El azul brillante de Coomassie es el nombre de dos colorantes trifenilmetano similares que se desarrollaron para su uso en la industria textil, pero que ahora se utilizan comúnmente para teñir proteínas en bioquímica analítica . El azul brillante de Coomassie G-250 se diferencia del azul brillante de Coomassie R-250 por la adición de dos grupos metilo . El nombre "Coomassie" es una marca registrada de Imperial Chemical Industries .
El nombre Coomassie fue adoptado a finales del siglo XIX como nombre comercial por el fabricante de tintes Levinstein Ltd , con sede en Blackley , para comercializar una gama de tintes ácidos para lana . [2] En 1896, durante la Cuarta Guerra Anglo-Ashanti , las fuerzas británicas habían ocupado la ciudad de Coomassie (actual Kumasi en Ghana ). En 1918, Levinstein Ltd pasó a formar parte de British Dyestuffs, que en 1926 pasó a formar parte de Imperial Chemical Industries. [3] Aunque ICI todavía posee la marca registrada Coomassie, la empresa ya no fabrica los tintes.
Los colorantes azules de trifenilmetano disulfonado fueron producidos por primera vez en 1913 por Max Weiler, que tenía su base en Elberfeld , Alemania. [4] Posteriormente se obtuvieron varias patentes sobre la síntesis orgánica. [5] [6] [7]
Los artículos publicados en revistas de bioquímica suelen referirse a estos colorantes simplemente como "Coomassie" sin especificar qué colorante se utilizó. De hecho, el Índice de colores enumera más de 40 colorantes que tienen "Coomassie" en su nombre. También hay otros colorantes "azules" de Coomassie. Por ejemplo, el Índice Merck (10.ª edición) enumera el Azul de Coomassie RL (Azul ácido 92, CI 13390), que tiene una estructura completamente diferente.
El sufijo "R" en el nombre del azul brillante de Coomassie R-250 es una abreviatura de "rojo", ya que el color azul del tinte tiene un ligero matiz rojizo. En la variante "G", el color azul tiene un matiz más verdoso. El "250" indicaba originalmente la pureza del tinte.
El color de los dos colorantes depende de la acidez de la solución. La forma "G" del colorante se ha estudiado en detalle. [8] A un pH inferior a 0, el colorante tiene un color rojo con un máximo de absorción a una longitud de onda de 465 nm. A un pH de alrededor de 1, el colorante es verde con un máximo de absorción a 620 nm, mientras que por encima de un pH de 2, el colorante es azul brillante con un máximo a 595 nm. A un pH de 7, el colorante tiene un coeficiente de extinción de 43 000 M −1 cm −1 . [8]
Los diferentes colores son el resultado de los diferentes estados de carga de la molécula del colorante. En la forma roja, los tres átomos de nitrógeno tienen una carga positiva. Los dos grupos de ácido sulfónico tienen un p K a extremadamente bajo y normalmente estarán cargados negativamente, por lo que a un pH de alrededor de cero el colorante será un catión con una carga total de +1. El color verde corresponde a una forma del colorante sin carga total neta. En un medio neutro (pH 7), solo el átomo de nitrógeno de la fracción de difenilamina tiene una carga positiva y la molécula de colorante azul es un anión con una carga total de -1. Los valores de p K a para las pérdidas de los dos protones son 1,15 y 1,82, respectivamente. El protón final se pierde en condiciones alcalinas y el colorante se vuelve rosa (p K a 12,4). [8]
El colorante interactúa electrostáticamente pero de forma no covalente con los grupos amino y carboxilo de las proteínas. Las moléculas del colorante se unen a las proteínas, incluidas las de la lana ( queratina ), para formar un complejo proteína-colorante. La formación del complejo estabiliza la forma aniónica cargada negativamente del colorante, produciendo el color azul, incluso en condiciones ácidas cuando la mayoría de las moléculas en solución están en forma catiónica. [8] Esta es la base del ensayo de Bradford , que cuantifica la proteína mediante la unión del colorante azul brillante de Coomassie. La unión del colorante a una proteína provoca un cambio en la absorbancia máxima del colorante de 465 a 595 nm. El aumento de la absorción a 595 nm se controla para determinar la concentración de proteína. [9]
El colorante también forma un complejo con el detergente aniónico dodecilsulfato de sodio (SDS). [10] La formación de este complejo estabiliza la forma verde neutra del colorante. Este efecto puede interferir con la estimación de la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford. También es probable que el detergente aniónico compita con el colorante por la unión a la proteína.
Fazekas de St. Groth y sus colegas utilizaron por primera vez el azul brillante de Coomassie R-250 para visualizar proteínas en 1963. Las muestras de proteínas se separaron electroforéticamente en una hoja de acetato de celulosa . Luego, la hoja se empapó en ácido sulfosalicílico para fijar las bandas de proteínas y se transfirió a una solución del colorante. [11]
Dos años después, en 1965, Meyer y Lambert utilizaron azul brillante de Coomassie R-250 para teñir muestras de proteínas después de la separación electroforética en un gel de poliacrilamida . Empaparon el gel en una solución de tinte que contenía metanol , ácido acético y agua. Como el tinte teñía el gel de poliacrilamida así como la proteína, para visualizar las bandas de proteína necesitaban desteñir el gel, lo que hicieron electroforéticamente. [12] Publicaciones posteriores informaron que los geles de poliacrilamida podían desteñirse con éxito utilizando una solución de ácido acético.
El primer informe del uso de la forma G del colorante para visualizar bandas de proteínas en geles de poliacrilamida se produjo en 1967, donde el colorante se disolvió en una solución de ácido acético que contenía metanol. [13] Posteriormente se descubrió que las bandas de proteínas se podían teñir sin teñir la poliacrilamida utilizando un coloide de la forma G del colorante en una solución de ácido tricloroacético que no contenía metanol. Con este procedimiento ya no era necesario desteñir el gel. [14] Las formulaciones modernas suelen utilizar un coloide de la forma G del colorante en una solución que contiene ácido fosfórico, etanol (o metanol) y sulfato de amonio (o sulfato de aluminio ). [15] [16] [17] [18]
El ensayo de Bradford utiliza las propiedades espectrales del azul brillante de Coomassie G-250 para estimar la cantidad de proteína en una solución. [19] Se añade una muestra de proteína a una solución del colorante en ácido fosfórico y etanol. En condiciones ácidas, el colorante normalmente es de color marrón, pero al unirse a la proteína se produce la forma azul del colorante. La absorbancia óptica de la solución se mide a una longitud de onda de 595 nm. El colorante se destaca por su alto nivel de sensibilidad: se pueden detectar 5 μg de proteína [ aclaración necesaria ] . Sin embargo, entre las desventajas del método está su variabilidad en el desarrollo del color con diferentes proteínas: el cambio de absorbancia por unidad de masa de proteínas varía con el tipo de proteína. [20]
Al unirse a una proteína, la molécula de colorante azul brillante de Coomassie G-250 con carga negativa le otorgará una carga negativa general a la proteína. Esta propiedad se puede utilizar para separar proteínas o complejos proteicos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes en una técnica llamada PAGE nativo azul . [21] [22] La movilidad del complejo en el gel de poliacrilamida dependerá tanto del tamaño del complejo proteico (es decir, el peso molecular) como de la cantidad de colorante unido a la proteína.
La tinción con azul de Coomassie también se puede utilizar como método de tinción de control de carga en el análisis Western blot. [23] Se aplica como una tinción aniónica de preanticuerpos.
En 2009, el azul brillante G se utilizó en experimentos científicos para tratar lesiones de la columna vertebral en ratas de laboratorio. [24] Actúa reduciendo la respuesta de hinchazón natural del cuerpo, que puede provocar que las neuronas de la zona mueran por estrés metabólico. Las pruebas en ratas demostraron ser eficaces. En comparación con las ratas que no habían recibido el tinte, las ratas que fueron tratadas con el tinte obtuvieron mejores resultados en las pruebas de movimiento. [25] Se desconoce si este tratamiento puede utilizarse de forma eficaz en humanos. Los experimentos con animales administraron el tinte en los 15 minutos siguientes a la lesión, pero para que sea eficaz en un entorno de la vida real, donde un paciente puede tardar un tiempo en llegar a la sala de emergencias, el tratamiento debe ser eficaz incluso cuando se administra hasta dos horas después de la lesión. El único efecto secundario informado fue que las ratas se volvieron azules temporalmente. [24] [26] [27]
El azul brillante G se utiliza como colorante para ayudar a los cirujanos en las cirugías de retina, bajo los nombres comerciales ILM Blue y Brilliant Peel. [28] En diciembre de 2019, el azul brillante G (bajo el nombre comercial TissueBlue, DORC International, Países Bajos) fue aprobado para su uso en humanos en los Estados Unidos. [29] [30] [31]
Tissueblue fue aprobado para uso médico en Canadá en enero de 2021. [32] [33]
La capacidad del colorante Coomassie para identificar aminoácidos con grupos aromáticos ( fenilalanina , tirosina , triptófano ) y cadenas laterales básicas ( lisina , arginina e histidina ) permite utilizar el ensayo de Bradford para el análisis de huellas dactilares. El ensayo se utilizó con éxito para identificar el sexo biológico de la huella dactilar. Se demostró que las muestras femeninas tenían una mayor absorbancia que las muestras masculinas cuando se analizaron en longitudes de onda similares. Esto proporciona un método más simple para el análisis de huellas dactilares al reducir el número de aminoácidos que necesitan analizarse de 23 a 6 y requiere poca o ninguna preparación del ensayo, en contraste con el ensayo químico de ninhidrina , que requiere preparación del ensayo como calentamiento y cascada de enzimas. [34]
