En la clonación molecular , un vector es cualquier partícula (por ejemplo, plásmidos , cósmidos , fagos Lambda ) utilizada como vehículo para transportar artificialmente una secuencia nucleica extraña , generalmente ADN, a otra célula , donde puede replicarse y/o expresarse . [1] Un vector que contiene ADN extraño se denomina ADN recombinante . Los cuatro tipos principales de vectores son plásmidos , vectores virales , cósmidos y cromosomas artificiales . De estos, los vectores más utilizados son los plásmidos. [2] Todos los vectores diseñados tienen en común un origen de replicación , un sitio de multiclonación y un marcador seleccionable .
El vector en sí mismo generalmente lleva una secuencia de ADN que consiste en un inserto (en este caso el transgén ) y una secuencia más grande que sirve como la "columna vertebral" del vector. El propósito de un vector que transfiere información genética a otra célula es típicamente aislar, multiplicar o expresar el inserto en la célula objetivo. Todos los vectores pueden usarse para clonar y, por lo tanto, son vectores de clonación , pero también hay vectores diseñados especialmente para clonar, mientras que otros pueden estar diseñados específicamente para otros fines, como la transcripción y la expresión de proteínas. Los vectores diseñados específicamente para la expresión del transgén en la célula objetivo se denominan vectores de expresión y generalmente tienen una secuencia promotora que impulsa la expresión del transgén. Los vectores más simples llamados vectores de transcripción solo pueden transcribirse pero no traducirse: pueden replicarse en una célula objetivo pero no expresarse, a diferencia de los vectores de expresión. Los vectores de transcripción se utilizan para amplificar su inserto.
La manipulación del ADN se lleva a cabo normalmente en vectores de E. coli , que contienen elementos necesarios para su mantenimiento en E. coli . Sin embargo, los vectores también pueden tener elementos que les permiten mantenerse en otro organismo, como células de levadura, de plantas o de mamíferos, y estos vectores se denominan vectores lanzadera . Dichos vectores tienen elementos bacterianos o virales que pueden transferirse al organismo huésped no bacteriano, sin embargo, también se han desarrollado otros vectores denominados vectores intragénicos para evitar la transferencia de cualquier material genético de una especie extraña. [3]
La inserción de un vector en la célula objetivo se denomina habitualmente transformación para las células bacterianas, [4] transfección para las células eucariotas, [5] aunque la inserción de un vector viral a menudo se denomina transducción. [6]
Los plásmidos son secuencias de ADN extracromosómico de doble cadena y generalmente circulares que son capaces de replicarse utilizando la maquinaria de replicación de la célula huésped. [7] Los vectores plasmídicos consisten minimalistamente en un origen de replicación que permite la replicación semiindependiente del plásmido en el huésped. Los plásmidos se encuentran ampliamente en muchas bacterias, por ejemplo en Escherichia coli , pero también se pueden encontrar en algunos eucariotas, por ejemplo en levaduras como Saccharomyces cerevisiae . [8] Los plásmidos bacterianos pueden ser conjugativos/transmisibles y no conjugativos:
Los plásmidos con características especialmente construidas se utilizan comúnmente en el laboratorio con fines de clonación . Estos plásmidos generalmente no son conjugativos, pero pueden tener muchas más características, en particular un " sitio de clonación múltiple " donde múltiples sitios de escisión de enzimas de restricción permiten la inserción de un inserto transgénico. Las bacterias que contienen los plásmidos pueden generar millones de copias del vector dentro de la bacteria en horas, y los vectores amplificados se pueden extraer de la bacteria para su posterior manipulación. Los plásmidos se pueden utilizar específicamente como vectores de transcripción y dichos plásmidos pueden carecer de secuencias cruciales para la expresión de proteínas. Los plásmidos utilizados para la expresión de proteínas, llamados vectores de expresión , incluirían elementos para la traducción de proteínas, como un sitio de unión al ribosoma , codones de inicio y de parada .
Los vectores virales son virus modificados genéticamente que contienen ADN o ARN viral modificado que se ha vuelto no infeccioso, pero que aún contiene promotores virales y el transgén, lo que permite la traducción del transgén a través de un promotor viral. Sin embargo, debido a que los vectores virales con frecuencia carecen de secuencias infecciosas, requieren virus auxiliares o líneas de empaquetamiento para la transfección a gran escala. Los vectores virales a menudo se diseñan para incorporar permanentemente el inserto en el genoma del huésped y, por lo tanto, dejar marcadores genéticos distintivos en el genoma del huésped después de incorporar el transgén. Por ejemplo, los retrovirus dejan un patrón de integración retroviral característico después de la inserción que es detectable e indica que el vector viral se ha incorporado al genoma del huésped.
Los cromosomas artificiales son cromosomas fabricados en el contexto de los cromosomas artificiales de levadura (YAC), los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) o los cromosomas artificiales humanos (HAC). Un cromosoma artificial puede llevar un fragmento de ADN mucho más grande que otros vectores. [9] Los YAC y los BAC pueden llevar un fragmento de ADN de hasta 300.000 nucleótidos de longitud. Tres requisitos estructurales de un cromosoma artificial incluyen un origen de replicación, un centrómero y secuencias finales teloméricas. [10]
La transcripción del gen clonado es un componente necesario del vector cuando se requiere la expresión del gen: un gen puede amplificarse a través de la transcripción para generar múltiples copias de ARNm , la plantilla sobre la cual se puede producir la proteína a través de la traducción. [11] Un mayor número de ARNm expresaría una mayor cantidad de proteína, y la cantidad de copias de ARNm que se generan depende del promotor utilizado en el vector. [12] La expresión puede ser constitutiva, lo que significa que la proteína se produce constantemente en segundo plano, o puede ser inducible por lo que la proteína se expresa solo bajo ciertas condiciones, por ejemplo, cuando se agrega un inductor químico. Estos dos tipos diferentes de expresión dependen de los tipos de promotor y operador utilizados.
Los promotores virales se utilizan a menudo para la expresión constitutiva en plásmidos y vectores virales porque normalmente fuerzan la transcripción constante en muchas líneas y tipos de células de manera confiable. [13] La expresión inducible depende de promotores que responden a las condiciones de inducción: por ejemplo, el promotor del virus del tumor mamario murino solo inicia la transcripción después de la aplicación de dexametasona y el promotor de choque térmico de Drosophila solo se inicia después de altas temperaturas.
Algunos vectores están diseñados únicamente para la transcripción, por ejemplo, para la producción de ARNm in vitro . Estos vectores se denominan vectores de transcripción. Es posible que carezcan de las secuencias necesarias para la poliadenilación y la terminación, por lo que no pueden utilizarse para la producción de proteínas.
Los vectores de expresión producen proteínas mediante la transcripción del inserto del vector seguida de la traducción del ARNm producido, por lo que requieren más componentes que los vectores más simples que solo se dedican a la transcripción. La expresión en diferentes organismos hospedadores requeriría elementos diferentes, aunque comparten requisitos similares, por ejemplo, un promotor para el inicio de la transcripción, un sitio de unión ribosomal para el inicio de la traducción y señales de terminación.
Los vectores de expresión eucariotas requieren secuencias que codifiquen:
Los vectores modernos construidos artificialmente contienen componentes esenciales que se encuentran en todos los vectores y pueden contener otras características adicionales que solo se encuentran en algunos vectores:
