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Gen reportero

Un diagrama de cómo se utiliza un gen reportero para estudiar una secuencia reguladora.

En biología molecular , un gen reportero (a menudo simplemente reportero ) es un gen que los investigadores adjuntan a una secuencia reguladora de otro gen de interés en bacterias , cultivos celulares , animales o plantas. Dichos genes se denominan reporteros porque las características que confieren a los organismos que los expresan se identifican y miden fácilmente, o porque son marcadores seleccionables . Los genes reporteros se utilizan a menudo como una indicación de si un determinado gen ha sido captado o expresado en la población de células u organismos.

Genes reporteros comunes

Para introducir un gen reportero en un organismo, los científicos colocan el gen reportero y el gen de interés en la misma construcción de ADN que se insertará en la célula u organismo. En el caso de las bacterias o células procariotas en cultivo, esto suele ser en forma de una molécula de ADN circular llamada plásmido . En el caso de los virus , esto se conoce como vector viral . Es importante utilizar un gen reportero que no se exprese de forma nativa en la célula u organismo en estudio, ya que la expresión del reportero se utiliza como marcador para la captación exitosa del gen de interés. [1]

Los genes reporteros de uso común que inducen características visualmente identificables generalmente involucran proteínas fluorescentes y luminiscentes . Los ejemplos incluyen el gen que codifica la proteína fluorescente verde de medusa (GFP), que hace que las células que la expresan brillen de color verde bajo luz azul o ultravioleta, [2] la enzima luciferasa , que cataliza una reacción con luciferina para producir luz, y la proteína fluorescente roja del gen dsRed  [fr] . [3] [4] [5] [6] [7] El gen GUS se ha utilizado comúnmente en plantas, pero la luciferasa y la GFP se están volviendo más comunes. [8] [9]

Un marcador común en las bacterias es el gen lacZ de E. coli , que codifica la proteína beta-galactosidasa . [10] Esta enzima hace que las bacterias que expresan el gen se vean azules cuando crecen en un medio que contiene el análogo de sustrato X-gal . Un ejemplo de un marcador seleccionable que también es un marcador en las bacterias es el gen de la acetiltransferasa de cloranfenicol (CAT), que confiere resistencia al antibiótico cloranfenicol . [11]

Ensayos de transformación y transfección

Muchos métodos de transfección y transformación –dos formas de expresar un gen extraño o modificado en un organismo– son eficaces sólo en un pequeño porcentaje de una población sometida a las técnicas. [13] [14] Por lo tanto, es necesario un método para identificar esos pocos eventos de captación de genes con éxito. Los genes reporteros utilizados de esta manera normalmente se expresan bajo su propio promotor (regiones de ADN que inician la transcripción génica) independientemente del del gen de interés introducido; el gen reportero puede expresarse de forma constitutiva (es decir, está "siempre activo") o de forma inducible con una intervención externa como la introducción de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) en el sistema de la β-galactosidasa. [10] Como resultado, la expresión del gen reportero es independiente de la expresión del gen de interés, lo que es una ventaja cuando el gen de interés sólo se expresa en determinadas condiciones específicas o en tejidos a los que es difícil acceder. [1]

En el caso de marcadores seleccionables como CAT, la población de bacterias transfectadas se puede cultivar en un sustrato que contenga cloranfenicol . Solo las células que hayan incorporado con éxito el constructo que contiene el gen CAT sobrevivirán y se multiplicarán en estas condiciones. [11]

Ensayos de expresión genética

Los genes reporteros se pueden utilizar para analizar la expresión de un gen de interés que normalmente es difícil de analizar cuantitativamente. [1] Los genes reporteros pueden producir una proteína que tiene poco efecto obvio o inmediato en el cultivo celular o el organismo. Lo ideal es que no estén presentes en el genoma nativo para poder aislar la expresión del gen reportero como resultado de la expresión del gen de interés. [1] [15]

Para activar los genes reporteros, se pueden expresar de forma constitutiva , donde se unen directamente al gen de interés para crear una fusión génica . [16] Este método es un ejemplo de uso de elementos que actúan en cis , donde los dos genes están bajo los mismos elementos promotores y se transcriben en una única molécula de ARN mensajero . Luego, el ARNm se traduce en proteína. Es importante que ambas proteínas puedan plegarse correctamente en sus conformaciones activas e interactuar con sus sustratos a pesar de estar fusionadas. Al construir el constructo de ADN, generalmente se incluye un segmento de ADN que codifica una región de enlace polipeptídica flexible para que el reportero y el producto génico solo interfieran mínimamente entre sí. [17] [18] Los genes reporteros también se pueden expresar por inducción durante el crecimiento. En estos casos, se utilizan elementos que actúan en trans , como factores de transcripción , para expresar el gen reportero. [19] [20]

Los ensayos de genes reporteros se han utilizado cada vez más en el cribado de alto rendimiento (HTS) para identificar inhibidores de moléculas pequeñas y activadores de dianas proteicas y vías para el descubrimiento de fármacos y la biología química . Debido a que las enzimas reporteras en sí mismas (por ejemplo, la luciferasa de luciérnaga ) pueden ser dianas directas de moléculas pequeñas y confundir la interpretación de los datos de HTS, se han desarrollado nuevos diseños de reporteros de coincidencia que incorporan supresión de artefactos. [21] [22]

Ensayos de promotores

Los genes indicadores pueden utilizarse para analizar la actividad de un promotor particular en una célula u organismo. [23] En este caso, no hay un "gen de interés" independiente; el gen indicador simplemente se coloca bajo el control del promotor objetivo y la actividad del producto del gen indicador se mide cuantitativamente. Los resultados normalmente se informan en relación con la actividad bajo un promotor "de consenso" que se sabe que induce una fuerte expresión génica. [24]

Usos adicionales

Un uso más complejo de los genes reporteros a gran escala es el cribado de dos híbridos , que tiene como objetivo identificar proteínas que interactúan de forma nativa entre sí in vivo . [25]

Véase también

Referencias

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  2. ^ van Thor, Jasper J.; Gensch, Thomas; Hellingwerf, Klaas J.; Johnson, Louise N. (enero de 2002). "La fototransformación de la proteína fluorescente verde con luz ultravioleta y visible conduce a la descarboxilación del glutamato 222". Nature Structural Biology . 9 (1): 37–41. doi :10.1038/nsb739. ISSN  1072-8368. PMID  11740505.
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