Un microarray de proteínas (o chip de proteínas ) es un método de alto rendimiento utilizado para rastrear las interacciones y actividades de las proteínas, y para determinar su función, y determinar la función a gran escala. [1] Su principal ventaja radica en el hecho de que se pueden rastrear grandes cantidades de proteínas en paralelo. El chip consta de una superficie de soporte como un portaobjetos de vidrio, una membrana de nitrocelulosa, una perla o una placa de microtitulación , a la que se une un conjunto de proteínas de captura. [2] Se añaden moléculas de sonda , normalmente marcadas con un tinte fluorescente, al conjunto. Cualquier reacción entre la sonda y la proteína inmovilizada emite una señal fluorescente que se lee mediante un escáner láser . [3] Los microarrays de proteínas son rápidos, automatizados, económicos y altamente sensibles, y consumen pequeñas cantidades de muestras y reactivos. [4] El concepto y la metodología de los microarrays de proteínas se introdujeron e ilustraron por primera vez en microarrays de anticuerpos (también conocidos como matriz de anticuerpos ) en 1983 en una publicación científica [5] y una serie de patentes. [6] La tecnología de alto rendimiento detrás de la micromatriz de proteínas fue relativamente fácil de desarrollar ya que se basa en la tecnología desarrollada para las micromatriz de ADN , [7] que se han convertido en las micromatriz más utilizadas .
Los microarrays de proteínas se desarrollaron debido a las limitaciones del uso de microarrays de ADN para determinar los niveles de expresión génica en proteómica . La cantidad de ARNm en la célula a menudo no refleja los niveles de expresión de las proteínas a las que corresponden. Dado que generalmente es la proteína, en lugar del ARNm, la que tiene el papel funcional en la respuesta celular, se necesitaba un enfoque novedoso. Además, las modificaciones postraduccionales , que a menudo son críticas para determinar la función de la proteína, no son visibles en los microarrays de ADN. [8] Los microarrays de proteínas reemplazan las técnicas proteómicas tradicionales, como la electroforesis en gel 2D o la cromatografía , que consumían mucho tiempo, eran intensivas en mano de obra y no eran adecuadas para el análisis de proteínas poco abundantes.
Las proteínas se disponen sobre una superficie sólida, como portaobjetos de microscopio, membranas, perlas o placas de microtitulación. La función de esta superficie es proporcionar un soporte sobre el que se puedan inmovilizar las proteínas. Debe demostrar propiedades de unión máximas, manteniendo a la vez la proteína en su conformación nativa para que se conserve su capacidad de unión. Los portaobjetos de microscopio hechos de vidrio o silicio son una opción popular, ya que son compatibles con los robots de arreglos y escáneres láser que se obtienen fácilmente y que se han desarrollado para la tecnología de microarrays de ADN. Los portaobjetos de película de nitrocelulosa son ampliamente aceptados como el sustrato con mayor capacidad de unión a proteínas para aplicaciones de microarrays de proteínas.
La superficie sólida elegida se cubre entonces con un recubrimiento que debe cumplir las funciones simultáneas de inmovilizar la proteína, evitar su desnaturalización , orientarla en la dirección adecuada para que sus sitios de unión sean accesibles y proporcionar un entorno hidrófilo en el que pueda producirse la reacción de unión. También debe mostrar una unión no específica mínima para minimizar el ruido de fondo en los sistemas de detección. Además, debe ser compatible con diferentes sistemas de detección. Los agentes inmovilizadores incluyen capas de aluminio u oro, polímeros hidrófilos y geles de poliacrilamida , o tratamiento con aminas , aldehído o epoxi . Se emplean tecnologías de película delgada como la deposición física en fase de vapor (PVD) y la deposición química en fase de vapor (CVD) para aplicar el recubrimiento a la superficie de soporte.
Un entorno acuoso es esencial en todas las etapas de fabricación y operación de matrices para evitar la desnaturalización de las proteínas. Por lo tanto, los tampones de muestra contienen un alto porcentaje de glicerol (para reducir el punto de congelación) y la humedad del entorno de fabricación se regula cuidadosamente. Los micropocillos tienen la doble ventaja de proporcionar un entorno acuoso y, al mismo tiempo, evitar la contaminación cruzada entre muestras.
En el tipo más común de matriz de proteínas, los robots colocan grandes cantidades de proteínas o sus ligandos sobre un soporte sólido recubierto en un patrón predefinido. Esto se conoce como impresión de contacto robótica o manchado robótico. Otro método de fabricación es la inyección de tinta , un método sin contacto y de gotas a demanda para dispersar los polímeros proteicos sobre la superficie sólida en el patrón deseado. [9] El manchado piezoeléctrico es un método similar a la impresión por inyección de tinta. El cabezal de impresión se mueve a través de la matriz y en cada punto utiliza estimulación eléctrica para entregar las moléculas de proteína sobre la superficie a través de pequeños chorros. Este también es un proceso sin contacto. [10] La fotolitografía es un cuarto método para colocar las proteínas sobre la superficie. La luz se utiliza en asociación con fotomáscaras , placas opacas con agujeros o transparencias que permiten que la luz brille a través de un patrón definido. Luego, una serie de tratamientos químicos permite la deposición de la proteína en el patrón deseado sobre el material debajo de la fotomáscara. [11]
Las moléculas de captura dispuestas sobre la superficie sólida pueden ser anticuerpos , antígenos , aptámeros (ligandos basados en ácidos nucleicos), aficuerpos (pequeñas moléculas diseñadas para imitar anticuerpos monoclonales) o proteínas de longitud completa. Las fuentes de dichas proteínas incluyen sistemas de expresión basados en células para proteínas recombinantes , purificación a partir de fuentes naturales, producción in vitro mediante sistemas de traducción sin células y métodos sintéticos para péptidos . Muchos de estos métodos se pueden automatizar para una producción de alto rendimiento, pero se debe tener cuidado para evitar condiciones de síntesis o extracción que resulten en una proteína desnaturalizada que, dado que ya no reconoce a su pareja de unión, hace que la matriz sea inútil.
Las proteínas son muy sensibles a los cambios en su microambiente, lo que supone un reto para mantener las matrices de proteínas en condiciones estables durante largos periodos de tiempo. Los métodos in situ , inventados y publicados por Mingyue He y Michael Taussig en 2001 [12] [13] , implican la síntesis de proteínas en chip cuando se requiere, directamente a partir del ADN utilizando sistemas de expresión de proteínas libres de células. Como el ADN es una molécula muy estable, no se deteriora con el tiempo y, por tanto, es adecuado para el almacenamiento a largo plazo. Este enfoque también es ventajoso porque evita los laboriosos y a menudo costosos procesos de purificación de proteínas por separado y clonación de ADN , ya que las proteínas se crean e inmovilizan simultáneamente en un solo paso en la superficie del chip. Ejemplos de técnicas in situ son PISA (protein in situ array), NAPPA (nucleic acid programmable protein array) y DAPA (DNA array to protein array).
Hay tres tipos de microarrays de proteínas que se utilizan actualmente para estudiar las actividades bioquímicas de las proteínas.
Los microarrays analíticos también se conocen como arrays de captura. En esta técnica, una biblioteca de anticuerpos, aptámeros o aficuerpos se coloca en la superficie del soporte. Estos se utilizan como moléculas de captura ya que cada uno se une específicamente a una proteína particular. El array se prueba con una solución proteica compleja, como un lisado celular . El análisis de las reacciones de unión resultantes utilizando varios sistemas de detección puede proporcionar información sobre los niveles de expresión de proteínas particulares en la muestra, así como mediciones de afinidades y especificidades de unión. Este tipo de microarray es especialmente útil para comparar la expresión de proteínas en diferentes soluciones. Por ejemplo, la respuesta de las células a un factor particular se puede identificar comparando los lisados de células tratadas con sustancias específicas o cultivadas en ciertas condiciones con los lisados de células de control. Otra aplicación es la identificación y el perfil de tejidos enfermos.
Los microarrays de proteínas en fase inversa (RPPA) involucran muestras complejas, como lisados de tejido. Las células se aíslan de varios tejidos de interés y se lisan. El lisado se coloca en el microarray y se prueba con anticuerpos contra la proteína objetivo de interés. Estos anticuerpos se detectan típicamente con ensayos quimioluminiscentes , fluorescentes o colorimétricos . Los péptidos de referencia se imprimen en los portaobjetos para permitir la cuantificación de proteínas de los lisados de muestra. Los RPA permiten la determinación de la presencia de proteínas alteradas u otros agentes que pueden ser el resultado de una enfermedad. Específicamente, las modificaciones postraduccionales, que generalmente se alteran como resultado de una enfermedad, se pueden detectar utilizando RPA. [14]
Los microarrays de proteínas funcionales (también conocidos como arrays de proteínas diana) se construyen inmovilizando grandes cantidades de proteínas purificadas y se utilizan para identificar interacciones proteína-proteína, proteína-ADN, proteína- ARN , proteína- fosfolípido y proteína-molécula pequeña, para analizar la actividad enzimática y para detectar anticuerpos y demostrar su especificidad. Se diferencian de los arrays analíticos en que los arrays de proteínas funcionales están compuestos por arrays que contienen proteínas funcionales de longitud completa o dominios proteicos. Estos chips de proteínas se utilizan para estudiar las actividades bioquímicas de todo el proteoma en un solo experimento.
El elemento clave en cualquier ensayo basado en microarrays de proteínas funcionales es que las proteínas incluidas en el array deben conservar su estructura nativa, de modo que puedan tener lugar interacciones funcionales significativas en la superficie del array. Las ventajas de controlar el modo preciso de unión a la superficie mediante el uso de una etiqueta de afinidad adecuada son que las proteínas inmovilizadas tendrán una orientación homogénea, lo que dará como resultado una mayor actividad específica y una mayor relación señal-ruido en los ensayos, con menos interferencias de interacciones no específicas. [15] [16]
Los métodos de detección de matrices de proteínas deben dar una señal alta y un fondo bajo. El método de detección más común y ampliamente utilizado es el etiquetado de fluorescencia, que es altamente sensible, seguro y compatible con los escáneres láser de microarrays disponibles en el mercado. Se pueden utilizar otras etiquetas, como etiquetas de afinidad, fotoquímicas o radioisotópicas. Estas etiquetas se adhieren a la sonda misma y pueden interferir con la reacción de la sonda con la proteína objetivo. Por lo tanto, hay una serie de métodos de detección sin etiquetas disponibles, como la resonancia de plasmón superficial (SPR), los nanotubos de carbono, los sensores de nanocables de carbono (donde la detección se produce mediante cambios en la conductancia) y los voladizos de sistemas microelectromecánicos (MEMS). [17] Todos estos métodos de detección sin etiquetas son relativamente nuevos y aún no son adecuados para la detección de interacciones de proteínas de alto rendimiento; sin embargo, ofrecen muchas promesas para el futuro. Los inmunoensayos en andamios de micropilares de "papel sintético" de tiol-eno han demostrado generar una señal de fluorescencia superior. [18]
La cuantificación de proteínas en portaobjetos recubiertos de nitrocelulosa puede utilizar la detección fluorescente de infrarrojo cercano. Esto limita las interferencias debidas a la autofluorescencia de la nitrocelulosa en las longitudes de onda ultravioleta utilizadas para las sondas de detección fluorescente estándar. [19]
Hay cinco áreas principales en las que se aplican las matrices de proteínas: diagnóstico, proteómica, análisis funcional de proteínas, caracterización de anticuerpos y desarrollo de tratamientos.
El diagnóstico implica la detección de antígenos y anticuerpos en muestras de sangre; la elaboración de perfiles de sueros para descubrir nuevos biomarcadores de enfermedades ; el seguimiento de estados patológicos y respuestas a terapias en medicina personalizada; el seguimiento del medio ambiente y los alimentos. El bioensayo digital es un ejemplo de uso de microarreglos de proteínas con fines diagnósticos. En esta tecnología, un conjunto de micropocillos en un chip de vidrio/polímero se siembran con perlas magnéticas (recubiertas con anticuerpos marcados con fluorescencia), se someten a antígenos específicos y luego se caracterizan mediante un microscopio a través del recuento de pocillos fluorescentes. Recientemente se ha demostrado una plataforma de fabricación rentable (que utiliza polímeros OSTE ) para tales conjuntos de micropocillos y el sistema modelo de bioensayo se ha caracterizado con éxito. [20]
La proteómica se ocupa del perfil de expresión de proteínas, es decir, qué proteínas se expresan en el lisado de una célula particular.
El análisis funcional de proteínas es la identificación de interacciones proteína-proteína (por ejemplo, identificación de miembros de un complejo proteico), interacciones proteína-fosfolípido, objetivos de moléculas pequeñas, sustratos enzimáticos (particularmente los sustratos de las quinasas ) y ligandos de receptores.
La caracterización de anticuerpos implica caracterizar la reactividad cruzada , la especificidad y el mapeo de epítopos .
El desarrollo de tratamientos implica el desarrollo de terapias específicas para antígenos en el campo de la autoinmunidad , el cáncer y las alergias; la identificación de pequeñas moléculas que podrían utilizarse potencialmente como nuevos medicamentos.
A pesar de las considerables inversiones realizadas por varias empresas, los chips de proteínas aún no han inundado el mercado. Los fabricantes han descubierto que las proteínas son en realidad bastante difíciles de manipular. La producción de proteínas fiables, consistentes y de alto rendimiento que estén correctamente plegadas y sean funcionales está plagada de dificultades, ya que a menudo dan como resultado proteínas de bajo rendimiento debido a la menor solubilidad y la formación de cuerpos de inclusión. [ cita requerida ] Un chip de proteínas requiere muchos más pasos en su creación que un chip de ADN .
Existen varios enfoques para abordar este problema que difieren fundamentalmente según si las proteínas se inmovilizan mediante interacciones no específicas y poco definidas o mediante un conjunto específico de interacciones conocidas. El primer enfoque es atractivo por su simplicidad y es compatible con proteínas purificadas derivadas de fuentes nativas o recombinantes [21] [22], pero presenta varios riesgos. El más notable de ellos se relaciona con la naturaleza incontrolada de las interacciones entre cada proteína y la superficie; en el mejor de los casos, esto podría dar lugar a una población heterogénea de proteínas en las que los sitios activos a veces están ocluidos por la superficie; en el peor de los casos, podría destruir la actividad por completo debido al desdoblamiento parcial o completo mediado por la superficie de la proteína inmovilizada.
Los desafíos incluyen: 1) encontrar una superficie y un método de unión que permita a las proteínas mantener su estructura secundaria o terciaria y, por lo tanto, su actividad biológica y sus interacciones con otras moléculas, 2) producir una matriz con una larga vida útil para que las proteínas en el chip no se desnaturalicen en un corto período de tiempo, 3) identificar y aislar anticuerpos u otras moléculas de captura contra cada proteína en el genoma humano, 4) cuantificar los niveles de proteína unida mientras se asegura la sensibilidad y se evita el ruido de fondo, 5) extraer la proteína detectada del chip para analizarla más a fondo, 6) reducir la unión no específica por los agentes de captura, 7) la capacidad del chip debe ser suficiente para permitir que se visualice una representación lo más completa posible del proteoma; las proteínas abundantes abruman la detección de proteínas menos abundantes, como las moléculas de señalización y los receptores, que generalmente son de mayor interés terapéutico. [23]