbido por el fitoplancton depende de la producción de sideróforos bacterianos. [41]
La mayoría de los patógenos de las plantas invaden el apoplasma liberando enzimas pectolíticas que facilitan la propagación del organismo invasor. Las bacterias infectan frecuentemente las plantas al ingresar al tejido a través de los estomas . Una vez ingresadas en la planta, se propagan y se multiplican en los espacios intercelulares. En el caso de las enfermedades vasculares bacterianas, la infección se propaga dentro de las plantas a través del xilema .
Una vez dentro de la planta, las bacterias necesitan poder recolectar hierro de los dos principales ligandos transportadores de hierro, la nicotianamina y el citrato. [42] Para ello, producen sideróforos, por lo que la enterobacteria Erwinia chrysanthemi produce dos sideróforos, crisobactina y acromobactina. [43] El grupo de patógenos vegetales Xanthomonas produce sideróforos de xantoferrina para recolectar el hierro. [44]
Al igual que en los humanos, las plantas también poseen proteínas de unión a sideróforos involucradas en la defensa del huésped, como el principal alérgeno del polen de abedul, Bet v 1 , que generalmente se secretan y poseen una estructura similar a la lipocalina . [41]
Las bacterias y hongos patógenos han desarrollado los medios de supervivencia en el tejido animal. Pueden invadir el tracto gastrointestinal ( Escherichia , Shigella y Salmonella ), el pulmón ( Pseudomonas , Bordetella , Streptococcus y Corynebacterium ), la piel ( Staphylococcus ) o el tracto urinario ( Escherichia y Pseudomonas ). Estas bacterias pueden colonizar heridas ( Vibrio y Staphylococcus ) y ser responsables de septicemias ( Yersinia y Bacillus ). Algunas bacterias sobreviven durante largos períodos de tiempo en orgánulos intracelulares, por ejemplo Mycobacterium (ver tabla). Debido a este riesgo continuo de invasión bacteriana y fúngica, los animales han desarrollado una serie de líneas de defensa basadas en estrategias inmunológicas, el sistema del complemento, la producción de proteínas de unión hierro-sideróforo y la "retirada" general de hierro. [45]
Existen dos tipos principales de proteínas de unión al hierro presentes en la mayoría de los animales que brindan protección contra la invasión microbiana: la protección extracelular se logra mediante la familia de proteínas transferrina y la protección intracelular se logra mediante la ferritina. La transferrina está presente en el suero en aproximadamente 30 μM y contiene dos sitios de unión al hierro, cada uno con una afinidad extremadamente alta por el hierro. En condiciones normales, está saturada en un 25-40%, lo que significa que cualquier hierro disponible libremente en el suero será eliminado inmediatamente, lo que evita el crecimiento microbiano. La mayoría de los sideróforos no pueden eliminar el hierro de la transferrina. Los mamíferos también producen lactoferrina, que es similar a la transferrina sérica pero posee una afinidad aún mayor por el hierro. [46] La lactoferrina está presente en los fluidos secretores, como el sudor, las lágrimas y la leche, lo que minimiza la infección bacteriana.
La ferritina está presente en el citoplasma de las células y limita el nivel de hierro intracelular a aproximadamente 1 μM. La ferritina es una proteína mucho más grande que la transferrina y es capaz de unir varios miles de átomos de hierro en una forma no tóxica. Los sideróforos no pueden movilizar directamente el hierro de la ferritina.
Además de estas dos clases de proteínas que se unen al hierro, una hormona, la hepcidina, participa en el control de la liberación de hierro de los enterocitos que absorben el hierro, los hepatocitos que lo almacenan y los macrófagos. [47] La infección provoca inflamación y la liberación de interleucina-6 (IL-6), que estimula la expresión de hepcidina. En los seres humanos, la producción de IL-6 da como resultado un bajo nivel de hierro sérico, lo que dificulta la infección por patógenos invasores. Se ha demostrado que dicha disminución del hierro limita el crecimiento bacteriano tanto en localizaciones extracelulares como intracelulares. [45]
Además de las tácticas de "retirada de hierro", los mamíferos producen una proteína de unión de hierro-sideróforo, la sideroquelina. La sideroquelina es un miembro de la familia de proteínas lipocalinas, que aunque diversa en secuencia, muestra un pliegue estructural altamente conservado, un barril β antiparalelo de 8 hebras que forma un sitio de unión con varias hebras β adyacentes. La siderocalina (lipocalina 2) tiene 3 residuos cargados positivamente también ubicados en el bolsillo hidrofóbico, y estos crean un sitio de unión de alta afinidad para el hierro (III)-enterobactina. [11] La siderocalina es un potente agente bacteriostático contra E. coli . Como resultado de la infección, es secretada tanto por macrófagos como por hepatocitos, y la enterobactina es eliminada del espacio extracelular.
Los sideróforos tienen aplicaciones en medicina para la terapia de sobrecarga de hierro y aluminio y antibióticos para una mejor focalización. [10] [48] [3] La comprensión de las vías mecanísticas de los sideróforos ha generado oportunidades para diseñar inhibidores de moléculas pequeñas que bloquean la biosíntesis de sideróforos y, por lo tanto, el crecimiento bacteriano y la virulencia en entornos con limitaciones de hierro. [49] [50]
Los sideróforos son útiles como fármacos para facilitar la movilización del hierro en los seres humanos, especialmente en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el hierro, debido a su alta afinidad por el hierro. Una aplicación potencialmente poderosa es utilizar las capacidades de transporte de hierro de los sideróforos para llevar fármacos a las células mediante la preparación de conjugados entre sideróforos y agentes antimicrobianos. Debido a que los microbios reconocen y utilizan solo ciertos sideróforos, se prevé que dichos conjugados tengan una actividad antimicrobiana selectiva. [10] [16] Un ejemplo es el antibiótico cefalosporínico cefiderocol . [51]
La administración de fármacos mediada por el transporte de hierro microbiano (sideróforos) hace uso del reconocimiento de los sideróforos como agentes de administración de hierro para que el microbio asimile los conjugados de sideróforo con fármacos unidos. Estos fármacos son letales para el microbio y provocan la apoptosis del microbio cuando asimila el conjugado de sideróforo. [10] Mediante la adición de los grupos funcionales de unión al hierro de los sideróforos a los antibióticos, su potencia ha aumentado considerablemente. Esto se debe al sistema de captación de hierro mediado por sideróforos de las bacterias.
Las poáceas (gramíneas), incluidas especies de importancia agrícola como la cebada y el trigo, son capaces de secuestrar hierro de manera eficiente mediante la liberación de fitosideróforos a través de sus raíces en la rizosfera circundante del suelo . [18] Los compuestos químicos producidos por microorganismos en la rizosfera también pueden aumentar la disponibilidad y la absorción de hierro. Las plantas como la avena son capaces de asimilar el hierro a través de estos sideróforos microbianos. Se ha demostrado que las plantas son capaces de utilizar los sideróforos de tipo hidroxamato ferricromo, ácido rodotorúlico y ferrioxamina B; los sideróforos de tipo catecol, agrobactina; y los sideróforos de ligando mixto catecol-hidroxamato-hidroxiácido biosintetizados por bacterias saprofitas colonizadoras de raíces. Todos estos compuestos son producidos por cepas bacterianas rizosféricas, que tienen requisitos nutricionales simples, y se encuentran en la naturaleza en suelos, follaje, agua dulce, sedimentos y agua de mar. [52]
Las pseudomonas fluorescentes han sido reconocidas como agentes de biocontrol contra ciertos patógenos vegetales transmitidos por el suelo. Producen pigmentos de color verde amarillento ( pioverdinas ) que fluorescen bajo la luz ultravioleta y funcionan como sideróforos. Privan a los patógenos del hierro necesario para su crecimiento y patogénesis. [53]
Los sideróforos, naturales o sintéticos, pueden formar quelatos con otros iones metálicos además de los iones de hierro. Algunos ejemplos son el aluminio , [2] [21 ] [ 52 ] [54] el galio , [2] [21] [52] [54] el cromo , [21] [52] el cobre , [21] [52] [ 54] el cinc , [21] [54] el plomo , [21] el manganeso , [21 ] el cadmio , [ 21] el vanadio , [21] el circonio , [55] el indio , [21] [54] el plutonio , [56] el berkelio , el californio , [57] y el uranio . [56]
Los medios alternativos para asimilar el hierro son la reducción de la superficie, la disminución del pH, la utilización del hemo o la extracción del metal en complejos proteicos. [2] Datos recientes sugieren que las bacterias marinas produjeron moléculas quelantes de hierro con propiedades similares a los sideróforos en condiciones de crecimiento que limitan el fosfato. En la naturaleza, el fosfato se une a diferentes tipos de minerales de hierro y, por lo tanto, se planteó la hipótesis de que las bacterias pueden utilizar moléculas similares a los sideróforos para disolver dicho complejo y acceder al fosfato. [58]
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