La centrifugación es un proceso mecánico que implica el uso de la fuerza centrífuga para separar partículas de una solución según su tamaño, forma, densidad, viscosidad media y velocidad del rotor. [1] Los componentes más densos de la mezcla migran lejos del eje de la centrífuga , mientras que los componentes menos densos de la mezcla migran hacia el eje. Los químicos y biólogos pueden aumentar la fuerza gravitacional efectiva del tubo de ensayo para que el precipitado (gránulo) viaje rápida y completamente hasta el fondo del tubo. El líquido restante que se encuentra encima del precipitado se llama sobrenadante o sobrenadante.
Existe una correlación entre el tamaño y la densidad de una partícula y la velocidad a la que la partícula se separa de una mezcla heterogénea, cuando la única fuerza aplicada es la de la gravedad. Cuanto mayor sea el tamaño y la densidad de las partículas, más rápido se separarán de la mezcla. Al aplicar una fuerza gravitacional efectiva mayor a la mezcla, como lo hace una centrífuga, se acelera la separación de las partículas. Esto es ideal en entornos industriales y de laboratorio porque las partículas que se separarían naturalmente durante un largo período de tiempo se pueden separar en mucho menos tiempo. [2]
La velocidad de centrifugación se especifica mediante la velocidad angular generalmente expresada como revoluciones por minuto (RPM), o la aceleración expresada como g . El factor de conversión entre RPM y g depende del radio del rotor de la centrífuga. La velocidad de sedimentación de las partículas en la centrifugación es función de su tamaño y forma, la aceleración centrífuga, la fracción de volumen de sólidos presentes, la diferencia de densidad entre la partícula y el líquido y la viscosidad . La aplicación más común es la separación de sólidos de suspensiones altamente concentradas, que se utiliza en el tratamiento de lodos de depuradora para deshidratación donde se producen sedimentos menos consistentes. [3]
El método de centrifugación tiene una amplia variedad de aplicaciones industriales y de laboratorio; Este proceso no sólo se utiliza para separar dos sustancias miscibles, sino también para analizar las propiedades hidrodinámicas de macromoléculas. [4] Es uno de los métodos de investigación más importantes y comúnmente utilizados en bioquímica , biología celular y molecular . En las industrias química y alimentaria, las centrífugas especiales pueden procesar un flujo continuo de partículas convirtiéndolas en un líquido separado como el plasma. La centrifugación es también el método más común utilizado para el enriquecimiento de uranio , y se basa en la ligera diferencia de masa entre los átomos de U-238 y U-235 en el gas hexafluoruro de uranio . [5]
En una suspensión líquida, muchas partículas o células irán cayendo gradualmente al fondo del recipiente debido a la gravedad ; sin embargo, el tiempo necesario para dichas separaciones no es factible. Otras partículas, que son muy pequeñas, no pueden aislarse en absoluto en solución hasta que se exponen a una fuerza centrífuga elevada . A medida que la suspensión gira a una cierta velocidad o revoluciones por minuto (RPM), la fuerza centrífuga permite que las partículas se alejen radialmente del eje de rotación. La fórmula general para calcular las revoluciones por minuto (RPM) de una centrífuga es:
,
donde g representa la fuerza respectiva de la centrífuga yr el radio desde el centro del rotor hasta un punto de la muestra. [6]
Sin embargo, dependiendo del modelo de centrífuga utilizado, el ángulo respectivo del rotor y el radio pueden variar, por lo que la fórmula se modifica. Por ejemplo, el rotor Sorvall #SS-34 tiene un radio máximo de 10,8 cm, por lo que la fórmula se convierte en , que se puede simplificar aún más a . [6]
En comparación con la gravedad, la fuerza de las partículas se denomina "fuerza centrífuga relativa" (RCF). Es la fuerza perpendicular que se ejerce sobre el contenido del rotor como resultado de la rotación, siempre relativa a la gravedad de la tierra, la que mide la fuerza de rotores de diferentes tipos y tamaños. Por ejemplo, el RCF de 1000 xg significa que la fuerza centrífuga es 1000 veces más fuerte que la fuerza gravitacional terrestre. RCF depende de la velocidad de rotación en rpm y de la distancia de las partículas al centro de rotación. La fórmula más común utilizada para calcular el RCF es: [7]
,
donde es una constante; r es el radio, expresado en centímetros , entre el eje de rotación y el centro; y rpm es la velocidad en revoluciones por minuto. [7]
Históricamente, muchas separaciones se han realizado a la velocidad de 3000 rpm; Una guía aproximada de la fuerza 'g' ejercida a esta velocidad es multiplicar el radio de centrifugación por un factor de 10, por lo que un radio de 160 mm da aproximadamente 1600 x g. [8] Este es un enfoque bastante arbitrario, ya que la RCF aplicada depende linealmente del radio, por lo que un radio un 10 % mayor significa que se aplica una RCF un 10 % mayor a la misma velocidad. Aproximadamente, la fórmula anterior se puede simplificar a , con un error de sólo el 0,62%.
Las microcentrífugas son modelos de mesa especialmente diseñados con rotores ligeros y de pequeño volumen capaces de acelerar muy rápidamente hasta aproximadamente 17.000 rpm. Son dispositivos livianos que se utilizan principalmente para la centrifugación de corta duración de muestras de hasta aproximadamente 0,2 a 2,0 ml. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño, son fácilmente transportables y, si es necesario, pueden funcionar en una cámara frigorífica. [9] Pueden estar refrigerados o no. La microcentrífuga se utiliza normalmente en laboratorios de investigación donde se requiere que pequeñas muestras de moléculas biológicas, células o núcleos se sometan a una RCF alta durante intervalos de tiempo relativamente cortos. [9] Las microcentrífugas diseñadas para funcionamiento a alta velocidad pueden alcanzar hasta 35 000 rpm, lo que proporciona una RCF de hasta 30 000 × g, y se denominan microcentrífugas de alta velocidad. [10]
Las centrífugas de baja velocidad se utilizan para recolectar precipitados químicos, células intactas (animales, vegetales y algunos microorganismos), núcleos, cloroplastos, mitocondrias grandes y fragmentos más grandes de la membrana plasmática. En estas centrífugas también se procesan gradientes de densidad para purificar células. Los rotores de cuchara oscilante tienden a usarse ampliamente debido a la enorme flexibilidad del tamaño de la muestra mediante el uso de adaptadores. [9] Estas máquinas tienen velocidades máximas de rotor de menos de 10 000 rpm y varían desde pequeñas centrífugas de mesa hasta grandes centrífugas de suelo. [11]
Las centrífugas de alta velocidad se utilizan normalmente para recolectar microorganismos, virus , mitocondrias , lisosomas , peroxisomas y membranas tubulares de Golgi intactas. La mayoría de las tareas sencillas de granulación se realizan en rotores de ángulo fijo. Algunos trabajos de gradiente de densidad para purificar células y orgánulos se pueden realizar en rotores de cubo oscilante o, en el caso de gradientes de Percoll , en rotores de ángulo fijo. [9] Las centrífugas de alta velocidad o supervelocidad pueden manejar volúmenes de muestra más grandes, desde unas pocas decenas de mililitros hasta varios litros. Además, las centrífugas más grandes también pueden alcanzar velocidades angulares más altas (alrededor de 30.000 rpm). Los rotores pueden venir con diferentes adaptadores para sostener varios tamaños de tubos de ensayo , frascos o placas de microtitulación .
La ultracentrifugación utiliza una alta fuerza centrífuga para estudiar las propiedades de partículas biológicas a velocidades excepcionalmente altas. Las ultracentrífugas actuales pueden girar hasta 150.000 rpm (equivalente a 1.000.000 xg). [12] Se utilizan para recolectar todas las vesículas de membrana derivadas de la membrana plasmática, el retículo endoplásmico (RE) y la membrana de Golgi , endosomas , ribosomas , subunidades ribosómicas, plásmidos , ADN , ARN y proteínas en rotores de ángulo fijo. [9] En comparación con las microcentrífugas o las centrífugas de alta velocidad, las ultracentrífugas pueden aislar partículas mucho más pequeñas y, además, mientras que las microcentrífugas y supercentrífugas separan partículas en lotes (se deben manipular volúmenes limitados de muestras manualmente en tubos de ensayo o botellas), las ultracentrífugas pueden separar moléculas. en sistemas discontinuos o de flujo continuo.
La ultracentrifugación se emplea para la separación de macromoléculas/estudios cinéticos de unión de ligandos, la separación de diversas fracciones de lipoproteínas del plasma y la desprotonización de fluidos fisiológicos para el análisis de aminoácidos. [1]
Son las centrífugas más utilizadas para la purificación por gradiente de densidad de todas las partículas excepto las células y, aunque tradicionalmente se han utilizado cubos oscilantes para este fin, también se utilizan rotores de ángulo fijo y rotores verticales, especialmente para gradientes autogenerados y Puede mejorar enormemente la eficiencia de la separación. Hay dos tipos de ultracentrífugas: las analíticas y las preparativas.
La ultracentrifugación analítica (AUC) se puede utilizar para determinar las propiedades de macromoléculas como la forma, la masa, la composición y la conformación. Es una técnica de análisis biomolecular comúnmente utilizada para evaluar la pureza de la muestra, caracterizar los mecanismos de ensamblaje y desensamblaje de complejos biomoleculares , determinar estequiometrías de subunidades , identificar y caracterizar cambios conformacionales macromoleculares y calcular constantes de equilibrio y parámetros termodinámicos para autoasociación. y sistemas heteroasociativos. [13] Las ultracentrífugas analíticas incorporan un sistema de detección óptica de escaneo basado en luz visible / ultravioleta para monitorear en tiempo real el progreso de la muestra durante un giro. [14]
Las muestras se centrifugan con una solución de alta densidad como sacarosa , cloruro de cesio o yodixanol . La solución de alta densidad puede estar en una concentración uniforme en todo el tubo de ensayo ("colchón") o en una concentración variable (" gradiente "). Las propiedades moleculares se pueden modelar mediante análisis de velocidad de sedimentación o análisis de equilibrio de sedimentación. Durante el experimento, la partícula o moléculas migrarán a través del tubo de ensayo a diferentes velocidades dependiendo de sus propiedades físicas y de las propiedades de la solución, y eventualmente formarán un gránulo en el fondo del tubo o bandas a varias alturas.
Las ultracentrífugas preparativas se utilizan a menudo para separar partículas según sus densidades, aislar y/o recolectar partículas más densas para recogerlas en el pellet y clarificar suspensiones que contienen partículas. A veces, los investigadores también utilizan ultracentrífugas preparativas si necesitan flexibilidad para cambiar el tipo de rotor del instrumento. Las ultracentrífugas preparativas pueden equiparse con una amplia gama de diferentes tipos de rotores, que pueden hacer girar muestras de diferentes números, en diferentes ángulos y a diferentes velocidades. [14]
En la investigación biológica, el fraccionamiento celular generalmente incluye el aislamiento de componentes celulares conservando las funciones individuales de cada componente. Generalmente, la muestra de células se almacena en una suspensión que es:
La centrifugación es el primer paso en la mayoría de los fraccionamientos . Mediante centrifugación a baja velocidad, se pueden eliminar los restos celulares, dejando un sobrenadante que preserva el contenido de la célula. La centrifugación repetida a velocidades progresivamente más altas fraccionará los homogeneizados de células en sus componentes. En general, cuanto más pequeño es el componente subcelular, mayor es la fuerza centrífuga necesaria para sedimentarlo. [15] La fracción soluble de cualquier lisado puede luego separarse en sus constituyentes utilizando una variedad de métodos.
La centrifugación diferencial es el método más simple de fraccionamiento por centrifugación, [9] comúnmente utilizado para separar orgánulos y membranas que se encuentran en las células. Los orgánulos generalmente difieren entre sí en densidad y tamaño, lo que hace posible el uso de centrifugación diferencial y de la centrifugación en general. Luego, los orgánulos se pueden identificar mediante pruebas de indicadores que sean exclusivos de los orgánulos específicos. [6] La aplicación más utilizada de esta técnica es producir fracciones subcelulares crudas a partir de un homogeneizado de tejido como el del hígado de rata. [9] Las partículas de diferentes densidades o tamaños en una suspensión se sedimentan a diferentes velocidades, y las partículas más grandes y densas se sedimentan más rápido. Estas tasas de sedimentación se pueden aumentar mediante el uso de fuerza centrífuga. [dieciséis]
Una suspensión de células se somete a una serie de ciclos de fuerza centrífuga creciente para producir una serie de gránulos que comprenden células con una velocidad de sedimentación decreciente. El homogeneizado incluye núcleos, mitocondrias, lisosomas, peroxisomas, láminas de membrana plasmática y una amplia gama de vesículas derivadas de varios compartimentos de la membrana intracelular y también de la membrana plasmática, típicamente en un medio tamponado. [9]
Se sabe que la centrifugación en gradiente de densidad es uno de los métodos más eficientes para separar partículas suspendidas y se utiliza como técnica de separación y como método para medir la densidad de partículas o moléculas en una mezcla. [17]
Se utiliza para separar partículas según su tamaño, forma y densidad mediante el uso de un medio de densidades graduadas. Durante una centrifugación relativamente corta o lenta, las partículas se separan por tamaño, y las partículas más grandes se sedimentan a mayor distancia que las más pequeñas. Durante una centrifugación larga o rápida, las partículas viajan a lugares en el gradiente donde la densidad del medio es la misma que la densidad de las partículas; (ρp – ρm) → 0. Por lo tanto, una partícula pequeña y densa inicialmente sedimenta con menos facilidad que una partícula grande y de baja densidad. Las partículas grandes alcanzan temprano su posición de densidad de equilibrio, mientras que las partículas pequeñas migran lentamente a través de la zona de partículas grandes y finalmente toman una posición de equilibrio más profundamente en el gradiente. [18]
Un tubo, después de ser centrifugado por este método, tiene partículas en orden de densidad según la altura. El objeto o partícula de interés residirá en la posición dentro del tubo correspondiente a su densidad. [19] Sin embargo, algunas sedimentaciones no ideales todavía son posibles cuando se utiliza este método. El primer problema potencial es la agregación no deseada de partículas, pero esto puede ocurrir en cualquier centrifugación. La segunda posibilidad ocurre cuando se sedimentan gotas de solución que contienen partículas. Es más probable que esto ocurra cuando se trabaja con una solución que tiene una capa de suspensión flotando sobre un líquido denso, que de hecho tiene poco o ningún gradiente de densidad. [17]
Se puede utilizar una centrífuga para aislar pequeñas cantidades de sólidos retenidos en suspensión de líquidos, como en la separación de tiza en polvo del agua. En la investigación biológica, se puede utilizar en la purificación de células de mamíferos, fraccionamiento de orgánulos subcelulares, fraccionamiento de vesículas de membrana, fraccionamiento de macromoléculas y complejos macromoleculares, etc. [9] La centrifugación se utiliza de muchas formas diferentes en la industria alimentaria . Por ejemplo, en la industria láctea, se suele utilizar en la clarificación y desnatado de la leche , extracción de nata, producción y recuperación de caseína , producción de queso , eliminación de contaminantes bacterianos, etc. Esta técnica de procesamiento también se utiliza en la producción de bebidas. , jugos, café, té, cerveza, vino , leche de soja , procesamiento/recuperación de aceites y grasas, manteca de cacao , producción de azúcar, etc. [20] También se utiliza en la clarificación y estabilización del vino .
En laboratorios forenses y de investigación, se puede utilizar en la separación de orina y componentes sanguíneos . También ayuda en la separación de proteínas mediante técnicas de purificación como la sal , por ejemplo, la precipitación con sulfato de amonio. [6] La centrifugación también es una técnica importante en el tratamiento de residuos , siendo uno de los procesos más comunes utilizados para la deshidratación de lodos . [21] Este proceso también juega un papel en la separación ciclónica , donde las partículas se separan de un flujo de aire sin el uso de filtros . En un colector ciclónico, el aire se mueve siguiendo una trayectoria helicoidal. Las partículas con alta inercia son separadas por la fuerza centrífuga mientras que las partículas más pequeñas continúan con el flujo de aire. [22]
Las centrífugas también se han utilizado en pequeña medida para aislar compuestos más ligeros que el agua, como el petróleo. En tales situaciones, la descarga acuosa se obtiene en la salida opuesta de la cual los sólidos con una gravedad específica mayor que uno son las sustancias objetivo para la separación. [23]
En 1923, Theodor Svedberg y su alumno H. Rinde habían analizado con éxito soles de grano grande en términos de su sedimentación gravitacional. [24] Los soles consisten en una sustancia distribuida uniformemente en otra sustancia, también conocida como coloide . [25] Sin embargo, los soles de grano más pequeño, como los que contienen oro, no pudieron analizarse. [24] Para investigar este problema, Svedberg desarrolló una centrífuga analítica, equipada con un sistema de absorción fotográfica, que ejercería un efecto centrífugo mucho mayor. [24] Además, desarrolló la teoría necesaria para medir el peso molecular. [25] Durante este tiempo, la atención de Svedberg pasó del oro a las proteínas. [24]
En 1900, se aceptaba generalmente que las proteínas estaban compuestas de aminoácidos; sin embargo, todavía se estaba debatiendo si las proteínas eran coloides o macromoléculas . [26] Una proteína que se estaba investigando en ese momento era la hemoglobina . Se determinó que tenía 712 átomos de carbono, 1130 de hidrógeno, 243 de oxígeno, dos átomos de azufre y al menos un átomo de hierro. Esto dio a la hemoglobina un peso resultante de aproximadamente 16.000 dalton (Da), pero no estaba claro si este valor era un múltiplo de uno o cuatro (dependiendo del número de átomos de hierro presentes). [27]
A través de una serie de experimentos que utilizaron la técnica del equilibrio de sedimentación , se hicieron dos observaciones importantes: la hemoglobina tiene un peso molecular de 68.000 Da, lo que sugiere que hay cuatro átomos de hierro presentes en lugar de uno, y que, sin importar de dónde se haya aislado la hemoglobina, tenía exactamente el mismo peso molecular. [24] [25] Cómo se pudo encontrar consistentemente algo de una masa molecular tan grande, independientemente de dónde se tomó la muestra en el cuerpo, no tenía precedentes y favoreció la idea de que las proteínas son macromoléculas en lugar de coloides. [26] Para investigar este fenómeno, se necesitaba una centrífuga con velocidades aún mayores, y así se creó la ultracentrífuga para aplicar la teoría de la sedimentación-difusión. [24] Se determinó la misma masa molecular y la presencia de un límite de expansión sugirió que se trataba de una sola partícula compacta. [24] Una aplicación adicional de la centrifugación demostró que, en diferentes condiciones, las partículas grandes y homogéneas podían descomponerse en subunidades discretas. [24] El desarrollo de la centrifugación fue un gran avance en la ciencia experimental de las proteínas.
Linderstorm-Lang, en 1937, descubrió que los tubos de gradiente de densidad podían usarse para medir la densidad. Descubrió esto cuando trabajaba con el virus del enanismo amarillo de la papa. [17] Este método también se utilizó en el famoso experimento de Meselson y Stahl en el que demostraron que la replicación del ADN es semiconservadora mediante el uso de diferentes isótopos de nitrógeno. Utilizaron centrifugación en gradiente de densidad para determinar qué isótopo o isótopos de nitrógeno estaban presentes en el ADN después de los ciclos de replicación. [19]
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