Los microfluidos basados en gotitas manipulan volúmenes discretos de fluidos en fases inmiscibles con bajo número de Reynolds y regímenes de flujo laminar . [1] [2] El interés en los sistemas de microfluidos basados en gotitas ha crecido sustancialmente en las últimas décadas. [3] [4] Las microgotitas ofrecen la posibilidad de manipular volúmenes en miniatura (μL a fL) de fluidos de manera conveniente, proporcionan una mejor mezcla, encapsulación, clasificación y detección y son adecuadas para experimentos de alto rendimiento. [5] [1] Las dos fases inmiscibles utilizadas para los sistemas basados en gotitas se denominan fase continua (medio en el que fluyen las gotitas) y fase dispersa (fase de gotitas). [6]
Para que se produzca la formación de gotas, se deben utilizar dos fases inmiscibles, denominadas fase continua (medio en el que se generan las gotas) y fase dispersa (fase de gotas). [6] El tamaño de las gotas generadas está controlado principalmente por la relación de la velocidad de flujo de la fase continua y la fase dispersa, la tensión interfacial entre dos fases y la geometría de los canales utilizados para la generación de gotas. [7] Las gotas se pueden formar tanto de forma pasiva como activa. [8] La formación activa de gotas (eléctrica, magnética, centrífuga) a menudo utiliza dispositivos similares a la formación pasiva, pero requiere una entrada de energía externa para la manipulación de las gotas. [8] La formación pasiva de gotas tiende a ser más común que la activa, ya que produce resultados similares con diseños de dispositivos más simples. Generalmente, se utilizan tres tipos de geometrías microfluídicas para la generación pasiva de gotas: (i) flujo cruzado, (ii) enfoque de flujo y (iii) co-flujo. [8] Los microfluidos basados en gotas suelen funcionar con números de Reynolds bajos para garantizar un flujo laminar dentro del sistema. [2] El tamaño de las gotas suele cuantificarse con el coeficiente de variación (CV) como descripción de la desviación estándar del tamaño medio de las gotas. Cada uno de los métodos enumerados proporciona una forma de generar gotas microfluídicas de una manera controlable y ajustable con la manipulación adecuada de las variables.
El flujo cruzado es un método de formación pasivo que implica que las fases continua y acuosa corran en ángulo entre sí. [9] Lo más común es que los canales sean perpendiculares en una unión en forma de T con la fase dispersa intersectando la fase continua; también son posibles otras configuraciones como una unión en Y. [8] [11] [12] La fase dispersa se extiende hacia la continua y se estira hasta que las fuerzas de corte rompen una gota. [13] [14] En una unión en T, el tamaño de la gota y la velocidad de formación están determinados por la relación de la velocidad de flujo y el número capilar . [15] El número capilar relaciona la viscosidad de la fase continua, la velocidad superficial de la fase continua y la tensión interfacial. [7] Normalmente, la velocidad de flujo de la fase dispersa es más lenta que la velocidad de flujo continuo. La formación de la unión en T se puede aplicar aún más añadiendo canales adicionales, creando dos uniones en T en una ubicación. Al añadir canales, se pueden añadir diferentes fases dispersas en el mismo punto para crear gotas alternas de diferentes composiciones. [16] El tamaño de las gotas, normalmente superior a 10 μm, está limitado por las dimensiones del canal y a menudo produce gotas con un CV de menos del 2% con una velocidad de hasta 7 kHz.
El enfoque de flujo es un método de formación generalmente pasivo que implica que la fase dispersa fluya para encontrarse con la fase continua, generalmente en un ángulo (corrientes no paralelas) y luego se someta a una restricción que crea una gota. [19] Esta restricción es generalmente un estrechamiento en el canal para crear la gota a través de un corte simétrico, seguido de un canal de ancho igual o mayor. [20] Al igual que con el flujo cruzado, el caudal de la fase continua es generalmente mayor que el caudal de la fase dispersa. Disminuir el caudal de la fase continua puede aumentar el tamaño de las gotas. [5] El enfoque de flujo también puede ser un método activo en el que el punto de restricción se puede ajustar mediante cámaras laterales neumáticas controladas por aire comprimido. [21] Las cámaras móviles actúan para apretar el flujo, deformando la corriente y creando una gota con una frecuencia de accionamiento variable. El tamaño de la gota suele rondar varios cientos de nanómetros con un CV de menos del 3 % y una frecuencia de hasta varios cientos de Hz a decenas de kHz. [8]
El co-flujo es un método pasivo de formación de gotitas donde el canal de fase dispersa está encerrado dentro de un canal de fase continua. [22] Al final del canal de fase dispersa, el fluido se estira hasta que se rompe por fuerzas de corte y forma gotitas ya sea por goteo o chorro. [23] El goteo ocurre cuando las fuerzas capilares dominan el sistema y se crean gotitas en el punto final del canal. [23] El chorro ocurre, por ensanchamiento o estiramiento, cuando la fase continua se mueve más lento, creando una corriente desde la abertura del canal de fase dispersa. Bajo el régimen de ensanchamiento, la fase dispersa se mueve más rápido que la fase continua causando una desaceleración de la fase dispersa, ensanchando la gotita y aumentando el diámetro. [24] Bajo el régimen de estiramiento, el arrastre viscoso domina causando que la corriente se estreche creando una gotita más pequeña. [24] El efecto del caudal de fase continua sobre el tamaño de la gotita depende de si el sistema está en un régimen de estiramiento o ensanchamiento por lo tanto se deben utilizar diferentes ecuaciones para predecir el tamaño de la gotita. [23] El tamaño de las gotas suele rondar varios cientos de nanómetros con un CV de menos del 5% y una velocidad de hasta decenas de kHz. [8]
Los beneficios de la microfluídica se pueden ampliar a un mayor rendimiento utilizando canales más grandes para permitir que pasen más gotas o aumentando el tamaño de las gotas. [25] El tamaño de las gotas se puede ajustar ajustando la velocidad de flujo de las fases continua y dispersa, pero el tamaño de las gotas está limitado por la necesidad de mantener la concentración, las distancias entre analitos y la estabilidad de las microgotas. [26] Por lo tanto, un mayor tamaño de canal se vuelve atractivo debido a la capacidad de crear y transportar una gran cantidad de gotas, [25] aunque la dispersión [27] y la estabilidad de las gotas [28] se convierten en una preocupación. Finalmente, es necesaria una mezcla completa de las gotas para exponer la mayor cantidad posible de reactivos para garantizar que reaccione la máxima cantidad de materiales de partida. [25] Esto se puede lograr utilizando un canal ventoso para facilitar el flujo laminar inestable dentro de las gotas. [1]
Los surfactantes juegan un papel importante en la microfluídica basada en gotitas. [31] El propósito principal de usar un surfactante es reducir la tensión interfacial entre la fase dispersa (fase de gotitas, típicamente acuosa) y la fase continua (líquido portador, típicamente aceite) mediante la adsorción en las interfaces y evitando que las gotitas se fusionen entre sí, estabilizando así las gotitas en un estado de emulsión estable , lo que permite tiempos de almacenamiento más largos en líneas de retardo, reservorios o viales. [31] [32] Sin usar surfactantes, las emulsiones inestables eventualmente evolucionarán en fases separadas para reducir la energía general del sistema. [33] La química de la superficie no se puede ignorar en la microfluídica ya que la tensión interfacial se convierte en una consideración importante entre las gotitas a microescala. [30] Linas Mazutis y Andrew D. Griffiths presentaron un método que usaba surfactantes para lograr una coalescencia selectiva y altamente controlable sin manipulación externa. [34] Manipulan el tiempo de contacto y la cobertura de surfactante interfacial de un par de gotas para controlar la fusión de las gotas. Cuanto mayor sea el porcentaje de diferencia de la cobertura de surfactante interfacial entre dos gotas, menos probable será que se produzca coalescencia. Este método permitió a los investigadores agregar reactivos a las gotas de una manera diferente y estudiar más a fondo la emulsificación. [34]
La microfluídica se utiliza ampliamente para experimentos bioquímicos, por lo que es importante que los surfactantes sean biocompatibles cuando se trabaja con células vivas y análisis de alto rendimiento. [35] [33] Los surfactantes utilizados en dispositivos de investigación de células vivas no deben interferir con las reacciones bioquímicas o las funciones celulares. El aceite de hidrocarburo normalmente no se utiliza en la investigación microfluídica celular porque no es compatible con las células y daña la viabilidad celular. [36] El aceite de hidrocarburo también extrae moléculas orgánicas de la fase acuosa. [36] Sin embargo, los fluorosurfactantes con colas fluoradas, por ejemplo, se utilizan como un emulsionante de gotas compatible que estabiliza las gotas que contienen células en su interior sin dañar ni alterar las células. [31] Los fluorosurfactantes son solubles en un aceite fluorado (fase continua) pero insolubles en la fase acuosa, lo que da como resultado una disminución de la tensión interfacial acuoso-fluorada. [30] Por ejemplo, un surfactante de copolímero tribloque que contiene dos colas de perfluoropoliéter (PFPE) y un grupo de cabeza de bloque de polietilenglicol (PEG) es un fluorosurfactante con gran biocompatibilidad y excelente estabilidad de gotas contra la coalescencia. [35] [37] [38] Otro ejemplo son los poligliceroles lineales fluorados, que se pueden funcionalizar aún más en sus cadenas laterales personalizadas y son más personalizables en comparación con el copolímero basado en PEG. [39] Los surfactantes se pueden comprar en muchas empresas químicas, como RainDance Technologies (ahora a través de BioRad) [32] y Miller-Stephenson. [35]
Al agregar surfactantes o sales inorgánicas [41] a un sistema microfluídico basado en gotitas, la tensión interfacial de las gotitas individuales se altera dentro del sistema microfluídico. Estos componentes de separación permiten la utilización de las gotitas como microrreactores para varios mecanismos de procedimiento. [42] Para describir la relación entre la tensión interfacial (), la concentración de surfactantes/sales disociados en la gota a granel ( C ), la temperatura ( T ), la constante de Boltzmann ( k B ) y la concentración de surfactantes/sales disociados en la interfaz (Γ), se creó la isoterma de adsorción de Gibbs , una sección simplificada que resalta la información relevante que se muestra a la derecha.
Esta isoterma reafirma la noción de que mientras la concentración de sal inorgánica aumenta, las sales se agotan de la interfaz de la gota (Γ<0), y la tensión de la interfaz de la gota aumenta. Esto contrasta con los surfactantes, que se adsorben en la interfaz (Γ>0), y la tensión interfacial más baja [42] . A bajas concentraciones de surfactante, la tensión superficial disminuye de acuerdo con la isoterma de adsorción de Gibbs, hasta que se alcanza una cierta concentración, conocida como la concentración micelar crítica (CMC), cuando las micelas comienzan a formarse. [43] Al alcanzar la CMC, la concentración de surfactante disuelto alcanza un máximo, donde los monómeros de surfactante se agregarán para formar micelas de tamaño nanométrico. [40] Debido a este potencial para la formación de micelas, se pueden utilizar tres pasos al analizar la adsorción de los surfactantes a la interfaz de la gota. [40] Primero, las moléculas de surfactante se adsorben entre la capa superficial y la capa subsuperficial. En segundo lugar, las moléculas se intercambian entre la subsuperficie y la solución en masa. En tercer lugar, las micelas se relajan, debido a la ruptura del equilibrio entre las moléculas libres y las micelas. [44] [45]
Las moléculas que componen cada micela se organizan en función de la solución en la que se encuentran suspendidas, con las porciones más solubles en contacto con la solución y las porciones menos solubles de la molécula en contacto entre sí. Según la relación de volumen de las cabezas polares y la cola no polar, se ha descubierto que varios surfactantes forman agregados más grandes, [44] estructuras huecas de dos capas conocidas como vesículas . Un surfactante notable que se ha observado que forma vesículas es el AOT (sal sódica de dioctil sulfosuccinato). Estas micelas y vesículas son descubrimientos relativamente nuevos; sin embargo, se han utilizado para transportar agentes dentro de sistemas microfluídicos, [46] revelando futuras aplicaciones para los transportes microfluídicos. [47]
Las reacciones a microescala realizadas en aplicaciones basadas en gotas conservan reactivos y reducen el tiempo de reacción, todo a velocidades de kilohercios. [5] [48] La adición de reactivos a microrreactores de gotas ha sido un foco de investigación debido a la dificultad de lograr adiciones reproducibles a velocidades de kilohercios sin contaminación de gota a gota. [49]
Los reactivos se pueden agregar en el momento de la formación de las gotas a través de una geometría de "coflujo". [1] Las corrientes de reactivos se bombean en canales separados y se unen en la interfaz con un canal que contiene la fase continua, que corta y crea gotas que contienen ambos reactivos. Al cambiar las velocidades de flujo en los canales de reactivos, se pueden controlar las proporciones de reactivos dentro de una gota. [50] [51]
La fusión de gotitas con diferentes contenidos también se puede aprovechar para la adición de reactivos. La electrocoalescencia fusiona pares de gotitas mediante la aplicación de un campo eléctrico para desestabilizar temporalmente la interfaz gotita-gotita para lograr una fusión de gotitas reproducible en emulsiones estabilizadas con surfactante. [54] [55] La electrocoalescencia requiere que las gotitas (que normalmente están separadas por la fase continua) entren en contacto. Al manipular el tamaño de las gotitas en corrientes separadas, el flujo diferencial de tamaños de gotitas puede hacer que las gotitas entren en contacto antes de fusionarse. [11]
Otro método para facilitar la fusión de gotas es la pinza acústica. [56] Mientras las gotas fluyen en canales microfluídicos, se pueden inmovilizar utilizando una pinza acústica basada en ondas acústicas de superficie . [56] Una vez que se sostiene una gota con la pinza acústica, las gotas consecutivas chocan contra ella y se produce la fusión.
Los métodos de coflujo de reactivos y fusión de gotas están ligados a eventos de formación de gotas que carecen de flexibilidad en sentido descendente. Para disociar la adición de reactivos de la creación de gotas, se utiliza una configuración en la que la corriente de reactivo fluye a través de un canal perpendicular a la corriente de gotas. [60] [61] Luego, una gota de inyección se fusiona con el tapón a medida que pasa por el canal. El volumen de reactivo está controlado por la velocidad de flujo del canal de reactivo perpendicular.
Un desafío inicial para tales sistemas es que la fusión de gotas de reactivo no era reproducible para emulsiones estables. [59] Al adaptar el uso de un campo eléctrico activado en esta geometría, Abate et al. lograron un control de subpicolitros de la inyección de reactivo. [59] Este enfoque, denominado picoinyección, controla el volumen de inyección a través de la presión de la corriente de reactivo y la velocidad de las gotas. El trabajo posterior sobre este método ha tenido como objetivo reducir las fluctuaciones de presión que impiden inyecciones reproducibles. [62]
La inyección del fluido acuoso presurizado ocurre cuando los electrodos se activan creando un campo eléctrico que desestabiliza la interfaz fluido acuoso/aceite, desencadenando la inyección. [59] Las ventajas clave de la picoinyección incluyen una baja transferencia inadvertida de material entre gotitas y el mantenimiento de la compartimentación de las gotitas a través de la inyección, sin embargo, los electrodos a menudo se fabrican utilizando soldadura de metal que puede complicar la construcción del dispositivo microfluídico a través del aumento del tiempo de fabricación como resultado de un diseño más intrincado. [58] [63] Un método alternativo de picoinyección implica utilizar el reactivo de inyección como conductor de un campo eléctrico donde un voltaje aplicado al fluido estimula la inyección. Este método también permite un mayor control de la inyección ya que el voltaje aplicado corresponde al volumen de fluido reactivo inyectado. [63]
La contaminación entre gotas es un desafío para muchos métodos de inyección. [64] Para combatir esto, Doonan et al. desarrollaron un canal K multifuncional, que hace fluir corrientes de reactivo en dirección opuesta a la corriente de gotas. [65] Al utilizar una interfaz entre los dos canales, la inyección se logra de manera similar a la picoinyección, pero cualquier contaminación bilateral se elimina a través del flujo continuo de reactivo. La contaminación se evita a expensas de un posible desperdicio de reactivo valioso.
Para que la microfluídica basada en gotitas sea una técnica viable para llevar a cabo reacciones químicas o trabajar con células vivas a microescala, es necesario implementar métodos que permitan la incubación de gotitas. [66] Las reacciones químicas a menudo necesitan tiempo para ocurrir, y las células vivas también necesitan tiempo para crecer, multiplicarse y llevar a cabo procesos metabólicos . La incubación de gotitas se puede lograr dentro del propio dispositivo (en el chip) o externamente (fuera del chip), dependiendo de los parámetros del sistema. [48] La incubación fuera del chip es útil para tiempos de incubación de un día o más o para la incubación de millones de gotitas a la vez. [48] La incubación en el chip permite la integración de los pasos de manipulación y detección de gotitas en un solo dispositivo. [48]
Las gotitas que contienen células se pueden almacenar fuera del chip en tubos de PTFE durante varios días, manteniendo la viabilidad celular y permitiendo la reinyección en otro dispositivo para su análisis. [67] Se ha informado de la evaporación de fluidos acuosos y a base de aceite con el almacenamiento de gotitas en tubos de PTFE, por lo que para un almacenamiento de más de varios días, también se utilizan capilares de vidrio. [68] Finalmente, después de la formación en un dispositivo microfluídico, las gotitas también se pueden guiar a través de un sistema de capilares y tubos que conducen a una jeringa. Las gotitas se pueden incubar en la jeringa y luego inyectar directamente en otro chip para su posterior manipulación o detección y análisis. [69]
Las líneas de retardo se utilizan para incubar gotitas en el chip. Después de la formación, las gotitas se pueden introducir en un canal serpenteante con una longitud de hasta un metro o más. [71] [27] Aumentar la profundidad y el ancho del canal de la línea de retardo (en comparación con los canales utilizados para formar y transportar gotitas) permite tiempos de incubación más largos al tiempo que minimiza la contrapresión del canal . [27] Debido al mayor tamaño del canal, las gotitas llenan el canal de la línea de retardo [72] y se incuban en el tiempo que les toma atravesar este canal.
Las líneas de retardo se diseñaron originalmente para incubar gotitas que contenían mezclas de reacciones químicas y eran capaces de alcanzar tiempos de retardo de hasta una hora. [27] [73] [74] Estos dispositivos hacen uso de canales de línea de retardo de decenas de centímetros de longitud. Aumentar la longitud total de los canales de línea de retardo a uno o más metros hizo posibles tiempos de incubación de 12 horas o más. [71] [35] Se ha demostrado que las líneas de retardo mantienen la estabilidad de las gotitas hasta por 3 días, [35] y se ha demostrado la viabilidad celular utilizando líneas de retardo en chip por hasta 12 horas. [71] Antes del desarrollo de las líneas de retardo, la incubación en chip se realizaba dirigiendo las gotitas a grandes depósitos (de varios milímetros de largo y ancho), lo que ofrece una alta capacidad de almacenamiento y una menor complejidad de construcción y operación del dispositivo si no se requiere un control preciso del tiempo de las gotitas. [70]
Si es importante tener una distribución uniforme de los tiempos de incubación de las gotitas, el canal de la línea de retardo puede contener constricciones espaciadas regularmente. [27] Las gotitas que fluyen a través de un canal de diámetro uniforme viajan a diferentes velocidades según su posición radial; las gotitas más cercanas al centro del canal se mueven más rápido que las cercanas a los bordes. [27] Al reducir el ancho del canal a una fracción de su tamaño original, las gotitas con velocidades más altas se ven obligadas a equilibrarse con las gotitas de movimiento más lento porque la constricción permite que pasen menos gotitas a la vez. [27] Otra manipulación de la geometría del canal de la línea de retardo implica introducir giros en la trayectoria de las gotitas. Esto aumenta el grado en el que los reactivos contenidos en las gotitas se mezclan mediante advección caótica . [1] Para los sistemas que requieren la incubación de 100 a 1000 gotitas, se pueden fabricar trampas en el canal de la línea de retardo que almacenan las gotitas por separado unas de otras. [75] [76] Esto permite un control y seguimiento más precisos de las gotas individuales.
El método micromagnetofluídico consiste en controlar fluidos magnéticos mediante la aplicación de un campo magnético sobre una plataforma microfluídica, [77] ofreciendo un control inalámbrico y programable de las gotitas magnéticas. [78] Por lo tanto, la fuerza magnética también se puede utilizar para realizar diversas operaciones lógicas, además de la fuerza hidrodinámica y la fuerza de tensión superficial. La intensidad del campo magnético, el tipo de campo magnético (gradiente, uniforme o rotatorio), la susceptibilidad magnética, la tensión interfacial , los caudales y las relaciones de caudal determinan el control de las gotitas sobre una plataforma micromagnetofluídica. [79]
Las gotitas magnéticas, en el contexto de la microfluídica basada en gotitas, son gotitas de tamaño de microlitros que están compuestas de ferrofluidos o contienen algún componente magnético que permite la manipulación a través de un campo magnético aplicado. Los ferrofluidos son mezclas homogéneas de soluciones coloidales de nanopartículas magnéticas en un portador líquido. [80] Dos aplicaciones de las gotitas magnéticas son el control y la manipulación de gotitas microfluídicas en un microambiente [81] [82] [83] [84] y la fabricación, el transporte y la utilización de construcciones de nanomateriales en las microgotitas. [85] [86] [87] [88] [89] La manipulación de gotitas magnéticas se puede utilizar para realizar tareas como organizar gotitas en una matriz ordenada para aplicaciones en estudios de cultivo celular, mientras que el uso de gotitas magnéticas para la fabricación de nanoestructuras se puede utilizar en aplicaciones de administración de fármacos. [87]
En los sistemas microfluídicos tradicionales basados en gotitas, es decir, una gotita en un canal que contiene un aceite inmiscible que separa las gotitas, el movimiento de las gotitas se logra a través de diferencias en la presión o tensión superficial. En los sistemas microfluídicos no tradicionales basados en gotitas, como los que se describen en este documento, se necesitan otros mecanismos de control para manipular las gotitas. La aplicación de un campo magnético a una matriz de microfluidos que contiene gotitas magnéticas permite clasificar y organizar fácilmente las gotitas en patrones y configuraciones útiles. [83] [84] Estos tipos de manipulaciones se pueden lograr mediante la aplicación estática o dinámica de un campo magnético [82] que permite un alto grado de control sobre las gotitas magnéticas. La caracterización del grado de control sobre las gotitas magnéticas incluye mediciones de la susceptibilidad magnética del ferrofluido, la medición del cambio de la gotita en el área de interfaz del sustrato en presencia de un campo magnético aplicado y la medición del "ángulo de deslizamiento" o el ángulo en el que la gotita se movería en presencia de un campo magnético cuando la superficie estuviera inclinada. [83] Las interacciones entre la gotita de agua y la superficie se pueden manipular ajustando la estructura del propio sistema microfluídico mediante la aplicación de un campo magnético a poli[dimetilsiloxano] dopado con hierro (PDMS), un material común para dispositivos microfluídicos. [81]
En otros sistemas considerados no tradicionales, los sistemas microfluídicos basados en gotitas, las microgotitas magnéticas pueden ser un medio sencillo de fabricación y control de micro y nanomateriales, a veces llamados "robots". [82] Estas nanoestructuras están formadas por nanopartículas magnéticas en microgotitas que han sido manipuladas en estructuras específicas mediante un campo magnético aplicado. Las microhélices son una aplicación multifuncional de esta tecnología. Se generan gotitas monodispersas que contienen nanopartículas magnéticas y se someten a un campo magnético que organiza las nanopartículas en una plantilla helicoidal que se fabrica en el lugar mediante polimerización fotoinducida. [86] Se demostró que estas microhélices son efectivas para limpiar canales que estaban bloqueados con compuestos semisólidos de grasas, aceites y proteínas, como los que se encuentran en las arterias. Se ha demostrado que las microhélices y los grupos de micropartículas en gotitas magnéticas son un medio de transporte para micropartículas pequeñas (500 μm de diámetro), lo que también muestra aplicaciones en la administración de fármacos. [86] [87] [89] También se han fabricado microestructuras no esféricas utilizando microfluídica magnética, lo que demuestra el control minucioso disponible. [85] Entre las microestructuras no esféricas que se fabricaron estaban las microcápsulas de óxido de grafeno que se podían aspirar y volver a inflar utilizando una micropipeta, al tiempo que exhibían un comportamiento fotosensible y magnetorreceptivo. [87] Las microcápsulas que responden a estímulos magnéticos y fotográficos, como estas construidas con óxido de grafeno, son útiles para aplicaciones biomédicas que requieren manipulación in vivo y sin contacto de estructuras celulares como las células madre. [90]
La clasificación de gotas en microfluídica es una técnica importante que permite la discriminación basada en factores que van desde el tamaño de la gota hasta los productos químicos marcados con etiquetas fluorescentes dentro de la gota, a partir del trabajo realizado para clasificar células en citometría de flujo . [91] [92] [93] [94] Dentro del ámbito de la clasificación de gotas hay dos tipos principales, la clasificación en masa, que utiliza métodos activos o pasivos, y la clasificación precisa, que se basa principalmente en métodos activos. La clasificación en masa se aplica a muestras con una gran cantidad de gotas (> 2000 s −1 ) que se pueden clasificar en función de las propiedades intrínsecas de las gotas (como la viscosidad, la densidad, etc.) sin verificar cada gota. [ 95] La clasificación precisa, por otro lado, tiene como objetivo separar las gotas que cumplen ciertos criterios que se verifican en cada gota. [95]
La clasificación pasiva se realiza a través del control del diseño del canal microfluídico, lo que permite la discriminación basada en el tamaño de las gotas. La clasificación por tamaño se basa en las uniones bifurcadas en el canal para desviar el flujo, lo que hace que las gotas se clasifiquen en función de cómo interactúan con la sección transversal de ese flujo, la velocidad de corte, que se relaciona directamente con su tamaño. [92] [96] [97] Otros métodos pasivos incluyen la inercia y la microfiltración, cada uno de los cuales tiene que ver con las propiedades físicas, como la inercia y la densidad, de la gota. [95] [98] La clasificación activa utiliza dispositivos adicionales conectados al dispositivo microfluídico para alterar la trayectoria de una gota durante el flujo controlando algún aspecto, incluido el control térmico, magnético, neumático, acústico, hidrodinámico y eléctrico. [99] [100] [101] [102] Estos controles se utilizan para clasificar las gotas en respuesta a la detección de alguna señal de las gotas, como la intensidad de la fluorescencia.
Los métodos de clasificación precisos utilizan estos métodos de clasificación activa tomando primero una decisión (por ejemplo, señal de fluorescencia) sobre las gotitas y luego alterando su flujo con uno de los métodos mencionados anteriormente. Se ha desarrollado una técnica llamada Clasificación de gotitas activadas por fluorescencia (FADS) que utiliza la clasificación activa inducida por campo eléctrico con detección fluorescente para clasificar hasta 2000 gotitas por segundo. [91] El método se basa en, pero no se limita a, la actividad enzimática de las células diana compartimentadas para activar un sustrato fluorogénico dentro de la gotita. Cuando se detecta una gotita fluorescente, se encienden dos electrodos que aplican un campo a la gotita, que cambia su curso hacia el canal de selección, mientras que las gotitas no fluorescentes fluyen a través del canal principal hacia los desechos. [91] [32] Otros métodos utilizan diferentes criterios de selección, como la absorbancia o transmitancia de la gotita, el número de partículas encapsuladas o el reconocimiento de imágenes de las formas de las células. [93] [94] [103] [104] Se puede realizar una clasificación para mejorar la pureza de la encapsulación, un factor importante para recolectar muestras para experimentos posteriores. [32]
Una de las principales ventajas de la microfluídica basada en gotas es la capacidad de utilizar gotas como incubadoras para células individuales. [67] [105]
Los dispositivos capaces de generar miles de gotitas por segundo abren nuevas vías para caracterizar poblaciones celulares, no solo en función de un marcador específico medido en un momento determinado, sino también en función del comportamiento cinético de las células, como la secreción de proteínas, la actividad enzimática o la proliferación. Recientemente, se descubrió un método para generar una matriz estacionaria de gotitas microscópicas para la incubación de células individuales que no requiere el uso de un surfactante . [ cita requerida ]
Los sistemas microfluídicos basados en gotitas proporcionan una plataforma analítica que permite el aislamiento de células individuales o grupos de células en gotitas. [106] Esta herramienta ofrece un alto rendimiento para experimentos celulares ya que los sistemas microfluídicos basados en gotitas pueden generar miles de muestras (gotitas) por segundo. En comparación con el cultivo celular en placas de microtitulación convencionales , las microgotitas de volúmenes de μL a pL reducen el uso de reactivos y células. [107] Además, el manejo automatizado y el procesamiento continuo permiten que los ensayos se realicen de manera más eficiente. [107] El entorno aislado en una gotita encapsulada ayuda a analizar cada población celular individual. [105] Los experimentos de cultivo celular de alto rendimiento, por ejemplo, probar el comportamiento de las bacterias, [108] encontrar tipos de células raras, [109] [110] evolución dirigida, [51] y detección de células [73] [67] son adecuados para usar las técnicas microfluídicas basadas en gotitas.
El polidimetilsiloxano (PDMS) es el material más común para fabricar dispositivos microfluídicos debido a su bajo costo, facilidad de creación de prototipos y buena permeabilidad a los gases. [111] Junto con los aceites portadores de perfluorocarbono , que también permiten una buena permeabilidad a los gases, utilizados como fase continua en el sistema microfluídico basado en gotitas para el cultivo celular, algunos estudios han encontrado que la viabilidad celular es comparable al cultivo en matraces, por ejemplo, células de mamíferos. [67] Para alcanzar el tiempo de cultivo requerido, se puede utilizar un reservorio o una línea de retardo. El uso de un reservorio permite un cultivo a largo plazo de varias horas a varios días, mientras que la línea de retardo es adecuada para un cultivo a corto plazo de varios minutos. [51] [27] La incubación es factible tanto en el chip (reservorio conectado con un sistema microfluídico o líneas de retardo) [51] como fuera del chip (tubos de PTFE aislados con un sistema microfluídico) [73] después de que se forman las gotitas. Después de la incubación, las gotitas se pueden volver a inyectar en el dispositivo microfluídico para su análisis. También existen sistemas de almacenamiento de gotitas en chip especialmente diseñados para el análisis directo, como el dispositivo "dropspot", que almacena las gotitas en varias cámaras de matriz y utiliza un escáner de micromatriz para el análisis directo. [112] [113]
El cultivo celular mediante microfluidos basados en gotitas ha creado muchas oportunidades de investigación que son inaccesibles en plataformas convencionales, pero también presenta muchos desafíos. Algunos de los desafíos del cultivo celular en microfluidos basados en gotitas son comunes a otros sistemas de cultivo microfluídico. En primer lugar, el consumo de nutrientes debe reevaluarse para un sistema de microfluidos específico. Por ejemplo, el consumo de glucosa a veces aumenta en los sistemas microfluídicos (dependiendo del tipo de célula). [113] La renovación del medio a veces es más rápida que en el cultivo macroscópico debido a los volúmenes de cultivo reducidos, por lo que los volúmenes del medio utilizado deben ajustarse en cada línea celular y dispositivo. [113] En segundo lugar, la proliferación y el comportamiento celular pueden diferir según los sistemas microfluídicos, un factor determinante es el área de superficie de cultivo al volumen del medio, que varía de un dispositivo a otro. Un informe encontró que la proliferación se vio afectada en los microcanales; el aumento de la glucosa o la suplementación con suero no abordaron el problema para su caso específico. [114] En tercer lugar, se debe controlar la regulación del pH. El PDMS es más permeable al CO 2 que al O 2 o N 2 , por lo tanto, el nivel de gas disuelto durante la incubación debe ajustarse para alcanzar la condición de pH esperada. [113]
También se han utilizado dispositivos basados en gotitas para investigar las condiciones necesarias para la cristalización de proteínas. [115] [116]
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha sido una herramienta vital en la genómica y los esfuerzos biológicos desde su inicio, ya que ha acelerado enormemente la producción y el análisis de muestras de ADN para una amplia gama de aplicaciones. [117] El avance tecnológico de la PCR a escala de microgotas ha permitido la construcción de un dispositivo de PCR en un chip de una sola molécula. [118] La replicación temprana de ADN de una sola molécula , incluida la que ocurre en la PCR de microgotas o emulsión, era más difícil que la PCR a mayor escala, por lo que generalmente se usaban concentraciones mucho más altas de componentes. [119] Sin embargo, las condiciones completamente optimizadas han minimizado esta sobrecarga al asegurar que las moléculas individuales tengan una concentración apropiada de componentes de replicación distribuidos por toda la celda de reacción. [119] La PCR microfluídica no basada en gotas también enfrenta desafíos con la absorción de reactivos en los canales del dispositivo, pero los sistemas basados en gotas reducen este problema con un menor contacto con el canal. [120]
Utilizando sistemas de agua en aceite, la PCR en gotas funciona ensamblando ingredientes, formando gotas, combinando gotas, termociclando y luego procesando los resultados de manera muy similar a la PCR normal. Esta técnica es capaz de ejecutar más de 2 millones de reacciones de PCR además de un aumento de 100.000 veces en la detección de alelos de tipo salvaje sobre alelos mutantes . [121] La PCR basada en gotas aumenta en gran medida las capacidades de multiplexación de la PCR normal, lo que permite una rápida producción de bibliotecas de mutaciones. Sin corrección de pruebas, la replicación del ADN es inherentemente algo propensa a errores, pero al introducir polimerasas propensas a errores , la PCR basada en gotas utiliza una salida de mutación más alta de lo normal para construir una biblioteca de mutaciones de manera más rápida y eficiente que lo normal. [122] Esto hace que la PCR basada en gotas sea más atractiva que la PCR tradicional más lenta. [123] En una aplicación similar, se ha desarrollado una PCR de microgotas altamente multiplexada que permite la detección de grandes cantidades de secuencias diana, lo que permite aplicaciones como la identificación bacteriana. [124] La PCR en chip permite un exceso de multiplexación de 15 x 15, lo que significa que se podrían ejecutar múltiples secuencias de ADN objetivo en el mismo dispositivo al mismo tiempo. [125] Esta multiplexación fue posible con fragmentos de cebadores de ADN inmovilizados colocados en la base de los pocillos individuales de los chips. [126]
La combinación de PCR basada en gotitas con dispositivos de polidimetilsiloxano (PDMS) ha permitido mejoras novedosas de la PCR en gotitas, así como remediar algunos problemas preexistentes con la PCR en gotitas, incluida la alta pérdida de líquido debido a la evaporación. [127] La PCR basada en gotitas es muy sensible a las burbujas de aire, ya que crean diferenciales de temperatura que dificultan la replicación del ADN y también desalojan los reactivos de la cámara de replicación. [120] Ahora, la PCR basada en gotitas se ha llevado a cabo en dispositivos PDMS para transferir reactivos a gotitas a través de una capa de PDMS de una manera más controlada que mantiene mejor el progreso y la estabilidad de la replicación que las válvulas tradicionales. [128] Un dispositivo PDMS de PCR en gotitas reciente permitió una mayor precisión y amplificación de pequeños números de copias en comparación con los experimentos de PCR cuantitativa tradicionales. [129] Esta mayor precisión se debió al PDMS dopado con surfactante, así como a un diseño de dispositivo de vidrio-PDMS-vidrio intercalado. Estas propiedades del dispositivo han permitido un cebado más optimizado del ADN y una menor evaporación de agua durante el ciclo de PCR. [129]
Se han utilizado múltiples sistemas microfluídicos, incluidos sistemas basados en gotas, para la secuenciación de ADN .
La evolución dirigida de una enzima es un proceso repetitivo de creación de mutaciones genéticas aleatorias, cribado de un fenotipo objetivo y selección de la( s) variante (s) más robusta(s) para una modificación posterior. [130] La capacidad de la humanidad para utilizar la evolución dirigida para optimizar las enzimas con fines biotecnológicos está limitada en gran medida por el rendimiento de las herramientas y métodos de cribado y la simplicidad de su uso. Debido a la naturaleza iterativa de la evolución dirigida y la necesidad de grandes bibliotecas, la evolución dirigida a macroescala puede ser un esfuerzo costoso. [131] [132] Como tal, realizar experimentos a microescala a través de microfluidos basados en gotitas proporciona una alternativa significativamente más barata que los equivalentes macroscópicos. [132] Varios enfoques fijan el precio de la evolución dirigida a través de microfluidos de gotitas por debajo de los 40 dólares para un cribado de una biblioteca de genes de tamaño 106 –107 , mientras que el experimento a macroescala correspondiente tiene un precio de aproximadamente 15 millones de dólares. [131] [133] Además, con tiempos de selección que varían de 300 a 2000 gotitas clasificadas por segundo, la microfluídica basada en gotitas proporciona una plataforma para una selección de bibliotecas significativamente acelerada, de modo que las bibliotecas de genes de 10 7 se pueden clasificar bien en un día. [132] [133] [93] Los dispositivos microfluídicos basados en gotitas hacen que la evolución dirigida sea accesible y rentable.
Se han desarrollado muchos enfoques diferentes para la construcción de dispositivos microfluídicos basados en gotitas para la evolución dirigida con el fin de tener la capacidad de examinar una amplia variedad de proteínas, vías y genomas diferentes. [131] Un método para introducir bibliotecas en el dispositivo microfluídico utiliza la encapsulación de una sola célula, en la que las gotitas contienen un máximo de una célula cada una. Esto evita resultados confusos que podrían generarse al tener múltiples células, y en consecuencia múltiples genotipos, en una sola gotita, al tiempo que maximiza la eficiencia del consumo de recursos. [134] [135] Este método permite la detección de proteínas secretadas y proteínas en la membrana celular. La adición de un lisado celular a las gotitas, que descompone la membrana celular de modo que las especies intracelulares estén libremente disponibles dentro de la gotita, amplía las capacidades del método de encapsulación de una sola célula para analizar proteínas intracelulares. [136] [137] La biblioteca también se puede realizar completamente in vitro (es decir, no en su contexto biológico/celular) de modo que el contenido de la gota sea exclusivamente una cadena de ADN mutada. El sistema in vitro requiere PCR y el uso de sistemas de transcripción y traducción in vitro (IVTT) para generar la proteína deseada en la gota para su análisis. [133] La clasificación de gotas para la evolución dirigida se realiza principalmente mediante detección de fluorescencia (por ejemplo, clasificación de gotas activada por fluorescencia (FADS)), [138] sin embargo, los desarrollos recientes en métodos de clasificación basados en absorbancia, conocidos como clasificación de gotas activada por absorbancia (AADS), [93] han ampliado la diversidad de sustratos que pueden experimentar una evolución dirigida a través de un dispositivo microfluídico basado en gotas. [132] [133] [93] [138] Recientemente, la capacidad de clasificación se ha ampliado incluso a la detección de niveles de NADPH y se ha utilizado para crear oxidorreductasas dependientes de NADP de mayor actividad . [139] En última instancia, el potencial de diferentes métodos de creación y análisis de gotas en dispositivos microfluídicos basados en gotas de evolución dirigida permite una variabilidad que facilita una gran población de candidatos potenciales para la evolución dirigida.
Como método para la ingeniería de proteínas, la evolución dirigida tiene muchas aplicaciones en campos que van desde el desarrollo de fármacos y vacunas hasta la síntesis de alimentos y productos químicos. [140] Se desarrolló un dispositivo microfluídico para identificar huéspedes mejorados de producción de enzimas (es decir, fábricas de células) que se pueden emplear industrialmente en varios campos. [134] Una aldolasa artificial se mejoró aún más 30 veces utilizando microfluídica basada en gotitas para que su actividad se asemejara a la de las proteínas naturales. [141] Más recientemente, la creación de oxidasas funcionales ha sido posible gracias a un nuevo dispositivo microfluídico creado por Debon et al. [142] El enfoque microfluídico basado en gotitas para la evolución dirigida tiene un gran potencial para el desarrollo de una gran cantidad de proteínas nuevas.
Desde principios de la década de 2000, los avances en microfluídica basada en gotas la han convertido en una técnica poderosa para realizar campañas de evolución dirigida. Los primeros desarrollos en la producción en masa de emulsiones simples (SE, por ejemplo, gotas de "agua en aceite") y emulsiones dobles (DE, por ejemplo, gotas de "agua en aceite en agua") fueron seguidos por innovaciones en la formación y clasificación en chip de SE y DE, que permiten una mayor facilidad y rendimiento de los experimentos de evolución dirigida en chips microfluídicos. [143]
Un componente esencial de la evolución dirigida es el mantenimiento del vínculo entre genotipos y fenotipos enzimáticos. [130] La capacidad de formar DE en chip y posteriormente clasificar mediante clasificación celular activada por fluorescencia ( FACS ) impulsó el campo hacia adelante. En 2013, Yan et al. mostraron el uso de FACS para clasificar DE. [144] En 2014, Zinchenko et al. publicaron un sistema para formular DE monodispersos y clasificarlos y analizarlos cuantitativamente utilizando un citómetro de flujo disponible comercialmente. Los autores demostraron el poder de su sistema al enriquecer una arilsulfatasa activa de tipo salvaje a partir de poblaciones de 0,1% y 0,01% de células activas de 800 a 2500 veces, respectivamente. [145] En 2016, Larsen et al. desarrollaron un sistema de clasificación óptica basado en fluorescencia para monitorear la actividad de las polimerasas dentro de un dispositivo microfluídico. Utilizando su sistema, Larsen y sus colegas demostraron un enriquecimiento de aproximadamente 1200 veces de una polimerasa diseñada. Después de una ronda de selección de una polimerasa de ácido nucleico alfa-L-treofuranosil (TNA), demostraron una mejora de aproximadamente 14 veces en la actividad y una colocación correcta de residuos en un polipéptido en crecimiento >99%. [146] En 2017, SS Terekhov et al. desarrollaron una clasificación de emulsión doble de agua en aceite en agua (MDE) microfluídica monodispersa, que combinaron con FACS seguido de cromatografía líquida-espectrometría de masas ( LC-MS ) y secuenciación de próxima generación ( NGS ). Los autores demostraron una clasificación de alta sensibilidad de células de levadura enzimáticamente activas de células no activas utilizando fluorescencia. Además, mostraron la capacidad de su sistema MDE-FACS para interrogar las interacciones entre las células diana y efectoras dentro de las gotitas sin interferencia de otras células de levadura y bacterianas. [147]
En lugar de desarrollar nuevas plataformas, algunos grupos se han centrado en la optimización de métodos, herramientas y plataformas existentes para simplificar y mejorar su facilidad de uso por parte de no expertos. En 2017, Sukovitch et al. crearon un sistema para producir DE monodispersos o de tamaño aproximadamente igual eliminando el proceso de recubrimiento necesario para los chips de DE. [148] Varios grupos han alterado los tipos y concentraciones de surfactantes para simplificar la administración de reactivos en SE y DE. [149] [150] [151] En 2018, Ma et al. presentaron un sistema de detección de gotas microfluídicas de doble canal (DMDS). El sistema utiliza etiquetas fluorogénicas para clasificar los SE por dos propiedades diferentes de una enzima objetivo al mismo tiempo. Utilizando DMDS, Ma y colaboradores dirigieron la evolución de una esterasa altamente enantioselectiva utilizando múltiples propiedades enzimáticas. [152] En 2020, Brower et al. Se demostró la clasificación y aislamiento de DE en chip seguido de FACS que permite un alto rendimiento de clasificación de células de mamíferos encapsuladas, de las cuales se puede extraer material genético posteriormente. [153] [154]
Si bien el etiquetado fluorogénico es una herramienta poderosa para el seguimiento y la clasificación, no siempre es compatible con los sistemas microfluídicos basados en gotitas y el diseño experimental. Recientemente se han informado nuevas técnicas de detección sin etiquetas y sin fluorescencia. [143] En 2016, Gielen et al. publicaron un dispositivo microfluídico de clasificación de gotitas activadas por absorbancia (AADS) y demostraron su funcionalidad al dirigir la evolución de una fenilalanina deshidrogenasa. [155] En 2016, Sun et al. demostraron el uso de gotitas de SE y MS de alto rendimiento para examinar activadores e inhibidores de enzimas mediante el examen de una biblioteca de transaminasas. [156] [157] En 2019, Pan et al. mostraron la clasificación de gotitas por tensiones interfaciales, que se ven afectadas por el contenido de las gotitas. [158] En 2020, Haidas et al. presentó un enfoque microfluídico que utiliza tanto la espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz ( MALDI -MS) como la microscopía de fluorescencia, que los autores utilizaron para medir la concentración y la actividad de la fitasa, respectivamente, en células de levadura. [159] En 2020, Holland-Moritz et al. publicaron su método de clasificación de gotas activadas por masa (MADS), que integra el análisis de MS con la clasificación de gotas activadas por fluorescencia (FADS). Usando este método, las gotas se dividen y analizan por separado tanto por MS como por FADS. El poder de este método se demostró al examinar la actividad de una biblioteca de transaminasas expresada in vitro . [160]
Los expertos anticipan que las futuras innovaciones basadas en microfluidos para campañas de evolución dirigida se impulsarán en el espacio comercial, lo que dará como resultado métodos y herramientas más simples y menos costosos que se puedan aplicar a enzimas biotecnológicamente relevantes. [161]
La microfluídica basada en gotitas se ha convertido en una herramienta importante en la síntesis química debido a varias características atractivas. Las reacciones a microescala permiten la reducción de costos mediante el uso de pequeños volúmenes de reactivos, reacciones rápidas en el orden de milisegundos y una transferencia de calor eficiente que genera beneficios ambientales cuando la cantidad de energía consumida por unidad de aumento de temperatura puede ser extremadamente pequeña. [162] El grado de control sobre las condiciones locales dentro de los dispositivos a menudo hace posible seleccionar un producto sobre otro con alta precisión. [162] [163] Con una alta selectividad del producto y tamaños pequeños de reactivos y entornos de reacción, viene una limpieza de reacción menos estricta y una huella más pequeña. [162] Las gotitas microdispersas creadas por la química basada en gotitas son capaces de actuar como entornos en los que ocurren reacciones químicas, como portadores de reactivos en el proceso de generación de nanoestructuras complejas . [164] Las gotitas también son capaces de transformarse en estructuras similares a células que se pueden usar para imitar los componentes y procesos biológicos humanos. [164] [163]
Como método de síntesis química , las gotitas en los dispositivos de microfluidos actúan como cámaras de reacción individuales protegidas de la contaminación a través del ensuciamiento del dispositivo por la fase continua. Los beneficios de la síntesis que utiliza este régimen (en comparación con los procesos por lotes) incluyen alto rendimiento , experimentos continuos, bajo desperdicio, portabilidad y un alto grado de control sintético. [164] Algunos ejemplos de posibles síntesis son la creación de microesferas semiconductoras [165] y nanopartículas . [166] La detección química está integrada en el dispositivo para garantizar un control cuidadoso de las reacciones, se utilizan espectroscopia de RMN , microscopía , detección electroquímica y detección quimioluminiscente . A menudo, las mediciones se toman en diferentes puntos a lo largo del dispositivo microfluídico para monitorear el progreso de la reacción. [164]
Se observa un aumento de la velocidad de las reacciones utilizando microgotas en la reacción aldólica de los éteres de sililo enol y los aldehídos . Utilizando un dispositivo microfluídico basado en gotas , los tiempos de reacción se acortaron a veinte minutos frente a las veinticuatro horas necesarias para un proceso por lotes. [26] Otros experimentadores pudieron demostrar una alta selectividad del cis- estilbeno al trans -estilbeno termodinámicamente favorecido en comparación con la reacción por lotes, lo que demuestra el alto grado de control proporcionado por las gotas del microrreactor. Este estereocontrol es beneficioso para la industria farmacéutica. [167] Por ejemplo, el L- metotrexato , un fármaco utilizado en quimioterapia , se absorbe más fácilmente que el isómero D.
La fabricación de cristales líquidos ha sido un tema de intriga durante más de 5 décadas [168] por sus propiedades anisotrópicas . Los dispositivos microfluídicos se pueden utilizar para la síntesis de cristales líquidos colestéricos confinados mediante la superposición de múltiples capas similares a conchas que consisten en emulsiones variables de aceite en agua y agua en aceite. [169] La construcción de cristales líquidos encapsulados mediante el flujo microfluídico de gotitas de cristal líquido en un aceite inmiscible permite un espesor y una composición de la capa de emulsión monodispersa nunca antes vistos antes de la llegada de las técnicas microfluídicas. La llegada de la tecnología de cristal líquido ha llevado a avances en las pantallas ópticas utilizadas tanto en investigación como en productos de marca para el consumidor, pero descubrimientos más recientes han abierto la puerta a la combinación de fotones y conversión ascendente, así como a sensores ópticos para analitos biológicos. [170]
Las partículas avanzadas y los materiales basados en partículas, como partículas de polímero, microcápsulas , nanocristales y grupos o perlas de cristales fotónicos se pueden sintetizar con la ayuda de microfluidos basados en gotitas. [171] Las nanopartículas , como las nanopartículas de núcleo-capa de CdS coloidal y CdS/CdSe, también se pueden sintetizar a través de múltiples pasos en una escala de tiempo de milisegundos en un sistema basado en gotitas microfluídicas. [172]
Las nanopartículas, micropartículas y cúmulos coloidales en dispositivos microfluídicos son útiles para funciones como la administración de fármacos. [173] Las primeras partículas incorporadas en sistemas basados en gotitas fueron geles de sílice en el rango de tamaño micrométrico para probar sus aplicaciones en la fabricación de pantallas y recubrimientos ópticos. [174] Mezclar partículas sólidas con microgotitas acuosas requiere cambios en los canales microfluídicos, como mezclas de reactivos adicionales y la elección de materiales específicos, como sílice o polímeros, que no interfieran con los canales y las sustancias bioactivas que contienen las gotitas. [ cita requerida ]
La síntesis de copolímeros requiere moler moléculas macroscópicas para formar micropartículas con superficies porosas e irregulares utilizando disolventes orgánicos y técnicas de emulsificación. Estas gotitas precargadas con micropartículas también se pueden procesar rápidamente utilizando irradiación UV. [175] La caracterización de estas micropartículas y nanopartículas implica la microimagen para analizar la estructura y la identificación del material macroscópico que se está moliendo. Las técnicas como la encapsulación controlada de burbujas de gas individuales para crear nanopartículas huecas para sintetizar microburbujas con contenidos específicos son vitales para los sistemas de administración de fármacos. Tanto las micropartículas de sílice como las de titanio se utilizan como cubiertas duraderas después de utilizar gas para aumentar la velocidad de flujo de la fase acuosa. Una mayor velocidad de flujo permite un mayor control sobre el espesor de las cubiertas acuosas. [ cita requerida ] La versatilidad emergente de las nanopartículas se puede ver en la administración de microgotas cargadas de partículas que se utilizan en inyecciones de depósito para la administración de fármacos en lugar del enfoque típico de inyectar fármacos por vía intravenosa . Esto es posible gracias al bajo espesor de las capas, que normalmente se encuentran en el rango de 1 a 50 μm. [ cita requerida ]
Los avances más recientes en partículas microfluídicas permitieron la síntesis de partículas de tamaño nanométrico a partir de polímeros derivados biológicamente. Mediante el uso de diseños multifásicos específicos de enfoque de flujo que controlan la velocidad de flujo y la temperatura, se puede controlar el tamaño de formación de nanopartículas junto con la concentración y configuración de las gotitas. [175] [176] Otra técnica para crear microgotitas cargadas de partículas es el uso de nanopartículas de hidrogel lipídico que se pueden manipular para formar gotitas de forma más estrecha, lo que resulta útil cuando se deben utilizar materiales blandos o quebradizos. [177] Estos materiales blandos son especialmente importantes en la producción de polvos . Se están produciendo avances recientes en la nanoescala, como dispositivos que fabrican gotitas esféricas y no esféricas que se mezclan de manera ultrarrápida y homogénea para la producción a gran escala de partículas en polvo en aplicaciones industriales. [178]
Las nanopartículas monodispersas también son de gran interés en la fabricación de catalizadores . La eficiencia de muchos sistemas catalíticos heterogéneos depende de las grandes áreas superficiales de las partículas de metales de transición. [179] Se han utilizado técnicas microfluídicas para fabricar nanopartículas de oro mediante la interacción interfacial de gotitas que contienen cloruro de oro, hexano y un agente reductor con una fase acuosa circundante. Este proceso también puede controlar tanto el tamaño como la forma de las nanopartículas/nanoláminas con precisión y alto rendimiento [180] en comparación con otros métodos como la deposición física de vapor .
Se ha demostrado que el uso de gotitas que contienen diversos materiales, como sílice o metales de transición como el oro, que fluyen a través de una fase de aceite inmiscible es eficaz para controlar tanto el tamaño de las nanopartículas como el tamaño de los poros, lo que permite el diseño de dispositivos de captura de gases absorbentes eficientes [181] y catalizadores heterogéneos. Se han sintetizado nanopartículas monodispersas de oro y plata utilizando gotitas de cloruro de oro y plata dosificadas con un agente reductor para escindir los enlaces metal-ligando, lo que conduce a la aglomeración de nanopartículas metálicas monodispersas que se pueden filtrar fácilmente de la solución. [182]
La síntesis de partículas de gel, también conocidas como hidrogeles, microgeles y nanogeles, ha sido un área de interés para investigadores e industrias por igual durante las últimas décadas. [183] Un enfoque basado en microfluidos para sintetizar estas partículas de hidrogel es una herramienta útil, debido al alto rendimiento, la monodispersidad de las partículas y la reducción de costos mediante el uso de pequeños volúmenes de reactivos. Uno de los desafíos clave al principio en el campo de los geles fue la formación de partículas monodispersas. Inicialmente, se utilizaron técnicas basadas en polimerización para formar micropartículas a granel que eran polidispersas en tamaño. [184] [185] [186] [187] Estas técnicas generalmente se centraban en el uso de una solución acuosa que se mezclaba vigorosamente para crear emulsiones. Finalmente, se desarrolló una técnica para crear microgeles biodegradables monodispersos mediante la elaboración de emulsiones O/W en una geometría de canal generador de gotas en línea. [188] Esta geometría de unión acompañada de una fase continua cargada de surfactante fue responsable de la creación de microgeles hechos de poli-dex-HEMA. Otras geometrías de dispositivos, incluida la formación de estilo de unión en T, también son viables y se han utilizado para fabricar geles a base de sílice. [189]
Una vez que se establecieron estos métodos, los esfuerzos se centraron en aplicar funcionalidad a estas partículas. Los ejemplos incluyen partículas encapsuladas de bacterias, partículas encapsuladas de fármacos o proteínas y partículas de gel magnético. [190] Insertar estos componentes funcionales en la estructura del gel puede ser tan simple como integrar el componente en la fase dispersa. En algunos casos, se prefieren ciertas geometrías de dispositivo, por ejemplo, se utilizó una unión de enfoque de flujo para encapsular bacterias en micropartículas de agarosa. [191] Las emulsiones múltiples son de interés para aplicaciones farmacéuticas y cosméticas [192] y se forman utilizando dos uniones de enfoque de flujo consecutivas. [193] También se pueden sintetizar partículas más complicadas, como las partículas Janus, que tienen superficies con dos o más propiedades físicas distintas. [194]
Algunos ejemplos de la creciente aplicación de partículas de gel incluyen la administración de fármacos, aplicaciones biomédicas e ingeniería de tejidos, y muchas de estas aplicaciones requieren partículas monodispersas donde se prefiere un enfoque basado en microfluidos. [195] [196] Sin embargo, los métodos de emulsificación a granel siguen siendo relevantes, ya que no todas las aplicaciones requieren micropartículas uniformes. El futuro de la síntesis microfluídica de geles puede residir en el desarrollo de técnicas para crear grandes cantidades de estas partículas uniformes con el fin de que estén más disponibles comercialmente/industrialmente. [197]
Los recientes avances en microfluidos de gotas también han permitido la síntesis in situ de fibras de hidrogel que contienen gotas acuosas con morfología controlada. [198] Las fibras de hidrogel proporcionan una opción interesante para material biocompatible para la administración de fármacos y la bioimpresión de materiales que pueden imitar el comportamiento de una matriz extracelular. Este método de microfluidos se diferencia de la ruta de síntesis tradicional de hilado húmedo mediante el uso de gotas acuosas en una corriente de aceite inmiscible en lugar de la extrusión de una solución a granel de la misma composición mezclada fuera del sitio. [199] La capacidad de controlar el tamaño, la velocidad de flujo y la composición de las gotas proporciona una opción para ajustar con precisión la morfología de las fibras para que se ajusten a un uso específico en bioanálisis y emulación de funciones anatómicas. [200]
La extracción líquido-líquido es un método utilizado para separar un analito de una mezcla compleja; con este método, los compuestos se separan en función de su solubilidad relativa en diferentes fases líquidas inmiscibles. [201] [202] Para superar algunas de las desventajas asociadas con los métodos de sobremesa comunes, como el método del matraz agitado, [203] se han empleado métodos de extracción líquido-líquido microfluídicos. Los sistemas basados en gotas microfluídicas han demostrado la capacidad de manipular volúmenes discretos de fluidos en fases inmiscibles con números de Reynolds bajos. [204] y regímenes de flujo laminar. [5] Los métodos de microescala reducen el tiempo necesario, reducen el volumen de muestra y reactivo y permiten la automatización e integración. [18] [205] En algunos estudios, el rendimiento de la extracción microfluídica basada en gotas se compara estrechamente con el método del matraz agitado. [206] Un estudio que comparó los métodos de extracción líquido-líquido mediante agitación en matraz y microfluídico para 26 compuestos encontró una estrecha correlación entre los valores obtenidos (R2 = 0,994). [207]
También se ha demostrado que los dispositivos de extracción líquido-líquido microfluídicos se pueden integrar con otros instrumentos para la detección de los analitos extraídos. [208] [48] Por ejemplo, la extracción microfluídica se podría utilizar para extraer un analito inicialmente en una fase acuosa como la cocaína en la saliva y luego interconectarlo con espectroscopia IR en chip para su detección. [209] La extracción líquido-líquido microfluídica ha demostrado ser ventajosa en numerosas aplicaciones, como estudios farmacocinéticos de fármacos donde solo se necesitan pequeñas cantidades de células, [210] [48] y en estudios adicionales donde se requieren volúmenes de reactivos más pequeños. [5]
Los sistemas microfluídicos basados en gotitas se pueden acoplar a métodos de separación para tareas específicas. Las técnicas de separación comunes acopladas a los sistemas microfluídicos basados en gotitas incluyen la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y la electroforesis .
Muchas formas de cromatografía, incluyendo la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), la cromatografía líquida de ultra rendimiento de nanoflujo (nano-UPLC o nano-LC) y la cromatografía de flujo capilar bidimensional (LC capilar), se han integrado en el campo de la microfluídica basada en gotas. [211] [212] [213] En la microescala, las técnicas de separación química como la HPLC se pueden utilizar tanto en análisis biológicos como químicos. [214] [215] [216] Dentro del campo de la microfluídica, estas técnicas se han aplicado a sistemas microfluídicos en tres etapas diferentes del proceso microfluídico. Las columnas HPLC fuera del chip se utilizan para separar analitos antes de introducirlos en un dispositivo microfluídico para su fraccionamiento y análisis. [214] Las columnas HPLC también se pueden construir directamente en chips de laboratorio microfluídicos creando dispositivos híbridos monolíticos capaces de separación química, así como de formación y manipulación de gotas. [215] [217] Además, la HPLC se utiliza al final de la química microfluídica basada en gotas como una forma de purificar, analizar y cuantificar los productos de un experimento. [218] [219] [220]
Los dispositivos microfluídicos basados en gotitas acoplados a HPLC tienen una alta sensibilidad de detección, utilizan bajos volúmenes de reactivos, tienen tiempos de análisis cortos y una contaminación cruzada mínima de analitos, lo que los hace eficientes en muchos aspectos. [221] Sin embargo, todavía hay problemas asociados con la cromatografía a microescala, como la dispersión de bandas separadas, la difusión y el "volumen muerto" en los canales después de la separación. [215] Una forma de evitar estos problemas es el uso de gotitas para compartimentar las bandas de separación, lo que combate la difusión y la pérdida de analitos separados. [216] En los primeros intentos de integrar la cromatografía con la microfluídica de gotitas, los caudales y presiones más bajos requeridos para la LC capilar 2-D proporcionaron un obstáculo menor para superar en la combinación de estas tecnologías y hicieron posible acoplar múltiples técnicas de separación 2-D en un dispositivo (es decir, HPLC x LC , LC x LC y HPLC x HPLC). [213] Los muestreadores automáticos de HPLC que se introducen en dispositivos microfluídicos han aprovechado la dispersión que se produce entre la separación y la formación de gotitas para introducir pulsos de gradiente de analitos en dispositivos microfluídicos, donde la producción de miles de gotitas de picolitros captura concentraciones únicas de analito. [222] Enfoques similares han utilizado las capacidades de extracción de una bomba de jeringa para alinear los caudales relativamente altos necesarios para la HPLC con los caudales más bajos del medio continuo común en los dispositivos microfluídicos. [214] El desarrollo de la nano-LC, o nano-UPLC, ha proporcionado otra oportunidad para el acoplamiento con dispositivos microfluídicos, de modo que se puedan formar grandes bibliotecas de gotitas con múltiples dimensiones de información almacenadas en cada gotita. En lugar de identificar picos y almacenarlos como una sola muestra, como se ve en la LC estándar, estas bibliotecas de gotitas permiten conservar la concentración específica del analito junto con su identidad. [211] Además, la capacidad de realizar fraccionamiento de alta frecuencia inmediatamente a partir del eluyente de una columna nano-LC aumenta enormemente la resolución de pico y mejora la calidad general de separación en comparación con los dispositivos nano-LC de flujo continuo. [212]
En primer lugar, se construyó una columna HPLC directamente en un dispositivo microfluídico utilizando TPE en lugar de PDMS para la fabricación del dispositivo. [215] La resistencia adicional del TPE lo hizo capaz de soportar las presiones más altas necesarias para la HPLC, de modo que un solo chip de laboratorio microfluídico pudiera realizar la separación química, el fraccionamiento y la manipulación adicional de las gotas. [215] Para aumentar la calidad del resultado cromatográfico, los dispositivos más resistentes hechos de vidrio han demostrado la capacidad de soportar una presión mucho mayor que el TPE. Lograr estas presiones más altas para aumentar el grado de separación y eliminar todos los volúmenes muertos mediante la formación inmediata de gotas ha demostrado el potencial de la microfluídica de gotas para expandir y mejorar las capacidades de las separaciones por HPLC. [217]
La electroforesis capilar (CE) y la electroforesis en gel microcapilar (μCGE) son métodos de electroforesis en microchip (MCE) bien reconocidos que pueden proporcionar numerosas ventajas analíticas, incluyendo alta resolución, alta sensibilidad y acoplamiento eficaz a la espectrometría de masas (MS). [223] [224] [225] La electroforesis en microchip se puede aplicar generalmente como un método para procesos de cribado de alto rendimiento que ayudan a descubrir y evaluar fármacos. [224] Utilizando MCE, específicamente CE, se crean dispositivos de electroforesis en gel microcapilar (μCGE) para realizar el procesamiento de muestras de ADN de gran número, lo que lo convierte en un buen candidato para el análisis de ADN. [225] [226] Los dispositivos μCGE también son prácticos para fines de separación porque utilizan separación, caracterización, encapsulación y selección en línea de diferentes analitos que se originan a partir de una muestra compuesta. [225] Todas estas ventajas de los métodos MCE se traducen en dispositivos microfluídicos. La razón por la que los métodos MCE se acoplan a dispositivos microfluídicos basados en gotitas es debido a la capacidad de analizar muestras en la escala de nanolitros. [227] El uso de métodos MCE a pequeña escala reduce el costo y el uso de reactivos. [225] De manera similar a la HPLC, las técnicas de detección basadas en fluorescencia se utilizan para la electroforesis capilar, lo que hace que estos métodos sean prácticos y se puedan aplicar a campos como la biotecnología, la química analítica y el desarrollo de fármacos. [228] Estos MCE y otros métodos basados en electroforesis comenzaron a desarrollarse una vez que la electroforesis capilar ganó popularidad en la década de 1980 y ganó aún más atención a principios de la década de 1990, ya que fue revisada casi 80 veces en el año 1992. [229]
La espectrometría de masas (MS) es una técnica de detección casi universal que se reconoce en todo el mundo como el estándar de oro para la identificación de muchos compuestos. La MS es una técnica analítica en la que las especies químicas se ionizan y clasifican antes de la detección, y el espectro de masas resultante se utiliza para identificar las moléculas progenitoras de los iones. Esto hace que la MS, a diferencia de otras técnicas de detección (como la fluorescencia), no tenga marcadores; es decir, no es necesario unir ligandos o grupos adicionales a la molécula de interés para recibir una señal e identificar el compuesto.
La espectrometría de masas (MS) es una técnica de detección casi universal que se reconoce en todo el mundo como el estándar de oro para la identificación de muchos compuestos. La MS es una técnica analítica en la que las especies químicas se ionizan y clasifican antes de la detección, y el espectro de masas resultante se utiliza para identificar las moléculas progenitoras de los iones. Esto hace que la MS, a diferencia de otras técnicas de detección (como la fluorescencia ), no tenga marcadores; es decir, no es necesario unir ligandos o grupos adicionales a la molécula de interés para recibir una señal e identificar el compuesto.
Hay muchos casos en los que otros métodos espectroscópicos, como la resonancia magnética nuclear ( RMN ), la fluorescencia , los infrarrojos o Raman , no son viables como métodos independientes debido a la composición química particular de las gotitas. A menudo, estas gotitas son sensibles a las etiquetas fluorescentes , [63] o contienen especies que de otro modo son indeterminadamente similares, donde la MS se puede emplear junto con otros métodos para caracterizar un analito específico de interés. [230] [231] Sin embargo, la MS solo recientemente (en la última década) ha ganado popularidad como un método de detección para microfluídica basada en gotitas (y microfluídica en su conjunto) debido a los desafíos asociados con el acoplamiento de espectrómetros de masas con estos dispositivos miniaturizados. [232] [233] [234] La dificultad de separación/purificación hace que los sistemas a escala completamente microfluídica acoplados a la espectrometría de masas sean ideales en los campos de la proteómica, [235] [63] [236] [237] la cinética enzimática, [238] el descubrimiento de fármacos, [239] y la detección de enfermedades en recién nacidos. [240] Los dos métodos principales de ionización para el análisis de masas utilizados en la microfluídica basada en gotitas en la actualidad son la desorción/ionización láser asistida por matriz ( MALDI ) [241] [242] y la ionización por electrospray ( ESI ). [63] También se están desarrollando métodos adicionales para el acoplamiento, como (pero no limitados a) la nebulización de ondas acústicas de superficie ( SAWN ), [243] y la ionización por pulverización de papel sobre MS miniaturizada, [244] . [232] [245]
Una complicación que ofrece el acoplamiento de MS a la microfluídica basada en gotitas es que las muestras dispersas se producen a velocidades de flujo comparativamente bajas en comparación con las técnicas de inyección de MS tradicionales. ESI puede aceptar fácilmente estas velocidades de flujo bajas y ahora se explota comúnmente para el análisis microfluídico en línea. [232] [223] [246] [247] ESI y MALDI ofrecen una respuesta de alto rendimiento al problema de la detección de gotitas sin etiqueta, pero ESI requiere elementos de preparación y fabricación de muestras menos intensivos que sean escalables a escala de dispositivo microfluídico. [235] [247] [246] [248] ESI implica la aplicación de un alto voltaje a una corriente portadora de gotitas que contienen analito, que aerosoliza la corriente, seguida de la detección en una región analizadora de potencial diferenciado. El fluido portador dentro de un dispositivo microfluídico basado en gotitas, típicamente un aceite, es a menudo un obstáculo dentro de ESI. El aceite, cuando forma parte del flujo de gotitas que entran en un instrumento ESI-MS, puede provocar un voltaje de fondo constante que interfiere con la detección de gotitas de muestra. [223] Esta interferencia de fondo se puede rectificar cambiando el aceite utilizado como fluido portador y ajustando el voltaje utilizado para el electrospray. [223] [235]
El tamaño de las gotas, la forma del cono de Taylor y el caudal se pueden controlar variando el diferencial de potencial y la temperatura de una corriente de gas (normalmente nitrógeno) que seca (para evaporar el disolvente que rodea al analito). [249] Debido a que la ESI permite la detección de gotas en línea, se pueden resolver otros problemas planteados por los sistemas de detección segmentados o fuera del chip, como la minimización de la dilución de la muestra (gota), que es especialmente crítica para la detección de gotas microfluídica donde las muestras de analito ya están diluidas a la concentración experimentalmente relevante más baja. [250]
MALDI se caracteriza por el uso de un láser ultravioleta ( UV ) para activar la ablación de especies de analito que se mezclan con una matriz de moléculas cristalizadas con alta absorción óptica. [234] Los iones dentro de los gases ablacionados resultantes se protonan o desprotonan antes de la aceleración en un espectrómetro de masas. Las principales ventajas de la detección MALDI sobre ESI en dispositivos microfluídicos son que MALDI permite una multiplexación mucho más fácil , [251] [252] lo que aumenta aún más el rendimiento general del dispositivo , [242] así como una menor dependencia de las partes móviles y la ausencia de problemas de estabilidad del cono de Taylor planteados por las tasas de flujo a escala microfluídica. [253] [254] La velocidad de la detección MALDI, junto con la escala de las gotitas microfluídicas, permite mejoras en las técnicas de escala macro tanto en el rendimiento como en la resolución del tiempo de vuelo ( TOF ). [238] [242] Mientras que las configuraciones de detección de MS típicas a menudo utilizan técnicas de separación como la cromatografía, las configuraciones MALDI requieren que se mezcle una muestra suficientemente purificada con matrices orgánicas predeterminadas, adecuadas para la muestra específica, antes de la detección. [236] La composición de la matriz MALDI debe ajustarse para producir una fragmentación y ablación adecuadas de los analitos.
Un método para obtener una muestra purificada a partir de microfluidos basados en gotitas es terminar el canal microfluídico en una placa MALDI, con gotitas acuosas formándose en regiones hidrofílicas en la placa. [234] [252] [253] [255] Luego se deja que el solvente y el fluido portador se evaporen, dejando atrás solo las gotitas secas de la muestra de interés, después de lo cual se aplica la matriz MALDI a las gotitas secas. Esta preparación de muestra tiene limitaciones y complicaciones notables, que actualmente no se superan para todos los tipos de muestras. Además, las matrices MALDI se encuentran preferentemente en concentraciones mucho más altas que la muestra de analito, lo que permite que el transporte de gotitas microfluídicas se incorpore a la producción de matrices MALDI en línea. Debido al bajo número de matrices conocidas y la naturaleza de prueba y error para encontrar nuevas composiciones de matriz apropiadas, [256] esto puede ser el factor determinante en el uso de otras formas de espectroscopia en lugar de MALDI. [234] [232] [257]
La espectroscopia Raman es una técnica espectroscópica que proporciona un análisis no destructivo capaz de identificar componentes dentro de mezclas con especificidad química sin una preparación compleja de la muestra. [258] La espectroscopia Raman se basa en la dispersión de fotones después de la radiación de luz visible, donde el cambio en las energías de los fotones corresponde a información sobre los modos vibracionales del sistema y sus frecuencias. Al obtener las frecuencias de los modos vibracionales, se pueden realizar y reforzar clasificaciones cualitativas sobre el sistema. [259]
La espectroscopia Raman funciona bien en paralelo con dispositivos microfluídicos para muchas aplicaciones biológicas cualitativas. [260] Para algunas aplicaciones, la espectroscopia Raman se prefiere sobre otros métodos de detección como la espectroscopia infrarroja (IR) ya que el agua tiene una fuerte señal de interferencia con IR pero no con Raman. [261] [262] Del mismo modo, métodos como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), resonancia magnética nuclear (RMN), espectrometría de masas (MS) o cromatografía de gases (GC) tampoco son ideales ya que estos métodos requieren tamaños de muestra más grandes. Dado que la microfluídica permite experimentos con volúmenes pequeños (incluido el análisis de células individuales o pocas células), Raman es un método de detección microfluídica líder. Específicamente, la integración de Raman con dispositivos microfluídicos tiene fuertes aplicaciones en sistemas donde la identificación de lípidos es necesaria, común en la investigación de biocombustibles . [263] [264] Por ejemplo, un ensayo de fluorescencia de lípidos no es lo suficientemente selectivo y, por lo tanto, no puede identificar diferencias moleculares de la forma en que Raman puede hacerlo a través de vibraciones moleculares. [265] Raman, cuando se combina con dispositivos microfluídicos, también puede monitorear la mezcla de fluidos y la captura de líquidos y también puede detectar fases sólidas y gaseosas dentro de plataformas microfluídicas, una capacidad que es aplicable al estudio de la solubilidad gas-líquido. [266] [267]
La espectroscopia Raman en dispositivos microfluídicos se aplica y detecta utilizando fibras ópticas integradas [268] dentro de un chip microfluídico o colocando el dispositivo en un microscopio Raman . [269] Además, algunos sistemas microfluídicos utilizan coloides metálicos [270] o nanopartículas [271] [272] dentro de la solución para aprovechar la espectroscopia Raman de superficie mejorada (SERS). [273] La SERS puede mejorar la dispersión Raman hasta en un factor de 10 11 formando complejos de transferencia de carga en las superficies. [274] [275] De ello se deduce que estos dispositivos se fabrican comúnmente con membranas de policarbonato nanoporoso que permiten un fácil recubrimiento de nanopartículas . [276] Sin embargo, si se fabrican con polidimetilsiloxano (PDMS), puede producirse interferencia de señal con el espectro Raman. El PDMS genera una fuerte señal Raman que puede dominar e interferir fácilmente con la señal deseada. [277] Una solución común para esto es fabricar el dispositivo microfluídico de tal manera que se pueda usar un orificio confocal para el láser Raman. [264] La microscopía Raman confocal típica permite obtener información espectroscópica de pequeños volúmenes focales de menos de 1 micrón cúbico y, por lo tanto, más pequeños que las dimensiones del canal microfluídico. [269] La señal Raman es inherentemente débil; por lo tanto, para tiempos de detección cortos en pequeños volúmenes de muestra en dispositivos microfluídicos, se utiliza la amplificación de la señal. La espectroscopia Raman multifotón, como la espectroscopia Raman estimulada (SRS) o la espectroscopia Raman anti-Stokes coherente (CARS), ayudan a mejorar las señales de las sustancias en los dispositivos microfluídicos. [278]
En el caso de la microfluídica basada en gotitas, la detección Raman permite el análisis en línea de múltiples analitos dentro de gotitas o de la fase continua. La señal Raman es sensible a los cambios de concentración, por lo que la solubilidad y la cinética de mezcla de un sistema microfluídico basado en gotitas se pueden detectar mediante Raman. [267] [269] Las consideraciones incluyen la diferencia del índice de refracción en la interfaz de la gotita y la fase continua, así como entre las conexiones de fluido y canal. [266] [269] [279]
La espectroscopia de fluorescencia es una de las técnicas de detección de gotitas más comunes. [280] Proporciona una respuesta rápida y, para los analitos aplicables, tiene una señal fuerte. [281] El uso de la espectroscopia de fluorescencia en microfluídica sigue un formato similar a la mayoría de las otras técnicas analíticas fluorescentes. Se utiliza una fuente de luz para excitar las moléculas de analito en la muestra, después de lo cual el analito fluoresce, y la respuesta de fluorescencia es el resultado medido. Se pueden utilizar cámaras para capturar la señal de fluorescencia de las gotitas, [282] y a menudo se utilizan filtros para filtrar la luz de excitación dispersa. En la detección de gotitas microfluídicas, la configuración experimental de un instrumento de fluorescencia puede variar mucho. Una configuración común en la detección de gotitas fluorescentes es con el uso de un microscopio de epifluorescencia . [280] Esto a veces utiliza una geometría confocal, que puede variar según las necesidades experimentales. Por ejemplo, Jeffries et al. informaron el éxito con la exploración de una geometría confocal ortogonal, en oposición a una geometría epi estándar. [280] Sin embargo, se han explorado otras configuraciones para la detección de fluorescencia, ya que los microscopios de epifluorescencia pueden ser costosos y difíciles de mantener. [281] Cole et al. han propuesto y probado una configuración experimental con fibra óptica para realizar análisis de fluorescencia de gotas microfluídicas.
La detección de fluorescencia de gotitas tiene varias ventajas. En primer lugar, puede adaptarse a un gran y rápido rendimiento. [280] El análisis de miles de muestras se puede realizar en un corto período de tiempo, lo que es ventajoso para el análisis de una gran cantidad de muestras. [283] Otra ventaja es la precisión del método. En un análisis realizado por Li et al., se descubrió que el uso de técnicas de detección de fluorescencia produjo una precisión de detección del 100 % en 13 de las 15 imágenes recopiladas. Las dos restantes tenían errores relativos de alrededor del 6 %. [282] Otra ventaja de la detección de fluorescencia es que permite el análisis cuantitativo del espaciamiento de las gotitas en una muestra. [284] Esto se hace mediante el uso de mediciones temporales y la velocidad de flujo del analito. [285] El espaciamiento temporal entre señales permite el cálculo del espaciamiento de las gotitas. Se puede utilizar un análisis de fluorescencia adicional de muestras de gotitas microfluídicas para medir la vida útil fluorescente de las muestras, lo que proporciona información adicional que no se puede obtener solo con mediciones de intensidad de fluorescencia. [286]
Las aplicaciones de la detección de fluorescencia son variadas, y muchos de sus usos se centran en aplicaciones biológicas. Frenz et al. utilizaron la detección de fluorescencia de gotitas para examinar la cinética enzimática. Para este experimento, la b-lactamasa interactuó con fluorocilina, un sustrato fluorogénico. La fluorescencia de las gotitas se midió en múltiples intervalos de tiempo para examinar el cambio con el tiempo. [27] Sin embargo, este método de detección va más allá de las aplicaciones biológicas y permite el estudio físico de la formación y evolución de las gotitas. Por ejemplo, Sakai et al. utilizaron la detección de fluorescencia para monitorear el tamaño de las gotitas. [287] Esto se hizo recopilando datos de fluorescencia para calcular la concentración de un tinte fluorescente dentro de una sola gotita, lo que permitió monitorear el crecimiento del tamaño. El uso de técnicas de detección de fluorescencia se puede ampliar a aplicaciones más allá de la recopilación de datos; un método ampliamente utilizado de clasificación de células y gotitas en microfluídica es la clasificación activada por fluorescencia, donde las gotitas se clasifican en diferentes canales o salidas de recolección en función de su intensidad de fluorescencia. [91]
Los puntos cuánticos fluorescentes se han utilizado para desarrollar plataformas de biodetección [288] y administración de fármacos en dispositivos microfluídicos. Los puntos cuánticos son útiles debido a su pequeño tamaño, longitud de onda de excitación precisa y alto rendimiento cuántico . [288] [289] Estas son ventajas sobre los tintes tradicionales que pueden interferir con la actividad del compuesto estudiado. [289] Sin embargo, la creación y conjugación en masa de puntos cuánticos con moléculas de interés sigue siendo un desafío. [288] [290] Los dispositivos microfluídicos que conjugan nucleótidos con puntos cuánticos se han diseñado para resolver este problema al reducir significativamente el tiempo de conjugación de dos días a minutos. [291] [290] Los conjugados de ADN-punto cuántico son importantes para detectar ADN complementario y miRNA en sistemas biológicos. [292]
La detección electroquímica sirve como una alternativa económica no solo para medir la composición química en ciertos casos, sino también la longitud, frecuencia, conductividad y velocidad de las gotas a altas velocidades y, por lo general, con muy poca compensación de espacio en el chip. [66] [283] El método se discutió por primera vez en Luo et al., donde el equipo pudo medir con éxito el tamaño y la concentración de iones en gotas de picolitros que contenían iones de NaCl disueltos. [293] Por lo general, se realiza con un conjunto o serie de microelectrodos que miden las perturbaciones de la corriente, las gotas más pequeñas dan perturbaciones más pequeñas, mientras que las gotas más grandes dan curvas más largas. El número de perturbaciones en la corriente también puede indicar la frecuencia de las gotas que pasan por el electrodo como una forma de determinar también la tasa de gotas. [294] Se han sugerido varios compuestos diferentes para su uso dentro de los electrodos, ya que las lecturas precisas, exactas y significativas pueden ser difíciles dentro de la microescala. Estos compuestos van desde electrodos de pasta de carbono que se aplican directamente al chip, hasta platino negro electrodepositado sobre alambre de platino junto con un microelectrodo de cloruro de plata sobre plata para aumentar la actividad y el área de superficie. [295]
En cuanto a la composición química, las lecturas se logran a través del análisis cronoamperométrico de compuestos electroactivos dentro de las gotitas como se indicó anteriormente. El potencial varía dependiendo de los iones eléctricamente viables, iones de sodio y cloro disueltos en este experimento, y sus concentraciones dentro de cada gotita. [283] [294] Otro grupo demostró, con una serie de controles, que la composición de gotitas mixtas que involucraban yoduro de potasio se detectó con precisión en la escala de tiempo de segundos con rangos óptimos de voltaje, velocidad y pH. [296] Además de esto, se está desarrollando un enfoque más exclusivo dentro de las lecturas cronoamperométricas, donde se han creado sistemas magnetofluídicos y las lecturas de potencial se miden en fluidos electroinactivos por la disolución de micropartículas magnéticas en el reactivo. [297] Este método se mejora en un entorno de microfluidos digitales (DMF), donde los electrodos de oro y plata en unión con micropartículas magnéticas disueltas en los fluidos reemplazaron la detección típica basada en fluorescencia de gotitas en el inmunoensayo de analitos biomarcadores. [298]
El experimento anterior de Shamsi et al. alude al uso principal de la detección electroquímica en microfluídica; biodetección para diversas mediciones, como la cinética enzimática y los ensayos biológicos de muchos otros tipos de células. [299] [300] Se necesita un mayor control del sistema para estos procesos, ya que al aumentar la velocidad de flujo, la detección de enzimas disminuye. Aunque a medida que progresa una reacción enzimática, la lectura amperométrica también evolucionará, lo que permitirá un rápido monitoreo de la cinética. [301] Además, los surfactantes específicos pueden carecer de biocompatibilidad con el sistema, lo que afecta la enzima y sesga la detección. [302] Los alcances de esta aplicación incluso han tenido efectos en la acuicultura y la economía, ya que la detección electroquímica se ha utilizado para probar la frescura del pescado rápidamente. [301] El uso de este método de detección se encuentra principalmente en la electrohumectación de DMF dieléctricos, donde el aparato de electrodos de detección puede ser reconfigurable y tiene una vida útil más larga al mismo tiempo que produce resultados precisos. [303]
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