La transferencia Western (a veces llamada inmunotransferencia de proteínas ), o transferencia Western , es una técnica analítica ampliamente utilizada en biología molecular e inmunogenética para detectar proteínas específicas en una muestra de homogeneizado o extracto de tejido. [1] Además de detectar las proteínas, esta técnica también se utiliza para visualizar, distinguir y cuantificar las diferentes proteínas en una combinación de proteínas complicada. [2]
La técnica de Western blot utiliza tres elementos para lograr su tarea de separar una proteína específica de un complejo: separación por tamaño, transferencia de proteína a un soporte sólido y marcado de la proteína objetivo utilizando un anticuerpo primario y secundario para visualizar. [1] Se crea un anticuerpo sintético o de origen animal (conocido como anticuerpo primario ) que reconoce y se une a una proteína objetivo específica. La membrana de electroforesis se lava en una solución que contiene el anticuerpo primario, antes de eliminar el exceso de anticuerpo. [3] Se agrega un anticuerpo secundario que reconoce y se une al anticuerpo primario. El anticuerpo secundario se visualiza mediante varios métodos, como tinción , inmunofluorescencia y radioactividad, lo que permite la detección indirecta de la proteína diana específica. [3]
Otras técnicas relacionadas incluyen el análisis de transferencia puntual , transferencia puntual cuantitativa , inmunohistoquímica e inmunocitoquímica , donde se utilizan anticuerpos para detectar proteínas en tejidos y células mediante inmunotinción , y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
El nombre Western Blot es un juego de palabras con Southern Blot , una técnica para la detección de ADN que lleva el nombre de su inventor, el biólogo inglés Edwin Southern . De manera similar, la detección de ARN se denomina transferencia Northern . [4] El término "western blot" fue acuñado por W. Neal Burnette en 1981, [5] aunque el método en sí fue inventado de forma independiente en 1979 por Jaime Renart, Jakob Reiser y George Stark en la Universidad de Stanford , [6] y por Harry Towbin, Theophil Staehelin y Julian Gordon en el Instituto Friedrich Miescher de Basilea , Suiza . [7] El grupo Towbin también utilizó anticuerpos secundarios para la detección, asemejándose así al método real que se utiliza casi universalmente en la actualidad. Entre 1979 y 2019 "se ha mencionado en los títulos, resúmenes y palabras clave de más de 400.000 publicaciones incluidas en PubMed " y puede que siga siendo la técnica de análisis de proteínas más utilizada. [8]
La transferencia Western se utiliza ampliamente en bioquímica para la detección cualitativa de proteínas individuales y modificaciones de proteínas (como modificaciones postraduccionales ). Se estima que al menos entre el 8% y el 9% de todas las publicaciones relacionadas con proteínas aplican transferencias Western. [8] Se utiliza como método general para identificar la presencia de una única proteína específica dentro de una mezcla compleja de proteínas. Se puede derivar una estimación semicuantitativa de una proteína a partir del tamaño y la intensidad del color de una banda de proteína en la membrana de transferencia. Además, se puede utilizar la aplicación de una serie de diluciones de una proteína purificada de concentraciones conocidas para permitir una estimación más precisa de la concentración de proteína. La transferencia Western se utiliza habitualmente para verificar la producción de proteínas después de la clonación . También se utiliza en el diagnóstico médico, por ejemplo en la prueba del VIH o en la prueba de la EEB . [9]
La prueba de confirmación del VIH emplea una transferencia Western para detectar anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano . Las proteínas de células infectadas por el VIH se separan y se transfieren a una membrana como se indicó anteriormente. Luego, el suero a analizar se aplica en el paso de incubación del anticuerpo primario; El anticuerpo libre se elimina por lavado y se añade un anticuerpo antihumano secundario vinculado a una señal enzimática. Las bandas teñidas indican las proteínas contra las cuales el suero del paciente contiene anticuerpos. [10] Una transferencia Western también se utiliza como prueba definitiva para la variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob , un tipo de enfermedad priónica relacionada con el consumo de carne de vacuno contaminada procedente de ganado con encefalopatía espongiforme bovina (EEB, comúnmente conocida como "enfermedad de las vacas locas"). ). [11] Otra aplicación es en el diagnóstico de tularemia . Una evaluación de la capacidad del Western Blot para detectar anticuerpos contra F. tularensis reveló que su sensibilidad es casi del 100% y la especificidad del 99,6%. [12] Algunas formas de prueba de la enfermedad de Lyme emplean transferencia Western. [13] Una prueba Western Blot también se puede utilizar como prueba de confirmación para la infección por hepatitis B y por HSV-2 (herpes tipo 2). [14] [15] En medicina veterinaria, a veces se utiliza una transferencia Western para confirmar el estado de FIV + en gatos. [dieciséis]
Otras aplicaciones de la técnica Western Blot incluyen su uso por parte de la Agencia Mundial Antidopaje (AMA). El dopaje sanguíneo es el uso indebido de determinadas técnicas y/o sustancias para aumentar la masa de glóbulos rojos, lo que permite al cuerpo transportar más oxígeno a los músculos y, por tanto, aumentar la resistencia y el rendimiento. Hay tres sustancias o métodos ampliamente conocidos que se utilizan para el dopaje sanguíneo: la eritropoyetina (EPO), los transportadores de oxígeno sintéticos y las transfusiones de sangre. Cada uno de ellos está prohibido según la Lista de Sustancias y Métodos Prohibidos de la AMA. La técnica del Western Blot se utilizó durante la Copa Mundial de la FIFA 2014 en la campaña antidopaje de ese evento. [17] En total, Reichel et al. recogieron y analizaron más de 1000 muestras. [18] en el laboratorio acreditado por la AMA de Lausana, Suiza . Investigaciones recientes que utilizan la técnica de transferencia Western mostraron una detección mejorada de EPO en sangre y orina basándose en los novedosos geles horizontales prefabricados Velum SAR optimizados para análisis de rutina. [19] Con la adopción del SAR-PAGE horizontal en combinación con los geles Velum SAR prefabricados soportados por película, la capacidad discriminatoria de la aplicación de microdosis de rEPO mejoró significativamente.
Además de la aplicación del Western Blot en la investigación científica, también se utiliza en áreas de investigación clínica. Dado que se puede aplicar al proceso de identificación directa de proteínas, la transferencia Western se considera una poderosa herramienta de diagnóstico que se utiliza con frecuencia en el entorno clínico. Se pueden utilizar técnicas de detección de proteínas y WB para encontrar biomarcadores de enfermedades, como proteínas o anticuerpos específicos. Se cree que es un método viable para identificar proteínas particulares durante el diagnóstico de enfermedades como el cáncer, las enfermedades autoinmunes y los trastornos priónicos. La detección de varios biomarcadores utilizados en el diagnóstico de enfermedades neurológicas y oncológicas mediante transferencia Western es un procedimiento común. [2] [20] [21] Por ejemplo, se cree ampliamente que la aparición de la resistencia a múltiples fármacos (MDR) ha hecho que la terapia eficaz contra el cáncer sea extremadamente difícil. Por lo tanto, el descubrimiento temprano, preciso y sensible del mecanismo MDR es esencial, al igual que la búsqueda de enfoques quimioterapéuticos más eficaces para su aplicación en entornos clínicos. La expresión de la glicoproteína MDR1/P en las líneas celulares P388/ADR, P388 y HCT-15 se examina utilizando la técnica WB. El Banco Mundial también ha identificado niveles de MRP1. [2] [22] [23]
Por otro lado, como la transferencia Western tiene el potencial de distinguir diferentes isoformas de proteínas, puede usarse para diagnosticar enfermedades relacionadas con priones y isoformas de proteínas, como el cáncer. Por ejemplo, el análisis de transferencia Western del patrón de isoformas de las proteínas 14-3-3 en el líquido cerebral puede identificar la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. [2] [24] Además, la enfermedad pulmonar de los agricultores es una afección pulmonar provocada por la respiración de partículas antigénicas, y los estudios han indicado que la transferencia Western puede ser una opción útil para identificar proteínas inmunorreactivas relacionadas con la enfermedad pulmonar de los agricultores. [2] Además, la transferencia Western también se utiliza para identificar proteínas en el líquido sinovial y el suero, lo que permite el diagnóstico de los síntomas clínicos de la osteoartritis y la artritis reumatoide. [2] [25] Western blot se utiliza para evaluar los niveles de expresión de la proteína FSTL1 en personas con osteoartritis de rodilla, que sirve como un biomarcador potencial de daño articular. [2] [26] Además, se utiliza para identificar proteínas en el líquido sinovial y el suero, lo que permite el diagnóstico de los síntomas clínicos de la osteoartritis y la artritis reumatoide. Se utiliza para evaluar los niveles de expresión de la proteína FSTL1 en personas con osteoartritis de rodilla, que sirve como posible biomarcador de daño articular. [2] [27] [28]
Para el desarrollo de medicamentos, la identificación de objetivos terapéuticos y la investigación biológica, es esencial comprender dónde se encuentran las proteínas dentro de una célula. [2] [29] Las ubicaciones subcelulares de las proteínas dentro de la célula y sus funciones están estrechamente relacionadas. La relación entre la función y la localización de las proteínas sugiere que cuando las proteínas se mueven, sus funciones pueden cambiar o adquirir nuevas características. La ubicación subcelular de una proteína se puede determinar mediante diversos métodos. Se han creado y utilizado numerosas herramientas y estrategias computacionales eficientes y confiables para identificar la localización subcelular de proteínas. [30] Con la ayuda de métodos de fraccionamiento subcelular, WB sigue siendo un método fundamental importante para la investigación y comprensión de la localización de proteínas. [2]
Debido a sus diversos epítopos, los anticuerpos han ganado interés tanto en la investigación básica como en la clínica. La base de la caracterización y validación de anticuerpos es el mapeo de epítopos. El procedimiento para identificar los sitios de unión de un anticuerpo (epítopos) en la proteína diana se denomina "mapeo de epítopos". Encontrar el epítopo de unión de un anticuerpo es esencial para el descubrimiento y la creación de nuevas vacunas, diagnósticos y terapias. [2] Como resultado, se han creado varios métodos para mapear epítopos de anticuerpos. En este punto, la especificidad de la transferencia Western es la característica principal que la distingue de otras técnicas de mapeo de epítopos. Existen varias aplicaciones de Western blot para el mapeo de epítopos en muestras de piel humana, virus de la enfermedad hemorrágica. [2] [31] [32]
El método de transferencia Western se compone de electroforesis en gel para separar proteínas nativas por estructura tridimensional o proteínas desnaturalizadas por la longitud del polipéptido, seguida de una transferencia electroforética a una membrana (principalmente PVDF o nitrocelulosa ) y un procedimiento de inmunotinción para visualizar una determinada proteína en la membrana de la transferencia.
La electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) se utiliza generalmente para la separación electroforética desnaturalizante de proteínas. El dodecilsulfato de sodio (SDS) se utiliza generalmente como tampón (así como en el gel) para dar a todas las proteínas presentes una carga negativa uniforme, ya que las proteínas pueden tener carga positiva, negativa o neutra. Antes de la electroforesis, las muestras de proteínas suelen hervirse para desnaturalizar las proteínas presentes. Esto garantiza que las proteínas se separen según el tamaño y evita que las proteasas (enzimas que descomponen las proteínas) degraden las muestras. Tras la separación electroforética, las proteínas se transfieren a una membrana (normalmente nitrocelulosa o PVDF). Luego, la membrana a menudo se tiñe con Ponceau S para visualizar las proteínas en la transferencia y garantizar que se haya producido una transferencia adecuada. A continuación, las proteínas se bloquean con leche (u otros agentes bloqueadores) para evitar la unión de anticuerpos no específicos y luego se tiñen con anticuerpos específicos de la proteína objetivo. [7] [6] Por último, la membrana se teñirá con un anticuerpo secundario que reconoce la tinción del primer anticuerpo, que luego puede usarse para la detección mediante una variedad de métodos. El paso de electroforesis en gel se incluye en el análisis de transferencia Western para resolver el problema de la reactividad cruzada de los anticuerpos.
Como paso importante en la realización de una transferencia Western, la preparación de la muestra debe realizarse de manera efectiva, ya que la interpretación de este ensayo está influenciada por la preparación de proteínas, que se compone de procesos de extracción y purificación de proteínas. [33] [3] Para lograr una extracción eficiente de proteínas, se debe elegir un método de homogeneización adecuado debido a que es responsable de romper la membrana celular y liberar los componentes intracelulares. [3] [34] Además de eso, se necesita el tampón de lisis ideal para adquirir cantidades sustanciales del contenido de proteína objetivo porque el tampón lidera el proceso de solubilización de proteínas y previene la degradación de las proteínas. Después de completar la preparación de la muestra, el contenido de proteína está listo para ser separado mediante electroforesis en gel. [3]
Las proteínas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel . La separación de proteínas puede realizarse por punto isoeléctrico (pI), peso molecular , carga eléctrica o una combinación de estos factores. La naturaleza de la separación depende del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel.
Con diferencia, el tipo más común de electroforesis en gel emplea geles de poliacrilamida y tampones cargados con dodecilsulfato de sodio (SDS). SDS-PAGE (electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida) mantiene los polipéptidos en un estado desnaturalizado una vez que han sido tratados con agentes reductores fuertes para eliminar la estructura secundaria y terciaria (por ejemplo, enlaces disulfuro [SS] a grupos sulfhidrilo [SH y SH]) y, por lo tanto, permite Separación de proteínas por su masa molecular . Las proteínas muestreadas quedan cubiertas por el SDS cargado negativamente, convirtiéndose efectivamente en aniónicas , y migran hacia el ánodo cargado positivamente (voltaje más alto) (que generalmente tiene un cable rojo) a través de la malla de acrilamida del gel. Las proteínas más pequeñas migran más rápido a través de esta malla y, por tanto, se separan según su tamaño (generalmente medido en kilodaltons, kDa ). La concentración de acrilamida determina la resolución del gel: cuanto mayor sea la concentración de acrilamida, mejor será la resolución de las proteínas de menor peso molecular. Cuanto menor sea la concentración de acrilamida, mejor será la resolución de las proteínas de mayor peso molecular. En la mayoría de las transferencias, las proteínas viajan sólo en una dimensión a lo largo del gel.
Las muestras se cargan en pocillos del gel. Por lo general, un carril se reserva para un marcador o escalera , que es una mezcla disponible comercialmente de proteínas de pesos moleculares conocidos, típicamente teñidas para formar bandas de colores visibles. Cuando se aplica voltaje a lo largo del gel, las proteínas migran a través de él a diferentes velocidades dependiendo de su tamaño. Estas diferentes tasas de avance (diferentes movilidades electroforéticas ) se separan en bandas dentro de cada carril . Luego, las bandas de proteínas se pueden comparar con las bandas de escalera, lo que permite estimar el peso molecular de la proteína.
También es posible utilizar un gel bidimensional que distribuya las proteínas de una única muestra en dos dimensiones. Las proteínas se separan según su punto isoeléctrico ( pH al que tienen una carga neta neutra) en la primera dimensión, y según su peso molecular en la segunda dimensión.
Para que las proteínas sean accesibles a la detección de anticuerpos, se trasladan desde el interior del gel a una membrana, un soporte sólido, que es una parte esencial del proceso. Existen dos tipos de membrana: nitrocelulosa (NC) o difluoruro de polivinilideno (PVDF ). La membrana NC tiene una alta afinidad por las proteínas y su capacidad de retención. Sin embargo, NC es frágil y no permite que la transferencia se utilice para volver a sondear, mientras que la membrana de PVDF permite volver a sondear la transferencia. [1] El método más utilizado para transferir las proteínas se llama electrotransferencia . La electrotransferencia utiliza una corriente eléctrica para extraer las proteínas cargadas negativamente del gel hacia el ánodo cargado positivamente y hacia la membrana de PVDF o NC. Las proteínas se mueven desde el interior del gel hacia la membrana manteniendo la organización que tenían dentro del gel. Un método de transferencia más antiguo implica colocar una membrana encima del gel y una pila de papeles de filtro encima. Toda la pila se coloca en una solución tampón que sube por el papel por acción capilar , arrastrando consigo las proteínas. En la práctica, este método no se utiliza habitualmente debido al largo tiempo del procedimiento.
Como resultado de cualquiera de los procesos de transferencia, las proteínas quedan expuestas en una fina capa de membrana para su detección. Ambas variedades de membrana se eligen por sus propiedades de unión a proteínas no específicas (es decir, unen todas las proteínas igualmente bien). La unión a proteínas se basa en interacciones hidrofóbicas, así como en interacciones cargadas entre la membrana y la proteína. Las membranas de nitrocelulosa son más baratas que el PVDF, pero son mucho más frágiles y no pueden soportar repetidos sondeos.
La tinción de proteínas totales permite visualizar la proteína total que se ha transferido con éxito a la membrana, lo que permite al usuario comprobar la uniformidad de la transferencia de proteínas y realizar la normalización posterior de la proteína objetivo con la cantidad real de proteína por carril. La normalización con el llamado "control de carga" se basó en la inmunotinción de proteínas domésticas en el procedimiento clásico, pero recientemente se encamina hacia la tinción de proteínas totales debido a sus múltiples beneficios. [35] Se han descrito al menos siete enfoques diferentes para la tinción de proteínas totales para la normalización de la transferencia Western: Ponceau S , técnicas sin tinciones, Sypro Ruby, Epicocconone , Coomassie R-350 , Amido Black y Cy5 . [35] Para evitar el ruido de la señal, se debe realizar una tinción de proteínas totales antes del bloqueo de la membrana. Sin embargo, también se han descrito tinciones post-anticuerpos. [36]
Dado que la membrana se ha elegido por su capacidad para unirse a proteínas y que tanto los anticuerpos como la diana son proteínas, se deben tomar medidas para evitar las interacciones entre la membrana y el anticuerpo utilizado para la detección de la proteína diana. El bloqueo de la unión no específica se logra colocando la membrana en una solución diluida de proteína, generalmente entre 3 y 5 % de albúmina sérica bovina (BSA) o leche en polvo descremada (ambas son económicas) en solución salina tamponada con Tris (TBS) o I-Block, con un porcentaje minúsculo (0,1%) de detergente como Tween 20 o Triton X-100 . Aunque se prefiere la leche en polvo descremada debido a su disponibilidad, se necesita una solución de bloqueo adecuada ya que no todas las proteínas de la leche son compatibles con todas las bandas de detección. [1] La proteína en la solución diluida se adhiere a la membrana en todos los lugares donde las proteínas objetivo no se han adherido. Por tanto, cuando se añade el anticuerpo, no puede unirse a la membrana y, por tanto, el único sitio de unión disponible es la proteína diana específica. Esto reduce el fondo en el producto final de la transferencia Western, lo que genera resultados más claros y elimina los falsos positivos.
Durante el proceso de detección, se "sondea" la membrana en busca de la proteína de interés con un anticuerpo modificado que está unido a una enzima indicadora; cuando se expone a un sustrato apropiado, esta enzima provoca una reacción colorimétrica y produce un color. Por diversas razones, esto tradicionalmente se lleva a cabo en un proceso de dos pasos, aunque ahora existen métodos de detección de un solo paso disponibles para determinadas aplicaciones.
Los anticuerpos primarios se generan cuando una especie huésped o un cultivo de células inmunitarias se exponen a la proteína de interés (o una parte de la misma). Normalmente, esto es parte de la respuesta inmune, mientras que aquí se recolectan y se utilizan como herramientas de detección sensibles y específicas que se unen directamente a la proteína.
Después del bloqueo, se incuba con la membrana una solución de anticuerpo primario (generalmente entre 0,5 y 5 microgramos/ml) diluida en tampón de lavado PBS o TBST con agitación suave durante normalmente una hora a temperatura ambiente, o durante la noche a 4ºC . También se pueden incubar a diferentes temperaturas, asociando temperaturas más bajas con una mayor unión, tanto específica (a la proteína objetivo, la "señal") como no específica ("ruido"). Después de la incubación, la membrana se lava varias veces en tampón de lavado para eliminar el anticuerpo primario no unido y minimizar así el fondo. [1] Normalmente, la solución tampón de lavado se compone de una solución salina tamponada con un pequeño porcentaje de detergente y, a veces, con leche en polvo o BSA.
Después de enjuagar la membrana para eliminar el anticuerpo primario no unido, la membrana se expone a otro anticuerpo conocido como anticuerpo secundario . Los anticuerpos provienen de fuentes animales (o de cultivos de hibridomas de origen animal ). El anticuerpo secundario reconoce y se une a la porción específica de especie del anticuerpo primario. Por lo tanto, un anticuerpo secundario anti-ratón se unirá a casi cualquier anticuerpo primario de ratón y puede denominarse anticuerpo "antiespecie" (por ejemplo, anti-ratón, anti-cabra, etc.). Para permitir la detección de la proteína objetivo, el anticuerpo secundario suele estar unido a biotina o a una enzima indicadora como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante . Esto significa que varios anticuerpos secundarios se unirán a un anticuerpo primario y mejorarán la señal, permitiendo la detección de proteínas en una concentración mucho menor que la que sería visible mediante SDS-PAGE sola.
La peroxidasa de rábano picante comúnmente se une a anticuerpos secundarios para permitir la detección de la proteína objetivo mediante quimioluminiscencia . El sustrato quimioluminiscente es escindido por la peroxidasa de rábano picante, lo que da como resultado la producción de luminiscencia . Por lo tanto, la producción de luminiscencia es proporcional a la cantidad de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante y, por lo tanto, mide indirectamente la presencia de la proteína diana. Se coloca una lámina sensible de película fotográfica contra la membrana y la exposición a la luz de la reacción crea una imagen de los anticuerpos unidos a la transferencia. Un método más económico pero menos sensible utiliza una tinción de 4-cloronaftol con peróxido de hidrógeno al 1% ; La reacción de los radicales peróxido con 4-cloronaftol produce una mancha de color púrpura oscuro que puede fotografiarse sin utilizar una película fotográfica especializada.
Al igual que con los procedimientos ELISPOT y ELISA , se puede proporcionar a la enzima una molécula de sustrato que la enzima convertirá en un producto de reacción coloreado que será visible en la membrana (consulte la figura a continuación con bandas azules).
Otro método de detección secundaria de anticuerpos utiliza un anticuerpo unido a un fluoróforo en el infrarrojo cercano. La luz producida por la excitación de un tinte fluorescente es estática, lo que hace que la detección fluorescente sea una medida más precisa y exacta de la diferencia en la señal producida por anticuerpos marcados unidos a proteínas en una transferencia Western. Las proteínas se pueden cuantificar con precisión porque la señal generada por las diferentes cantidades de proteínas en las membranas se mide en un estado estático, en comparación con la quimioluminiscencia, en la que la luz se mide en un estado dinámico. [37]
Una tercera alternativa es utilizar un marcador radiactivo en lugar de una enzima acoplada al anticuerpo secundario, como marcar una proteína de unión a anticuerpos como la proteína A de estafilococo o la estreptavidina con un isótopo radiactivo de yodo. Dado que otros métodos son más seguros, rápidos y económicos, este método ahora rara vez se utiliza; sin embargo, una ventaja de este enfoque es la sensibilidad de las imágenes basadas en autorradiografía, que permite una cuantificación de proteínas de alta precisión cuando se combina con software óptico (por ejemplo, Optiquant).
Históricamente, el proceso de sondeo se realizaba en dos pasos debido a la relativa facilidad de producir anticuerpos primarios y secundarios en procesos separados. Esto brinda a los investigadores y corporaciones enormes ventajas en términos de flexibilidad, reducción de costos y agrega un paso de amplificación al proceso de detección. Sin embargo, dada la llegada del análisis de proteínas de alto rendimiento y los límites de detección más bajos, ha habido interés en desarrollar sistemas de sondeo de un solo paso que permitirían que el proceso se llevara a cabo más rápido y con menos consumibles. Esto requiere un anticuerpo sonda que reconozca la proteína de interés y que contenga una etiqueta detectable, sondas que a menudo están disponibles para etiquetas de proteínas conocidas . La sonda primaria se incuba con la membrana de manera similar a la del anticuerpo primario en un proceso de dos pasos y luego está lista para la detección directa después de una serie de pasos de lavado.
Una vez eliminadas las sondas no unidas, la transferencia Western está lista para detectar las sondas marcadas y unidas a la proteína de interés. En términos prácticos, no todos los westerns revelan proteínas sólo en una banda de la membrana. Se toman aproximaciones de tamaño comparando las bandas teñidas con las del marcador o escalera cargado durante la electroforesis. El proceso se repite comúnmente para una proteína estructural, como la actina o la tubulina , que no debería cambiar entre muestras. La cantidad de proteína diana se normaliza con respecto a la proteína estructural a controlar entre grupos. Una estrategia superior es la normalización de la proteína total visualizada con tricloroetanol [38] [39] o epicocconona . [40] Esta práctica garantiza la corrección de la cantidad de proteína total en la membrana en caso de errores o transferencias incompletas. (ver normalización de Western blot )
El método de detección colorimétrica depende de la incubación de la transferencia Western con un sustrato que reacciona con la enzima indicadora (como la peroxidasa ) que está unida al anticuerpo secundario. Esto convierte el tinte soluble en una forma insoluble de un color diferente que precipita junto a la enzima y tiñe así la membrana. Luego se detiene el desarrollo de la transferencia eliminando por lavado el tinte soluble. Los niveles de proteína se evalúan mediante densitometría (qué tan intensa es la mancha) o espectrofotometría .
Los métodos de detección quimioluminiscente dependen de la incubación de la transferencia Western con un sustrato que brillará cuando se exponga al indicador del anticuerpo secundario. Luego, la luz es detectada por cámaras CCD que capturan una imagen digital del western blot o película fotográfica. El uso de películas para la detección de Western Blot está desapareciendo lentamente debido a la falta de linealidad de la imagen (cuantificación no precisa). La imagen se analiza mediante densitometría, que evalúa la cantidad relativa de tinción de proteínas y cuantifica los resultados en términos de densidad óptica. El software más nuevo permite realizar más análisis de datos, como el análisis del peso molecular, si se utilizan estándares adecuados.
Las etiquetas radiactivas no requieren sustratos enzimáticos, sino que permiten la colocación de una película de rayos X médica directamente contra la transferencia Western, que se desarrolla a medida que se expone a la etiqueta y crea regiones oscuras que corresponden a las bandas de proteínas de interés (ver imagen arriba). La importancia de los métodos de detección radiactiva está disminuyendo debido a su radiación peligrosa [ cita necesaria ] , porque es muy costosa, los riesgos para la salud y la seguridad son altos y la ECL (quimioluminiscencia mejorada) proporciona una alternativa útil.
La sonda marcada con fluorescencia se excita con luz y la emisión de la excitación se detecta mediante un fotosensor, como una cámara CCD equipada con filtros de emisión apropiados, que captura una imagen digital de la transferencia Western y permite análisis de datos adicionales, como análisis de peso molecular y un análisis cuantitativo de transferencia Western. La fluorescencia se considera uno de los mejores métodos de cuantificación, pero es menos sensible que la quimioluminiscencia. [41]
Una diferencia importante entre las membranas de nitrocelulosa y PVDF se relaciona con la capacidad de cada una de soportar la "eliminación" de anticuerpos y la reutilización de la membrana para sondas de anticuerpos posteriores. Si bien existen protocolos bien establecidos disponibles para pelar membranas de nitrocelulosa, el PVDF más resistente permite un pelado más fácil y una mayor reutilización antes de que el ruido de fondo limite los experimentos. Otra diferencia es que, a diferencia de la nitrocelulosa, el PVDF se debe remojar en etanol, isopropanol o metanol al 95% antes de su uso. Las membranas de PVDF también tienden a ser más gruesas y resistentes a los daños durante el uso. [42]
Para garantizar que los resultados de las transferencias Western sean reproducibles, es importante informar los diversos parámetros mencionados anteriormente, incluida la preparación de la muestra, la concentración de proteína utilizada para la carga, el porcentaje de gel y las condiciones de funcionamiento, varios métodos de transferencia, intentando condiciones de bloqueo, concentración de anticuerpos y métodos de identificación y determinación cuantitativa. Muchos de los artículos que se han publicado no cubren todas estas variables. Por lo tanto, es crucial describir diferentes circunstancias o parámetros experimentales para aumentar la repetibilidad y precisión del WB. Por lo tanto, para aumentar la repetibilidad del WB, se requieren criterios mínimos de presentación de informes. [2] [43]
SDS-PAGE bidimensional utiliza los principios y técnicas descritos anteriormente. 2-D SDS-PAGE, como su nombre indica, implica la migración de polipéptidos en 2 dimensiones. Por ejemplo, en la primera dimensión los polipéptidos se separan según su punto isoeléctrico , mientras que en la segunda dimensión los polipéptidos se separan según su peso molecular . El punto isoeléctrico de una proteína determinada está determinado por el número relativo de aminoácidos cargados positivamente (p. ej., lisina, arginina) y negativamente (p. ej., glutamato, aspartato), donde los aminoácidos cargados negativamente contribuyen a un punto isoeléctrico bajo y los aminoácidos cargados positivamente contribuyen. a un punto isoeléctrico alto. Las muestras también podrían separarse primero en condiciones no reductoras utilizando SDS-PAGE y en condiciones reductoras en la segunda dimensión, que rompe los enlaces disulfuro que mantienen unidas las subunidades. SDS-PAGE también podría combinarse con urea-PAGE para obtener un gel bidimensional.
En principio, este método permite la separación de todas las proteínas celulares en un único gel grande. Una ventaja importante de este método es que a menudo distingue entre diferentes isoformas de una proteína particular, por ejemplo, una proteína que ha sido fosforilada (mediante la adición de un grupo cargado negativamente). Las proteínas que se han separado se pueden extraer del gel y luego analizarlas mediante espectrometría de masas , que identifica su peso molecular.
Puede haber una señal débil o ausente en la banda por varios motivos relacionados con la cantidad de anticuerpo y antígeno utilizados. Este problema podría resolverse utilizando las concentraciones y diluciones ideales de antígenos y anticuerpos especificadas en la hoja de datos del proveedor. Aumentar el período de exposición en el software del sistema de detección puede abordar las bandas débiles causadas por concentraciones más bajas de muestra y anticuerpos. [2]
Cuando las proteasas descomponen la proteína, pueden aparecer varias bandas distintas a las predichas de bajo peso molecular. El desarrollo de numerosas bandas se puede prevenir preparando adecuadamente muestras de proteínas con suficientes inhibidores de proteasa. Pueden aparecer múltiples bandas en la región de alto peso molecular porque algunas proteínas forman dímeros, trímeros y multímeros; Este problema podría resolverse calentando la muestra durante períodos de tiempo más largos. Las proteínas con modificaciones postraduccionales (PTM) o numerosas isoformas provocan la aparición de varias bandas en diversas áreas de peso molecular. Los PTM se pueden eliminar de una muestra utilizando productos químicos específicos, que también eliminan las bandas adicionales. [2]
Las fuertes concentraciones de anticuerpos, el bloqueo inadecuado, el lavado inadecuado y el tiempo de exposición excesivo durante la obtención de imágenes pueden provocar un fondo elevado en las transferencias. Se podría evitar un alto nivel de fondo en los borrones solucionando estos problemas. [2]
Se ha afirmado que se han producido una variedad de bandas extrañas y desiguales, incluidos puntos negros, manchas o bandas blancas y bandas curvas. Los puntos de bloque se eliminan de las manchas mediante un bloqueo efectivo. Se desarrollan manchas blancas como resultado de las burbujas entre la membrana y el gel. Aparecen bandas blancas en las transferencias cuando los anticuerpos principales y secundarios están presentes en concentraciones significativas. Debido al alto voltaje utilizado durante la ejecución del gel y la rápida migración de proteínas, aparecen bandas sonrientes en las transferencias. Las bandas extrañas en la mancha se resuelven resolviendo estos problemas. [2]
Durante la transferencia Western, podrían surgir varios problemas relacionados con los diferentes pasos de este procedimiento. Esos problemas podrían originarse en un paso de análisis de proteínas, como la detección de proteínas poco modificadas o postraduccionalmente. Además, pueden basarse en la selección de anticuerpos, ya que la calidad de los anticuerpos juega un papel importante en la detección de proteínas específicamente. [3] Debido a la presencia de este tipo de problemas, se están produciendo una variedad de mejoras en los campos de la preparación de lisados celulares y procedimientos de transferencia para obtener resultados confiables. Además, para lograr un análisis más sensible y superar los problemas asociados con la transferencia Western, se han desarrollado y utilizado varias técnicas diferentes, como la transferencia Far Western , la transferencia por difusión, la transferencia Western con resolución unicelular y la transferencia Western con microfluidos automatizada. [3]
Los investigadores utilizan diferentes programas informáticos para procesar y alinear secciones de imágenes para una presentación elegante de los resultados de la transferencia Western. Las herramientas populares incluyen Sciugo, Microsoft PowerPoint , Adobe Illustrator y GIMP .
Desde 1980, el Western blot se ha convertido en el método más utilizado en biología molecular para determinar la presencia y cantidad de una determinada proteína. A lo largo de los años, se han desarrollado muchos métodos sistemáticos "avanzados" y "optimizados". Estos desarrollos proporcionan resultados avanzados y más sensibles, con la ayuda de tecnologías de imágenes más avanzadas y métodos modernos de etiquetado fluorescente. [2]
El método con mayor tasa de adopción para determinar las proteínas de unión al ADN y las interacciones proteína-ADN es la prueba de cambio de movilidad electroforética. Los complejos proteína-ADN se analizan mediante shift-WB. Se crea mediante la transferencia de complejos de proteína y ADN, en los que el ADN de la membrana cargada se coloca debajo de la membrana de nitrocelulosa mientras las proteínas se mantienen en la membrana. Luego, se utilizan anticuerpos específicos para identificar las proteínas y un marcador radiactivo para identificar el ADN. Además, las proteínas y el ADN transmitidos se pueden recuperar y examinar con mayor detalle. [2] [44]
El WB unicelular (scWB), además del WB convencional, se considera un gran avance en el estudio de la localización subcelular de proteínas y en la evaluación de proteínas unicelulares. Se utiliza para medir los niveles y condiciones de expresión de proteínas de una célula a otra. Con la ayuda del WB unicelular, la selectividad y especificidad de la transferencia Western se ampliaron para incluir el análisis de proteínas unicelulares. Esta técnica supera las limitaciones de precisión y sensibilidad de los anticuerpos. Además, debido a su versatilidad, puede utilizarse para medir numerosas proteínas diana simultáneamente de diferentes líneas celulares y células individuales. [2] [45]
El desarrollo conocido como WB cuantificable basado en fluorescencia QFWB permite a los investigadores realizar análisis de expresión comparativos con mayor sensibilidad y precisión que nunca. Cuantificable en QFWB se refiere a genuinamente cuantitativo con mayor sensibilidad. Este método se emplea para identificar las pequeñas variaciones de expresión entre varias muestras. Con la ayuda de un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia, QFWB produce un perfil de detección lineal. Las técnicas modernas de QFWB permiten el etiquetado dual simultáneo y son más sensibles para identificar variaciones mínimas. [2] [46]
La transferencia Western computarizada cuantitativa analiza la reactividad de anticuerpos individuales a antígenos específicos para identificar determinantes inmunodominantes e inmunorecesivos utilizando dos medidas, como la intensidad de la banda neta y la intensidad total del carril del WB. La creación de pruebas de serodiagnóstico rápido y de vacunas eficaces es posible gracias a la identificación de determinados antígenos inmunodominantes. El estudio busca marcadores serológicos para el diagnóstico precoz de cáncer, enfermedades virales y autoinmunes mediante Western blot cuantitativo computarizado. [2] [47]
Es una técnica que combina la resolución de proteínas SDS-PAGE convencional con una plataforma de microarrays basada en perlas que inmoviliza proteínas en microesferas. Esta combinación de separación, uniformidad y sensibilidad de proteínas permite la cuantificación rápida de una serie de objetivos proteicos diferentes, así como sus cambios. El beneficio de DigiWest es que la transferencia Western se lleva a cabo utilizando micromatrices basadas en perlas, lo que permite la detección y el análisis simultáneos de cientos de proteínas distintas y sus cambios utilizando una amplia gama de anticuerpos variados. [2] [48]
Para detectar muchas proteínas en un solo chip de microfluidos, la transferencia Western de microfluidos se lleva a cabo mediante una serie de procesos, que incluyen el enriquecimiento de la muestra, el tamaño de la proteína, la deposición de proteínas y luego el sondeo de anticuerpos in situ. Un gel de poliacrilamida fotorreactivo (luz ultravioleta) y una superficie fotopatternable (luz azul) son la base de este procedimiento de varios pasos. Debido a las mejoras en el rendimiento analítico, el WB ahora se puede completar en 10 a 60 minutos manteniendo límites de detección de alta sensibilidad (50 picomoles) y niveles de detección de componentes multiplexados (femtogramos). Por lo tanto, al fusionar una especificidad excelente y los beneficios de alto rendimiento de la multiplexación, WB crea una piedra angular para la proteómica rápida. [2] [49]
Una técnica de WB mejorada llamada WB multistrip se basa en la transferencia simultánea de diferentes proteínas de varias tiras de gel de poliacrilamida a una única membrana de difluoruro de polivinilideno o nitrocelulosa. Multistrip WB permite el monitoreo simultáneo de hasta nueve proteínas separadas a partir de la misma carga de muestra y un aumento de hasta diez veces en la producción de datos para un solo ciclo de WB. La biología de sistemas, la investigación de señalización celular y el diagnóstico biomédico se beneficiarían del uso de esta técnica. [2] [50]
El Western Blot basado en electroforesis capilar y de microchip se creó para reducir la cantidad de muestras de proteínas y el tiempo que lleva ejecutar el Western Blot. Contribuye a una medición más sensible y precisa de diversas proteínas dianas de cualquier lisado unicelular realizada en un microchip. 400 nanogramos de lisado celular es todo lo que se necesita para identificar y cuantificar once proteínas diferentes. [2] [51]
