En biología molecular , los biochips son sustratos diseñados ("laboratorios miniaturizados") que pueden albergar un gran número de reacciones bioquímicas simultáneas. Uno de los objetivos de la tecnología de biochips es analizar de forma eficiente un gran número de analitos biológicos, con posibles aplicaciones que van desde el diagnóstico de enfermedades hasta la detección de agentes bioterroristas . Por ejemplo, se están investigando biochips microfluídicos digitales para aplicaciones en campos biomédicos. En un biochip microfluídico digital, un grupo de células (adyacentes) en la matriz microfluídica se puede configurar para que funcionen como almacenamiento, operaciones funcionales y para transportar gotas de fluido de forma dinámica. [1]
El desarrollo comenzó con los primeros trabajos sobre la tecnología de sensores subyacente . Uno de los primeros sensores portátiles basados en la química fue el electrodo de pH de vidrio, inventado en 1922 por Hughes. [2] El concepto básico de utilizar sitios de intercambio para crear membranas permeoelectivas se utilizó para desarrollar otros sensores de iones en los años posteriores. Por ejemplo, se produjo un sensor de K + incorporando valinomicina en una membrana fina. [3]
En 1953, Watson y Crick anunciaron su descubrimiento de la ahora familiar estructura de doble hélice de las moléculas de ADN y sentaron las bases para la investigación genética que continúa hasta el día de hoy. [4] El desarrollo de técnicas de secuenciación en 1977 por Gilbert [5] y Sanger [6] (trabajando por separado) permitió a los investigadores leer directamente los códigos genéticos que proporcionan instrucciones para la síntesis de proteínas . Esta investigación mostró cómo la hibridación de cadenas simples de oligonucleótidos complementarios podría usarse como base para la detección de ADN. Dos desarrollos adicionales posibilitaron la tecnología utilizada en el ADN moderno. Primero, en 1983 Kary Mullis inventó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), [4] un método para amplificar concentraciones de ADN. Este descubrimiento hizo posible la detección de cantidades extremadamente pequeñas de ADN en muestras. En segundo lugar, en 1986, Hood y sus colaboradores idearon un método para etiquetar moléculas de ADN con etiquetas fluorescentes en lugar de radioetiquetas, [7] permitiendo así que los experimentos de hibridación se observen ópticamente.
La figura 1 muestra la composición de una plataforma de biochip típica. El componente de detección real (o "chip") es solo una pieza de un sistema de análisis completo. Se debe realizar una transducción para traducir el evento de detección real (unión de ADN, oxidación/reducción , etc. ) a un formato que pueda entender una computadora ( voltaje , intensidad de luz, masa, etc. ), lo que luego permite un análisis y procesamiento adicionales para producir un resultado final legible para humanos . Las múltiples tecnologías necesarias para hacer un biochip exitoso, desde la química de detección hasta la micromatriz y el procesamiento de señales, requieren un enfoque verdaderamente multidisciplinario, lo que hace que la barrera de entrada sea difícil. Uno de los primeros biochips comerciales fue presentado por Affymetrix . Sus productos "GeneChip" contienen miles de sensores de ADN individuales para su uso en la detección de defectos o polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en genes como p53 (un supresor de tumores) y BRCA1 y BRCA2 (relacionados con el cáncer de mama). [8] Los chips se producen utilizando técnicas de microlitografía tradicionalmente utilizadas para fabricar circuitos integrados (ver más abajo).
El microarray (la densa red bidimensional de biosensores) es el componente crítico de una plataforma de biochip. Normalmente, los sensores se depositan sobre un sustrato plano, que puede ser pasivo ( por ejemplo , silicio o vidrio) o activo; este último consiste en dispositivos electrónicos o micromecánicos integrados que realizan o ayudan a la transducción de señales. La química de superficie se utiliza para unir covalentemente las moléculas del sensor al medio del sustrato. La fabricación de microarrays no es trivial y es un obstáculo económico y tecnológico importante que, en última instancia, puede decidir el éxito de las futuras plataformas de biochip. El principal desafío de fabricación es el proceso de colocar cada sensor en una posición específica (normalmente en una cuadrícula cartesiana ) sobre el sustrato. Existen varios medios para lograr la colocación, pero normalmente se utilizan sistemas de micropipeteo robótico [9] o microimpresión [10] para colocar pequeños puntos de material del sensor en la superficie del chip. Debido a que cada sensor es único, solo se pueden colocar unos pocos puntos a la vez. La naturaleza de bajo rendimiento de este proceso da como resultado altos costos de fabricación.
Fodor y sus colegas desarrollaron un proceso de fabricación único (utilizado posteriormente por Affymetrix ) en el que se utiliza una serie de pasos de microlitografía para sintetizar de forma combinatoria cientos de miles de sensores de ADN monocatenarios únicos sobre un sustrato, un nucleótido a la vez. [11] [12] Se necesita un paso de litografía por tipo de base; por lo tanto, se requiere un total de cuatro pasos por nivel de nucleótido. Aunque esta técnica es muy potente en el sentido de que se pueden crear muchos sensores simultáneamente, actualmente solo es factible para crear cadenas cortas de ADN (15-25 nucleótidos). Los factores de confiabilidad y costo limitan la cantidad de pasos de fotolitografía que se pueden realizar. Además, las técnicas de síntesis combinatoria dirigidas por luz actualmente no son posibles para proteínas u otras moléculas sensoras.
Como se ha indicado anteriormente, la mayoría de los microarrays consisten en una cuadrícula cartesiana de sensores. Este enfoque se utiliza principalmente para mapear o "codificar" las coordenadas de cada sensor con respecto a su función. Los sensores de estos arreglos suelen utilizar una técnica de señalización universal ( por ejemplo, fluorescencia), por lo que las coordenadas son su única característica de identificación. Estos arreglos deben fabricarse mediante un proceso en serie ( es decir , que requiere múltiples pasos secuenciales) para garantizar que cada sensor se coloque en la posición correcta.
La fabricación "aleatoria", en la que los sensores se colocan en posiciones arbitrarias en el chip, es una alternativa al método en serie. No se requiere el tedioso y costoso proceso de posicionamiento, lo que permite el uso de técnicas de autoensamblaje en paralelo. En este enfoque, se pueden producir grandes lotes de sensores idénticos; luego, los sensores de cada lote se combinan y ensamblan en una matriz. Se debe utilizar un esquema de codificación no basado en coordenadas para identificar cada sensor. Como muestra la figura, este diseño se demostró por primera vez (y luego fue comercializado por Illumina) utilizando perlas funcionalizadas colocadas aleatoriamente en los pocillos de un cable de fibra óptica grabado . [13] [14] Cada perla se codificó de forma única con una firma fluorescente. Sin embargo, este esquema de codificación está limitado en el número de combinaciones de colorantes únicas que se pueden utilizar y diferenciar con éxito.
Los microarrays no se limitan al análisis de ADN ; los microarrays de proteínas , los microarrays de anticuerpos y los microarrays de compuestos químicos también se pueden producir utilizando biochips. Randox Laboratories Ltd. lanzó Evidence, el primer analizador de proteínas con tecnología de matriz de biochips en 2003. En la tecnología de matriz de biochips de proteínas, el biochip reemplaza la placa o cubeta ELISA como plataforma de reacción. El biochip se utiliza para analizar simultáneamente un panel de pruebas relacionadas en una sola muestra, lo que produce un perfil del paciente . El perfil del paciente se puede utilizar en la detección de enfermedades, el diagnóstico , el seguimiento de la progresión de la enfermedad o el seguimiento del tratamiento. La realización de múltiples análisis simultáneamente, descritos como multiplexación, permite una reducción significativa en el tiempo de procesamiento y la cantidad de muestra de paciente necesaria. La tecnología de matriz de biochips es una aplicación novedosa de una metodología familiar, que utiliza inmunoensayos tipo sándwich, competitivos y de captura de anticuerpos . La diferencia con los inmunoensayos convencionales es que los ligandos de captura se unen covalentemente a la superficie del biochip en una matriz ordenada en lugar de en solución.
En los ensayos sándwich se utiliza un anticuerpo marcado con enzima; en los ensayos competitivos se utiliza un antígeno marcado con enzima. Cuando el anticuerpo se une al antígeno, se produce una reacción de quimioluminiscencia . La detección se realiza mediante una cámara con dispositivo acoplado a carga (CCD). La cámara CCD es un sensor sensible y de alta resolución capaz de detectar y cuantificar con precisión niveles muy bajos de luz. Las regiones de prueba se ubican utilizando un patrón de cuadrícula y luego las señales de quimioluminiscencia se analizan mediante un software de imágenes para cuantificar rápidamente y simultáneamente los analitos individuales.
Los biochips también se utilizan en el campo de la microfisiometría, por ejemplo en aplicaciones de piel en chip [15] .
Para obtener detalles sobre otras tecnologías de matriz, consulte Microarray de anticuerpos .
