stringtranslate.com

Normalización de transferencia Western

La normalización de los datos de la transferencia Western es un paso analítico que se realiza para comparar la abundancia relativa de una proteína específica en los carriles de una transferencia o gel bajo diversos tratamientos experimentales, o entre tejidos o etapas de desarrollo. [1] [2] El objetivo general de la normalización es minimizar los efectos que surgen de las variaciones en los errores experimentales, como la preparación inconsistente de las muestras, la carga desigual de las muestras en los carriles del gel o la transferencia desigual de proteínas, que pueden comprometer las conclusiones que se pueden obtener de Datos de transferencia Western . [1] Actualmente, existen dos métodos para normalizar los datos de transferencia Western : (i) normalización de proteínas internas y (ii) normalización de proteínas totales. [1] [2] [3] [4]

Procedimiento

La normalización se produce directamente en el gel o en la membrana secante. Primero, se obtienen imágenes del gel o transferencia teñida, se dibuja un rectángulo alrededor de la proteína objetivo en cada carril y se mide la intensidad de la señal dentro del rectángulo. [1] La intensidad de la señal obtenida puede luego normalizarse con respecto a la intensidad de la señal del control interno de carga detectada en el mismo gel o transferencia. [1] Cuando se utilizan tintes de proteínas, la membrana se puede incubar con el tinte elegido antes o después de la inmunodetección, según el tipo de tinte. [5]

Controles de proteínas de limpieza

Los genes y proteínas de mantenimiento, incluidos la β-actina , GAPDH , HPRT1 y RPLP1 , se utilizan a menudo como controles internos en las transferencias Western porque se cree que se expresan constitutivamente, en los mismos niveles, en todos los experimentos. [1] [2] [6] [7] Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la expresión de las proteínas constitutivas (HKP) puede cambiar según los diferentes tipos de células y condiciones biológicas. [1] [8] [9] [10] Por lo tanto, los editores científicos y las agencias de financiación ahora exigen que los controles de normalización se validen previamente para cada experimento para garantizar la reproducibilidad y precisión de los resultados. [8] [9] [10]

Anticuerpos fluorescentes

Cuando se utilizan anticuerpos fluorescentes para obtener imágenes de proteínas en transferencias Western, la normalización requiere que el usuario defina los límites superior e inferior de cuantificación y caracterice la relación lineal entre la intensidad de la señal y el volumen de masa de la muestra para cada antígeno. [1] Tanto la proteína objetivo como el control de normalización deben tener fluorescencia dentro del rango dinámico de detección. [1] Muchas HKP se expresan en niveles altos y se prefieren para su uso con proteínas diana altamente expresadas. [1] Las proteínas de menor expresión son difíciles de detectar en la misma transferencia. [1]

Los anticuerpos fluorescentes están disponibles comercialmente y se recomiendan anticuerpos completamente caracterizados para garantizar la coherencia de los resultados. [11] [12] [13]

Cuando no se utiliza la detección fluorescente, la proteína de control de carga y la proteína de interés deben diferir considerablemente en peso molecular para que estén adecuadamente separadas mediante electroforesis en gel para un análisis preciso. [1]

Decapado de membrana

Es necesario quitar las membranas y volver a sondearlas utilizando un nuevo conjunto de anticuerpos de detección cuando se detectan múltiples objetivos proteicos en la misma transferencia. [6] La extracción ineficaz podría resultar en una señal débil de la proteína objetivo. [6] Para evitar la pérdida del antígeno, solo se recomiendan tres incubaciones de extracción por membrana. [6] Podría ser difícil eliminar completamente la señal de proteínas muy abundantes, por lo que se recomienda detectar primero las proteínas de baja expresión. [6]

Controles de aumento exógenos

Dado que los niveles de HKP pueden ser inconsistentes entre los tejidos, los científicos pueden controlar la proteína de interés agregando una proteína exógena pura de una concentración conocida dentro del rango lineal del anticuerpo. [8] [9] [10] En comparación con HKP, hay una variedad más amplia de proteínas disponibles para controles de adición. [14]

Normalización de proteínas totales.

En la normalización de proteínas totales (NPT), la abundancia de la proteína objetivo se normaliza con respecto a la cantidad total de proteínas en cada carril. [3] [4] Debido a que la TPN no depende de un único control de carga, no es necesaria la validación de los controles ni la extracción/resondeo de transferencias para la detección de HKP. [6] [15] Esto puede mejorar la precisión (hasta 0,1 μg de proteína total por carril), la rentabilidad y la confiabilidad de los datos. [dieciséis]

Los tintes fluorescentes y los geles sin tintes requieren un equipo especial para visualizar las proteínas en el gel/transferencia. [5] Es posible que los tintes no cubran la mancha de manera uniforme; Es posible que se acumule más mancha hacia los bordes de la mancha que en el centro. La falta de uniformidad en la imagen puede dar como resultado una normalización inexacta. [1]

Tinciones previas a los anticuerpos

Los tintes aniónicos como Ponceau S y Coomassie bright blue , y los tintes fluorescentes como Sypro Ruby y Deep Purple, se utilizan antes de agregar los anticuerpos porque no afectan la inmunodetección posterior. [17] [18] [19] [20]

Ponceau S es un tinte reversible cargado negativamente que tiñe las proteínas de un color rosa rojizo y se elimina fácilmente lavándolo con agua. [21] [22] La intensidad de la tinción de Ponceau S disminuye rápidamente con el tiempo, por lo que la documentación debe realizarse rápidamente. [5] Se informa un rango lineal de hasta 140 μg para Ponceau S con poca reproducibilidad debido a su intensidad de tinción altamente dependiente del tiempo y su baja relación señal-ruido. [21] [22]

Los tintes fluorescentes como Sypro Ruby tienen un amplio rango lineal y son más sensibles que los tintes aniónicos. [22] Son tinciones permanentes y fotoestables que se pueden visualizar con un transiluminador UV o de luz azul estándar o un escaneo láser. [1] [22] Luego, las membranas se pueden documentar en película o digitalmente utilizando una cámara con dispositivo de carga acoplada . [23] La tinción con Sypro Ruby blot requiere mucho tiempo y tiende a saturar más de 50 μg de proteína por carril. [22]

Tinciones posteriores a anticuerpos

El negro amido es una tinción aniónica permanente post-anticuerpo de uso común que es más sensible que Ponceau S. [24] Esta tinción se aplica después de la inmunodetección. [24]

Tecnología sin manchas

La tecnología sin manchas emplea una química en gel para obtener imágenes. [22] [25] [26] Esta reacción química no afecta la transferencia de proteínas ni la unión de anticuerpos en sentido descendente. [27] Además, no implica pasos de tinción/descoloración, y la intensidad de las bandas permanece constante a lo largo del tiempo. [28]

La tecnología sin manchas no puede detectar proteínas que no contengan residuos de triptófano . Se necesita un mínimo de dos triptófanos para permitir la detección. [5] El rango lineal para la normalización sin manchas es de hasta 80 μg de proteína por carril para geles Criterion de tamaño mediano de 18 pocillos y de hasta 100 μg por carril para geles Criterion de tamaño mediano de 12 pocillos. Este rango es compatible con cargas de proteínas típicas en transferencias Western cuantitativas y permite realizar cálculos de control de carga en un amplio rango de carga de proteínas. [29] [4] Recientemente también está disponible un método sin manchas más eficiente. [30] [31] Cuando se utilizan cargas altas de proteínas, la tecnología sin manchas ha demostrado mayor éxito que las tinciones. [29]

Referencias

  1. ^ abcdefghijklmn Taylor, Carolina del Sur; Berkelman, T; Yadav, G; Hammond, M (23 de agosto de 2016). "Una metodología definida para la cuantificación fiable de datos de transferencia Western". Mol. Biotecnología . 55 (3): 217–26. doi :10.1007/s12033-013-9672-6. PMC  3840294 . PMID  23709336.
  2. ^ abc Thellin, O.; Zorzi, W.; Lakaye, B.; De Borman, B.; Coumanes, B.; Hennen, G.; Grisar, T.; Igout, A.; Heinen, E. (8 de octubre de 1999). "Los genes domésticos como estándares internos: uso y límites". Revista de Biotecnología . 75 (2–3): 291–295. doi :10.1016/s0168-1656(99)00163-7. hdl : 2268/3661 . ISSN  0168-1656. PMID  10617337.
  3. ^ ab Aldridge, Georgina M.; Podrebarac, David M.; Greenough, William T.; Weiler, Ivan Jeanne (30 de julio de 2008). "El uso de tinciones de proteínas totales como controles de carga: una alternativa a los controles de una sola proteína de alta abundancia en inmunotransferencia semicuantitativa". Revista de métodos de neurociencia . 172 (2): 250–254. doi :10.1016/j.jneumeth.2008.05.003. PMC 2567873 . PMID  18571732. 
  4. ^ abc Collins, Mahlon A.; An, Jiyan; Peller, Danielle; Bowser, Robert (15 de agosto de 2015). "La proteína total es un control de carga eficaz para las transferencias Western de líquido cefalorraquídeo". Revista de métodos de neurociencia . 251 : 72–82. doi :10.1016/j.jneumeth.2015.05.011. PMC 4540354 . PMID  26004848. 
  5. ^ abcd "Normalización de proteínas totales para Western Blots - Advansta Inc". 2014-11-05 . Consultado el 1 de octubre de 2016 .
  6. ^ abcdef Bajo, JJ; Wilkinson, DJ; Rankin, D.; Phillips, BE; Szewczyk, Nueva Jersey; Smith, K.; Atherton, PJ (5 de junio de 2016). "Una descripción general de las consideraciones técnicas para las aplicaciones de transferencia Western a la investigación fisiológica". Revista escandinava de medicina y ciencia en el deporte . 27 (1): 4–25. doi :10.1111/sms.12702. ISSN  1600-0838. PMC 5138151 . PMID  27263489. 
  7. ^ Li, Rena; Shen, Yong (19 de abril de 2013). "Un antiguo método que se enfrenta a un nuevo desafío: revisar las proteínas domésticas como control interno de referencia para la investigación en neurociencia". Ciencias de la vida . 92 (13): 747–751. doi :10.1016/j.lfs.2013.02.014. ISSN  1879-0631. PMC 3614345 . PMID  23454168. 
  8. ^ abc Zhu, Jiang; Él, Fuhong; Canción, Shuhui; Wang, Jing; Yu, junio (1 de enero de 2008). "¿Cuántos genes humanos se pueden definir como domésticos con los datos de expresión actuales?". Genómica BMC . 9 : 172. doi : 10.1186/1471-2164-9-172 . ISSN  1471-2164. PMC 2396180 . PMID  18416810. 
  9. ^ a b C Barbero, Robert D.; Harmer, Dan W.; Coleman, Robert A.; Clark, Brian J. (11 de mayo de 2005). "GAPDH como gen constitutivo: análisis de la expresión del ARNm de GAPDH en un panel de 72 tejidos humanos". Genómica fisiológica . 21 (3): 389–395. CiteSeerX 10.1.1.459.7039 . doi :10.1152/fisiolgenomics.00025.2005. ISSN  1094-8341. PMID  15769908. 
  10. ^ abc Lee, Peter D.; Sladek, Robert; Greenwood, Celia MT ; Hudson, Thomas J. (1 de febrero de 2002). "Genes de control y variabilidad: ausencia de transcripciones de referencia ubicuas en estudios de expresión de diversos mamíferos". Investigación del genoma . 12 (2): 292–297. doi :10.1101/gr.217802. ISSN  1088-9051. PMC 155273 . PMID  11827948. 
  11. ^ Couchman, John R. (1 de octubre de 2016). "Anticuerpos comerciales: lo bueno, lo malo y lo realmente feo". Revista de Histoquímica y Citoquímica . 57 (1): 7–8. doi :10.1369/jhc.2008.952820. ISSN  0022-1554. PMC 2605718 . PMID  18854593. 
  12. ^ Gilda, Jennifer E.; Ghosh, Rajeshwary; Cheah, Jenice X.; Oeste, Toni M.; Bodine, Sue C.; Gomes, Aldrin V. (19 de agosto de 2015). "Imexactitudes de la transferencia Western con anticuerpos no verificados: necesidad de un estándar mínimo de informes de transferencia Western (WBMRS)". MÁS UNO . 10 (8): e0135392. Código Bib : 2015PLoSO..1035392G. doi : 10.1371/journal.pone.0135392 . ISSN  1932-6203. PMC 4545415 . PMID  26287535. 
  13. ^ "Validación de anticuerpos: una necesidad urgente | The Scientist Magazine®". El científico . Consultado el 1 de octubre de 2016 .
  14. ^ "Seis cambios que marcarán una gran diferencia con su secuencia de ARN; Parte 3: Genómica de cofactores". cofactorgenomics.com . 19 de marzo de 2014 . Consultado el 1 de octubre de 2016 .
  15. ^ Fosang, Amanda J.; Colbran, Roger J. (11 de diciembre de 2015). "La transparencia es la clave de la calidad". La Revista de Química Biológica . 290 (50): 29692–29694. doi : 10.1074/jbc.E115.000002 . ISSN  0021-9258. PMC 4705984 . PMID  26657753. 
  16. ^ Moritz, CP. (20 de septiembre de 2017). "Tubulina o no tubulina: hacia la tinción de proteínas totales como control de carga en Western blots" (PDF) . Proteómica . 17 (20): 1600189. doi : 10.1002/pmic.201600189. PMID  28941183. S2CID  22305461.
  17. ^ Welinder, Charlotte; Ekblad, Lars (4 de marzo de 2011). "Tinción de Coomassie como control de carga en análisis de transferencia Western". Revista de investigación del proteoma . 10 (3): 1416-1419. doi :10.1021/pr1011476. ISSN  1535-3893. PMID  21186791.
  18. ^ Ranganathan, Velvizhi; De, Prabir K. (1 de febrero de 1996). "Western Blot de proteínas de geles de poliacrilamida teñidos con Coomassie". Bioquímica Analítica . 234 (1): 102–104. doi :10.1006/abio.1996.0057. PMID  8742090.
  19. ^ Steinberger, B (1 de mayo de 2015). "Evaluación de la tinción de proteína total SYPRO Ruby para la normalización de transferencias Western bidimensionales". Bioquímica Analítica . 476 (1): 17-19. doi :10.1016/j.ab.2015.01.015. PMID  25640586.
  20. ^ "Normalización de proteínas totales para Western Blots" . Consultado el 1 de octubre de 2016 .
  21. ^ ab Rivero-Gutiérrez, B.; Anzola, A.; Martínez-Augustin, O.; de Medina, F. Sánchez (2014-12-15). "Detección sin manchas como alternativa de control de carga a Ponceau e inmunodetección interna de proteínas en transferencia Western". Bioquímica Analítica . 467 : 1–3. doi : 10.1016/j.ab.2014.08.027 . hdl : 10481/63191 . ISSN  1096-0309. PMID  25193447.
  22. ^ abcdef Gürtler, Anne; Kunz, Nancy; Gomolka, María; Hornhardt, Sabine; Friedl, Anna A.; McDonald, Kevin; Kohn, Jonathan E.; Posch, Antón (15 de febrero de 2013). "La tecnología Stain-Free como herramienta de normalización en el análisis de Western blot". Bioquímica Analítica . 433 (2): 105-111. doi :10.1016/j.ab.2012.10.010. PMID  23085117.
  23. ^ "Imágenes de fluorescencia: principios y métodos" (PDF) . Consultado el 10 de enero de 2018 .
  24. ^ ab Goldman, A; Harper, S; Speicher, DW (1 de noviembre de 2016). Detección de proteínas en membranas Blot . vol. 86, págs. 10.8.1–10.8.11. doi :10.1002/cpps.15. ISBN 9780471140863. PMC  5646381 . PMID  27801518. {{cite book}}: |journal=ignorado ( ayuda )
  25. ^ Zeitler, Anna F.; Gerrer, Katrin H.; Haas, Rainer; Jiménez-Soto, Luisa F. (1 de julio de 2016). "Análisis de transferencia semicuantitativo optimizado en ensayos de infección utilizando la tecnología Stain-Free". Revista de métodos microbiológicos . 126 : 38–41. doi :10.1016/j.mimet.2016.04.016. PMID  27150675.
  26. ^ "Tecnología sin manchas | Aplicaciones y tecnologías | Bio-Rad". www.bio-rad.com . Consultado el 1 de octubre de 2016 .
  27. ^ Colella, Alex D.; Chegenii, Nusha; Té, Melinda N.; Gibbins, Ian L.; Williams, Keryn A .; Chataway, Tim K. (15 de noviembre de 2012). "Comparación de geles Stain-Free con la metodología tradicional de control de carga de inmunotransferencia". Bioquímica Analítica . 430 (2): 108–110. doi :10.1016/j.ab.2012.08.015. PMID  22929699.
  28. ^ Gilda, Jennifer E.; Gomes, Aldrin V. (15 de septiembre de 2013). "La tinción de proteínas totales sin manchas es un control de carga superior a la β-actina para transferencias Western". Bioquímica Analítica . 440 (2): 186–188. doi :10.1016/j.ab.2013.05.027. PMC 3809032 . PMID  23747530. 
  29. ^ ab Simonyi, K. y Yadav, G. (7 de agosto de 2016). "Tendencias en la transferencia Western cuantitativa: el surgimiento de la normalización de proteínas totales". Tecnología de biociencias . Medios de ventaja.
  30. ^ "Enfoque sin manchas para Western Blot | Artículos de la revista GEN | GEN". GEN . 15 de noviembre de 2011 . Consultado el 1 de octubre de 2016 .
  31. ^ Gilda, Jennifer E.; Gomes, Aldrin V. (01/01/2015). "Western Blot utilizando el etiquetado de proteínas en gel como control de normalización: tecnología sin manchas". En Posch, Anton (ed.). Perfil proteómico . Métodos en biología molecular. vol. 1295. Springer Nueva York. págs. 381–391. doi :10.1007/978-1-4939-2550-6_27. ISBN 9781493925490. PMID  25820735.

enlaces externos