El sistema reportero GUS ( GUS : β-glucuronidasa ) es un sistema de genes reporteros , particularmente útil en biología molecular de plantas [1] y microbiología. [2] Hay varios tipos de ensayos de genes reporteros GUS disponibles, dependiendo del sustrato utilizado. El término tinción GUS se refiere al más común de estos, una técnica histoquímica .
El propósito de esta técnica es analizar la actividad de un promotor de transcripción génica (en términos de expresión de un denominado gen reportero bajo el control regulador de ese promotor) ya sea de manera cuantitativa, involucrando alguna medida de actividad, o cualitativamente (on versus off) a través de la visualización de su actividad en diferentes células, tejidos u órganos. La técnica utiliza el gen uidA de Escherichia coli , que codifica la enzima β-glucuronidasa ; [3] esta enzima, cuando se incuba con sustratos incoloros o no fluorescentes específicos , puede convertirlos en productos coloreados o fluorescentes estables. [4] La presencia del color inducido por GUS indica dónde se ha expresado activamente el gen. De esta manera, la actividad promotora fuerte produce mucha tinción y la actividad promotora débil produce menos tinción.
El gen uidA también se puede fusionar con un gen de interés, lo que crea una fusión génica . La inserción del gen uidA provocará la producción de GUS, que luego se puede detectar utilizando varios glucurónidos como sustratos. [4]
Existen diferentes glucurónidos posibles que pueden usarse como sustratos para la β-glucuronidasa, dependiendo del tipo de detección necesaria ( histoquímica , espectrofotométrica , fluorimétrica ). El sustrato más común para la tinción histoquímica de GUS es el 5-bromo-4-cloro-3-indolil glucurónido ( X-Gluc ). X-Gluc es hidrolizado por GUS en el producto 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-índigo (diX-índigo). DiX-índigo aparecerá azul y se puede ver usando microscopía óptica. [5] Este proceso es análogo a la hidrólisis de X-gal por Beta-galactosidasa [5] para producir células azules como se practica comúnmente en los ensayos de genes reporteros bacterianos.
Para otros tipos de detección, los sustratos comunes son el p-nitrofenil β-D-glucurónido para el ensayo espectrofotométrico y el 4-metilumbeliferil-beta-D-glucurónido (MUG) para el ensayo fluorimétrico. [6]
El sistema fue desarrollado originalmente por Richard Anthony Jefferson durante su doctorado en la Universidad de Colorado en Boulder . [7] Adaptó la técnica para su uso con plantas mientras trabajaba en el Plant Breeding Institute de Cambridge , entre 1985 y 1987. [1] Desde entonces, miles de laboratorios han utilizado el sistema, convirtiéndolo en una de las herramientas más utilizadas en biología molecular de plantas, como lo subrayan miles de citas en la literatura científica. [7]
Un organismo es adecuado para un ensayo GUS si carece de actividad β-glucuronidasa natural o si la actividad es muy baja ( actividad de fondo ). Por esta razón, el ensayo no es útil en la mayoría de los vertebrados y muchos moluscos . [6] Dado que no hay actividad GUS detectable en plantas superiores , musgos , algas , helechos , hongos y la mayoría de las bacterias , [6] el ensayo es ideal para estudios de expresión genética en estos organismos y se considera el gen reportero de elección en la ciencia vegetal.
El ensayo GUS no requiere la presencia de ningún cofactor o ion para su funcionamiento. La beta-glucuronidasa puede funcionar en un amplio rango de valores de pH y es bastante resistente a la inactivación térmica. [8] Sin embargo, la GUS es susceptible a la inhibición de ciertos iones de metales pesados, como Cu 2+ y Zn 2+ .
Además, la interpretación del ensayo está limitada por el movimiento del diX-índigo a través de la célula. El diX-índigo puede asociarse con lípidos para difundirse lejos del sitio de actividad enzimática, lo que muestra una falta de localización citosólica e irregularidad en la penetración del sustrato. Esto puede conducir potencialmente a una interpretación incorrecta de la localización de la proteína GUS. [9] A pesar de la falta de localización celular, se ha observado bien la localización nuclear de GUS. [10] Los ensayos de GUS se pueden realizar en presencia de ferricianuro de potasio para evitar que la tinción se difunda. [5]
El sistema GUS no es el único sistema de reportero de genes disponible para el análisis de la actividad promotora. Otros sistemas competitivos se basan, por ejemplo, en la luciferasa , la GFP , la beta-galactosidasa , la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) y la fosfatasa alcalina . El uso de uno u otro sistema depende principalmente del organismo de interés y de las tecnologías de imagen y microscopía disponibles en los laboratorios que realizan la investigación.
El ensayo GUS, así como otros sistemas de genes reporteros, se pueden utilizar para otros tipos de estudios distintos del ensayo clásico de actividad promotora. Los sistemas reporteros se han utilizado para la determinación de la eficiencia de los sistemas de administración de genes, la localización intracelular de un producto génico, la detección de interacciones proteína-proteína o proteína-ADN, la eficiencia de las señales de iniciación de la traducción y el éxito de los esfuerzos de clonación molecular.