El ensayo de proteínas de Bradford (también conocido como ensayo de proteínas de Coomassie) fue desarrollado por Marion M. Bradford en 1976. [1] Es un procedimiento analítico espectroscópico rápido y preciso [2] que se utiliza para medir la concentración de proteínas en una solución. La reacción depende de la composición de aminoácidos de las proteínas medidas.
El ensayo de Bradford, un ensayo colorimétrico de proteínas , se basa en un cambio de absorbancia del colorante azul brillante Coomassie G-250 . El tinte azul brillante Coomassie G-250 existe en tres formas: aniónico (azul), neutro (verde) y catiónico (rojo). [3] En condiciones ácidas, la forma roja del tinte se convierte en su forma azul, uniéndose a la proteína que se está analizando. Si no hay proteínas que unir, la solución permanecerá de color marrón. El tinte forma un complejo fuerte y no covalente con el grupo carboxilo de la proteína mediante la fuerza de van der Waals y el grupo amino a través de interacciones electrostáticas. [1] Durante la formación de este complejo, la forma roja del tinte Coomassie primero dona su electrón libre a los grupos ionizables de la proteína, lo que provoca una alteración del estado nativo de la proteína y, en consecuencia, expone sus bolsas hidrofóbicas . Estas bolsas en la estructura terciaria de la proteína se unen de forma no covalente a la región no polar del tinte a través de la primera interacción de enlace ( fuerzas de van der Waals ) que posicionan los grupos amino positivos cerca de la carga negativa del tinte. El vínculo se fortalece aún más mediante la segunda interacción de enlace entre los dos, la interacción iónica. Cuando el tinte se une a la proteína, provoca un cambio de 465 nm a 595 nm, razón por la cual las lecturas de absorbancia se toman a 595 nm. [4]
La forma catiónica (no unida) es verde/roja y tiene un espectro de absorción máximo que históricamente se considera de 465 nm . La forma aniónica unida del tinte que se mantiene unida mediante interacciones hidrófobas e iónicas tiene un espectro de absorción máximo que históricamente se considera de 595 nm . [5] El aumento de la absorbancia a 595 nm es proporcional a la cantidad de tinte unido y, por tanto, a la cantidad (concentración) de proteína presente en la muestra. [6]
A diferencia de otros ensayos de proteínas, el ensayo de proteínas de Bradford es menos susceptible a la interferencia de diversos compuestos químicos como el sodio, el potasio o incluso los carbohidratos como la sacarosa, que pueden estar presentes en las muestras de proteínas. [2] Una excepción notable son las concentraciones elevadas de detergente . El dodecilsulfato de sodio (SDS), un detergente común, se puede encontrar en extractos de proteínas porque se usa para lisar células al alterar la bicapa lipídica de la membrana y para desnaturalizar proteínas para SDS-PAGE . Mientras que otros detergentes interfieren con el ensayo a altas concentraciones, la interferencia causada por el SDS es de dos modos diferentes y cada uno ocurre a una concentración diferente. Cuando las concentraciones de SDS están por debajo de la concentración micelar crítica (conocida como CMC, 0,00333 % p/v a 0,0667 %) en una solución de tinte Coomassie, el detergente tiende a unirse fuertemente a la proteína, inhibiendo los sitios de unión a proteínas para el reactivo colorante. Esto puede provocar subestimaciones de la concentración de proteínas en solución. Cuando las concentraciones de SDS están por encima de la CMC, el detergente se asocia fuertemente con la forma verde del tinte Coomassie, lo que hace que el equilibrio cambie, produciendo así más forma azul. Esto provoca un aumento en la absorbancia a 595 nm independientemente de la presencia de proteínas. [6]
Otras interferencias pueden provenir del tampón utilizado al preparar la muestra de proteína. Una concentración alta de tampón provocará una concentración de proteína sobreestimada debido al agotamiento de los protones libres de la solución por la base conjugada del tampón. Esto no será un problema si se utiliza una concentración baja de proteína (posteriormente el tampón). [6]
Para medir la absorbancia de un compuesto incoloro se debe realizar un ensayo de Bradford. Algunos compuestos incoloros, como las proteínas, se pueden cuantificar a una densidad óptica de 280 nm debido a la presencia de anillos aromáticos como triptófano, tirosina y fenilalanina, pero si ninguno de estos aminoácidos está presente, la absorción no se puede medir a 280 nm. [7]
Muchas soluciones que contienen proteínas tienen la mayor absorción a 280 nm en el espectrofotómetro, el rango UV. Esto requiere espectrofotómetros capaces de medir en el rango UV, algo que muchos no pueden hacer. Además, los máximos de absorción a 280 nm requieren que las proteínas contengan aminoácidos aromáticos como tirosina (Y), fenilalanina (F) y/o triptófano (W). No todas las proteínas contienen estos aminoácidos, un hecho que distorsionará las mediciones de concentración. Si hay ácidos nucleicos presentes en la muestra, también absorberían luz a 280 nm, lo que distorsionaría aún más los resultados. Al utilizar el ensayo de proteínas de Bradford, se pueden evitar todas estas complicaciones simplemente mezclando las muestras de proteínas con el tinte azul brillante Coomassie G-250 (reactivo de Bradford) y midiendo sus absorbancias a 595 nm, que está en el rango visible [8]. y puede medirse con precisión mediante el uso de la cámara de un teléfono inteligente móvil. [9]
El procedimiento para el ensayo de proteínas de Bradford es muy fácil y sencillo de seguir. Se realiza en un solo paso en el que se agrega el reactivo de Bradford a un tubo de ensayo junto con la muestra. Después de mezclar bien, la mezcla cambia casi inmediatamente a un color azul. Cuando el tinte se une a las proteínas mediante un proceso que dura aproximadamente 2 minutos, se produce un cambio en el máximo de absorción del tinte de 465 nm a 595 nm en soluciones ácidas. [2] Además, la unión de proteínas desencadena una reacción metacromática, evidenciada por la aparición de una especie que absorbe luz alrededor de 595 nm, indicativa de la forma no protonada [10] Este tinte crea fuertes enlaces no covalentes con las proteínas, a través de interacciones electrostáticas con el amino y grupos carboxilo, así como interacciones de Van Der Waals. Sólo las moléculas que se unen a las proteínas en solución exhiben este cambio en la absorción, lo que elimina la preocupación de que las moléculas no unidas del tinte puedan contribuir a la lectura de absorción obtenida experimentalmente. Este proceso es más beneficioso ya que es menos costoso que otros métodos, fácil de usar y tiene una alta sensibilidad del tinte a las proteínas. [11]
Después de 5 minutos de incubación, la absorbancia se puede leer a 595 nm utilizando un espectrofotómetro o la cámara de un teléfono inteligente móvil (método RGBradford). [9]
Este ensayo es uno de los ensayos más rápidos realizados con proteínas. [12] El tiempo total que lleva configurar y completar el ensayo es inferior a 30 minutos. [13] Todo el experimento se realiza a temperatura ambiente.
El ensayo de proteínas de Bradford puede medir cantidades de proteínas tan pequeñas como de 1 a 20 μg. [14] Es una técnica extremadamente sensible.
El reactivo colorante es un producto estable listo para usar preparado en ácido fosfórico . Puede permanecer a temperatura ambiente hasta 2 semanas antes de que comience a degradarse.
Las muestras de proteínas suelen contener sales, disolventes, tampones, conservantes, agentes reductores y agentes quelantes de metales. Estas moléculas se utilizan frecuentemente para solubilizar y estabilizar proteínas. Otros ensayos de proteínas como BCA y Lowry son ineficaces porque moléculas como los agentes reductores interfieren con el ensayo. [15] El uso de Bradford puede ser ventajoso contra estas moléculas porque son compatibles entre sí y no interferirán. [dieciséis]
El gráfico lineal adquirido del ensayo (absorbancia frente a concentración de proteínas en μg/ml) se puede extrapolar fácilmente para determinar la concentración de proteínas utilizando la pendiente de la línea.
Es una técnica sensible. También es muy sencillo: medir la DO a 595 nm después de 5 minutos de incubación. Este método también puede utilizar un espectrofotómetro Vis [17] o la cámara de un teléfono inteligente móvil (método RGBradford). [9]
El ensayo de Bradford es lineal en un rango corto, normalmente de 0 μg/ml a 2000 μg/ml, por lo que a menudo es necesario diluir una muestra antes del análisis. Al realizar estas diluciones, el error en una dilución se agrava en diluciones posteriores, lo que da como resultado una relación lineal que puede no siempre ser precisa.
Las condiciones básicas y los detergentes, como el SDS, pueden interferir con la capacidad del tinte para unirse a la proteína a través de sus cadenas laterales. [12]
Los reactivos de este método tienden a manchar los tubos de ensayo. No se pueden utilizar los mismos tubos de ensayo ya que la tinción afectaría la lectura de absorbancia. Este método también es urgente. Cuando se analiza más de una solución, es importante asegurarse de que cada muestra se incube durante el mismo período de tiempo para una comparación precisa. [18]
Un factor limitante en el uso de tintes para la determinación de proteínas basados en Coomassie proviene de la variación significativa en el rendimiento del color observado entre diferentes proteínas [19]. Este factor limitante es notablemente evidente en muestras de proteínas ricas en colágeno, como extractos pancreáticos, donde tanto el método de Lowry como el de Bradford tienden a subestimar el contenido de proteínas.
También se inhibe por la presencia de detergentes, aunque este problema puede aliviarse mediante la adición de ciclodextrinas a la mezcla de ensayo. [20]
Gran parte de la no linealidad surge del equilibrio entre dos formas diferentes del tinte, que se altera al agregar la proteína. El ensayo de Bradford se linealiza midiendo la relación de absorbancias, 595 sobre 450 nm. Este ensayo de Bradford modificado es aproximadamente 10 veces más sensible que el convencional. [21]
El tinte Coomassie Blue G250 utilizado para unirse a las proteínas en el método Bradford original se une fácilmente a los grupos de proteínas arginina y lisina. Esto es una desventaja porque la preferencia del tinte por unirse a estos aminoácidos puede dar como resultado una respuesta variada del ensayo entre diferentes proteínas. Se han realizado cambios en el método original, como aumentar el pH agregando NaOH o agregando más tinte, para corregir esta variación. Aunque estas modificaciones dan como resultado un ensayo menos sensible, un método modificado se vuelve sensible a los detergentes que pueden interferir con la muestra. [22]
Se han realizado nuevas modificaciones para un ensayo de proteínas de Bradford mejorado que se centra específicamente en mejorar la precisión de la detección de proteínas de colágeno. Una modificación notable implica incorporar pequeñas cantidades, aproximadamente 0,0035%, de dodecilsulfato de sodio (SDS). Se ha demostrado que esta inclusión de SDS da como resultado un aumento de cuatro veces en la respuesta de color de tres proteínas de colágeno clave (colágeno tipos I, III y IV) y, al mismo tiempo, disminuye la absorbancia de las proteínas sin colágeno. [19]
Esta simple modificación en la preparación del reactivo dio como resultado que los ensayos de Bradford produjeran curvas de respuesta similares para proteínas con y sin colágeno, ampliando el uso de los ensayos de Bradford en muestras que contienen proteínas con alto contenido de colágeno.
En resumen, para encontrar una curva estándar, se deben utilizar concentraciones variables de BSA ( albúmina sérica bovina ) [2] para crear una curva estándar con la concentración representada en el eje x y la absorbancia representada en el eje y. Sólo se utiliza una concentración estrecha de BSA (2-10 ug/ml) para crear una curva estándar precisa. [23] El uso de un amplio rango de concentración de proteínas hará que sea más difícil determinar la concentración de la proteína desconocida. Luego, esta curva estándar se utiliza para determinar la concentración de la proteína desconocida. A continuación se detalla cómo se pasa de la curva estándar a la concentración de lo desconocido.
Primero, agregue una línea de mejor ajuste o regresión lineal y muestre la ecuación en el gráfico. Idealmente, el valor de R 2 será lo más cercano posible a 1. R representa la suma de los valores cuadrados del ajuste restados de cada punto de datos. Por lo tanto, si R 2 es mucho menor que uno, considere rehacer el experimento para obtener uno con datos más confiables. [24]
La ecuación que se muestra en el gráfico proporciona un medio para calcular la absorbancia y, por tanto, la concentración de las muestras desconocidas. En el Gráfico 1, x es la concentración y y es la absorbancia, por lo que se debe reorganizar la ecuación para resolver x e ingresar la absorbancia de la incógnita medida. [25] Es probable que lo desconocido tenga números de absorbancia fuera del rango del estándar. Estos no deben incluirse en los cálculos, ya que la ecuación dada no puede aplicarse a números fuera de sus limitaciones. A gran escala, se debe calcular el coeficiente de extinción utilizando la ley de Beer-Lambert A=εLC en la que A es la absorbancia medida, ε es la pendiente de la curva estándar, L es la longitud de la cubeta y C es la concentración. siendo determinado. [26] En una microescala, no se puede usar una cubeta y, por lo tanto, solo hay que reorganizarla para resolver x.
Para lograr una concentración que tenga sentido con los datos, se deben normalizar las diluciones, concentraciones y unidades de la incógnita (Tabla 1). Para hacer esto, se debe dividir la concentración por el volumen de proteína para normalizar la concentración y multiplicar por la cantidad diluida para corregir cualquier dilución realizada en la proteína antes de realizar el ensayo.
Los ensayos de proteínas alternativos incluyen:
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