En biología molecular , un inserto es un trozo de ADN que se inserta en un vector de ADN más grande mediante una técnica de ADN recombinante , como ligación o recombinación . Esto permite multiplicarlo, seleccionarlo, manipularlo o expresarlo en un organismo huésped . [1]
Los insertos pueden variar desde adiciones físicas de nucleótidos utilizando un sistema técnico o la adición de estructuras artificiales en una molécula mediante productos químicos mutagénicos , como bromuro de etidio o cristales.
Las inserciones en el genoma de un organismo normalmente se producen por causas naturales. Estas causas incluyen condiciones ambientales y procesos intracelulares. Los insertos ambientales van desde la exposición a radiaciones radiactivas como la ultravioleta , productos químicos mutagénicos o virus de ADN . Las inserciones intracelulares pueden ocurrir a través de cambios hereditarios en las células madre o errores en la replicación o reparación del ADN .
Se pueden utilizar técnicas de inserción de genes para mutaciones características en un organismo para una expresión génica fenotípica deseada . Un cambio de inserto genético se puede expresar en una gran variedad de extremos. Estas variantes pueden variar desde la pérdida o ganancia de la función proteica hasta cambios en la estructura física, es decir, el color del cabello o de los ojos. El objetivo de los cambios en la expresión se centra en una ganancia de función en las proteínas para la regulación [2] o en la terminación de la función celular para la prevención de enfermedades. [3] Los resultados de las variaciones dependen del lugar en el genoma donde se ubica la adición o mutación. El objetivo es aprender, comprender y posiblemente predecir la expresión del material genético en organismos mediante análisis físicos y químicos. Para ver los resultados de mutaciones genéticas, o inserciones, se pueden observar técnicas como la secuenciación de ADN , la electroforesis en gel , el inmunoensayo o la microscopía .
El campo se ha expandido significativamente desde la publicación en 1973 con los bioquímicos Stanley N. Cohen y Herbert W. Boyer utilizando la bacteria E. coli para aprender a cortar fragmentos, volver a unir diferentes fragmentos e insertar nuevos genes. [4] El campo se ha expandido enormemente en términos de precisión y exactitud desde entonces. Las computadoras y la tecnología han hecho que sea tecnológicamente más fácil lograr reducir el error y ampliar la comprensión en este campo. Computadoras con una alta capacidad de datos y cálculos que hicieron tangible el procesamiento del gran volumen de información, es decir, el uso de ChIP y secuencia de genes .
La reparación dirigida por homología (HDR) es una técnica que repara roturas o lesiones en las moléculas de ADN. La técnica más común para agregar inserciones a secuencias deseadas es el uso de recombinación homóloga. [5] Esta técnica tiene un requisito específico en el que el inserto solo se puede agregar después de que se haya introducido en el núcleo de la célula, que se puede agregar al genoma principalmente durante las fases G2 y S del ciclo celular . [6]
Edición de genes CRISPR basada en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR): Cas9 es una enzima que utiliza secuencias de genes [7] para ayudar a controlar, escindir y separar secuencias de ADN específicas que son complementarias a una secuencia CRISPR. [8] [9] Estas secuencias y enzimas se derivaron originalmente de bacteriófagos. [10] La importancia de esta técnica en el campo de la ingeniería genética es que brinda la capacidad de realizar una edición genética dirigida de manera altamente precisa y el factor de costo de esta técnica es bajo en comparación con otras herramientas. [11] [12] [13] La capacidad de insertar secuencias de ADN en el organismo es fácil y rápida, aunque puede generar problemas de expresión en organismos de mayor complejidad. [14] [15]
La nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción , TALEN, es un conjunto de enzimas de restricción que se crean para cortar las secuencias de ADN deseadas. [16] Estas enzimas se utilizan principalmente en combinación con CRISPR-CAS9, nucleasa de dedos de zinc o HDR. La razón principal de esto es la capacidad de estas enzimas de tener la precisión para cortar y separar la secuencia deseada dentro de un gen.
Las nucleasas con dedos de zinc son enzimas genéticamente modificadas que combinan la fusión de un dominio de unión al ADN con dedos de zinc en un dominio de escisión del ADN . Estos también se combinan con CRISPR-CAS9 o TALEN para obtener una adición o eliminación de una secuencia específica dentro del genoma de células y organismos más complejos. [17]
La pistola genética , también conocida como sistema de administración de partículas biolísticas, se utiliza para administrar transgenes, proteínas o ARN al interior de la célula. Utiliza un sistema de lanzamiento de microproyectiles que dispara partículas recubiertas de un metal pesado típico que tiene ADN de interés hacia las células a alta velocidad. El material genético penetrará en la célula y entregará el contenido en un área espacial. El uso de sistemas de lanzamiento de microproyectiles es una técnica conocida como biolística. [18]