La tecnología de matrices de proteínas libres de células produce microarreglos de proteínas mediante la síntesis in vitro de las proteínas objetivo a partir de sus plantillas de ADN . Este método de síntesis de microarreglos de proteínas supera los numerosos obstáculos y desafíos a los que se enfrentan los métodos tradicionales de producción de matrices de proteínas [1] que han impedido la adopción generalizada de microarreglos de proteínas en proteómica . Los arreglos de proteínas fabricados con esta tecnología se pueden utilizar para probar interacciones proteína-proteína , así como interacciones de proteínas con otras moléculas celulares como el ADN y los lípidos. Otras aplicaciones incluyen ensayos de inhibición enzimática y pruebas de especificidad de anticuerpos.
El éxito arrollador de los microarrays de ADN ha generado mucho entusiasmo por los microarrays de proteínas. Sin embargo, estos no han despegado del todo como se esperaba, incluso con las herramientas y los conocimientos técnicos necesarios para su adaptación. Una de las principales razones es que los microarrays de proteínas son mucho más laboriosos y técnicamente más difíciles de construir que los microarrays de ADN.
Los métodos tradicionales de producción de matrices de proteínas requieren la expresión in vivo por separado de cientos o miles de proteínas, seguida de una purificación e inmovilización por separado de las proteínas en una superficie sólida. La tecnología de matrices de proteínas libres de células intenta simplificar la construcción de micromatrices de proteínas al evitar la necesidad de expresar las proteínas en células bacterianas y la posterior necesidad de purificarlas. Aprovecha la tecnología de síntesis de proteínas libres de células disponible que ha demostrado que la síntesis de proteínas puede ocurrir sin una célula intacta siempre que se proporcionen extractos celulares que contengan la plantilla de ADN, las materias primas y la maquinaria de transcripción y traducción . [2] Las fuentes comunes de extractos celulares utilizados en la tecnología de matrices de proteínas libres de células incluyen germen de trigo , Escherichia coli y reticulocitos de conejo . También se han utilizado extractos celulares de otras fuentes como hipertermófilos , hibridomas , ovocitos de Xenopus , células de insectos, mamíferos y humanos. [3]
Las proteínas diana se sintetizan in situ en el microarray de proteínas, directamente a partir de la plantilla de ADN, lo que permite saltarse muchos de los pasos de la producción tradicional de microarrays de proteínas y las limitaciones técnicas que conlleva. Y lo que es más importante, la expresión de las proteínas se puede realizar en paralelo, lo que significa que todas las proteínas se pueden expresar juntas en una única reacción. Esta capacidad de multiplexar la expresión de proteínas supone un importante ahorro de tiempo en el proceso de producción.
En el método in situ , la síntesis de proteínas se lleva a cabo en una superficie de matriz de proteínas que está recubierta previamente con un reactivo de captura de proteínas o anticuerpo . Una vez que las proteínas recién sintetizadas se liberan del ribosoma , la secuencia de etiqueta que también se sintetiza en el extremo N o C de cada proteína naciente se unirá al reactivo de captura o anticuerpo, inmovilizando así las proteínas para formar una matriz. Las etiquetas de uso común incluyen polihistidina (His)6 y glutatión s-transferasa (GST).
Varios grupos de investigación han desarrollado sus propios métodos, cada uno diferente en su enfoque, pero pueden resumirse en tres grupos principales.
NAPPA [4] utiliza una plantilla de ADN que ya ha sido inmovilizada sobre la misma superficie de captura de proteínas. La plantilla de ADN está biotinilada y unida a avidina que está recubierta previamente sobre la superficie de captura de proteínas. Las proteínas recién sintetizadas que están marcadas con GST se inmovilizan luego junto a la plantilla de ADN uniéndose al anticuerpo de captura anti-GST policlonal adyacente que también está recubierto previamente sobre la superficie de captura. El principal inconveniente de este método son los pasos de preparación adicionales y tediosos al comienzo del proceso: (1) la clonación de ADNc en un vector listo para la expresión ; y (2) la necesidad de biotinilar el ADN plasmídico pero no interferir con la transcripción. Además, la matriz de proteínas resultante no es "pura" porque las proteínas están co-localizadas con sus plantillas de ADN y anticuerpos de captura. [3]
A diferencia de NAPPA, PISA [5] evita por completo la inmovilización del ADN, ya que la plantilla de ADN se agrega como una molécula libre en la mezcla de reacción. En 2006, otro grupo perfeccionó y miniaturizó este método utilizando la técnica de múltiples puntos para detectar la plantilla de ADN y la mezcla de transcripción y traducción libre de células en una micromatriz de proteínas de alta densidad con hasta 13 000 puntos. [6] Esto fue posible gracias al sistema automatizado utilizado para suministrar de manera precisa y secuencial los reactivos para que la reacción de transcripción/traducción ocurra en una pequeña gota subnanométrica.
Este método es una adaptación de la tecnología de visualización de ARNm . El ADN de PCR se transcribe primero a ARNm , y luego se hibrida un oligonucleótido de ADN monocatenario modificado con biotina y puromicina en cada extremo con el extremo 3' del ARNm. Luego, los ARNm se disponen en un portaobjetos y se inmovilizan mediante la unión de biotina a estreptavidina que está recubierta previamente en el portaobjetos. Luego, el extracto celular se dispensa en el portaobjetos para que se lleve a cabo la traducción in situ . Cuando el ribosoma alcanza el oligonucleótido hibridado, se detiene e incorpora la molécula de puromicina a la cadena polipeptídica naciente , uniendo así la proteína recién sintetizada al microarreglo a través del oligonucleótido de ADN. [7] Se obtiene un arreglo de proteína pura después de que el ARNm se digiere con ARNasa . Los puntos de proteína generados por este método están muy bien definidos y se pueden producir a alta densidad.
Los formatos de matriz de nanopocillos se utilizan para expresar proteínas individuales en recipientes de reacción de pequeño volumen o nanopocillos [8] [9] (Figura 4). Este formato a veces se prefiere porque evita la necesidad de inmovilizar la proteína objetivo, lo que podría resultar en la posible pérdida de actividad proteica. La miniaturización de la matriz también conserva la solución y los compuestos valiosos que podrían usarse en ensayos de detección. Además, las propiedades estructurales de los pocillos individuales ayudan a prevenir la contaminación cruzada entre cámaras. En 2012 se publicó un NAPPA mejorado, que utilizó una matriz de nanopocillos para prevenir la difusión. Aquí, el ADN se inmovilizó en el pocillo junto con un anticuerpo anti-GST. Luego, se agregó una mezcla de expresión libre de células y los pocillos se cerraron con una tapa. Las proteínas nacientes que contenían una etiqueta GST se unieron a la superficie del pocillo, lo que permitió una matriz NAPPA con mayor densidad y casi sin contaminaciones cruzadas. [10]
El método DAPA (DNA array to protein array) es un método desarrollado en 2007 para producir repetidamente matrices de proteínas "imprimiéndolas" a partir de una única matriz de plantillas de ADN, según demanda [11] (Figura 5). Comienza con la colocación e inmovilización de una matriz de plantillas de ADN sobre un portaobjetos de vidrio. A continuación, se ensambla el portaobjetos cara a cara con un segundo portaobjetos recubierto previamente con un reactivo de captura de proteínas y se coloca una membrana empapada con extracto celular entre los dos portaobjetos para que se produzca la transcripción y la traducción. A continuación, las proteínas marcadas con histidinas recién sintetizadas se inmovilizan sobre el portaobjetos para formar la matriz. En la publicación, en 18 de 20 réplicas, se podría generar una copia de micromatriz de proteínas. Potencialmente, el proceso se puede repetir tantas veces como sea necesario, siempre que el ADN no resulte dañado por las ADNasas, la degradación o la abrasión mecánica.
Muchas de las ventajas de la tecnología de matrices de proteínas libres de células abordan las limitaciones del sistema de expresión basado en células utilizado en los métodos tradicionales de producción de micromatrices de proteínas.
El método evita la clonación de ADN (con excepción de NAPPA) y permite convertir rápidamente la información genética en proteínas funcionales mediante el uso de ADN PCR. La reducción de pasos en la producción y la capacidad de miniaturizar el sistema permiten ahorrar en el consumo de reactivos y reducir los costos de producción.
Muchas proteínas, incluidos los anticuerpos, son difíciles de expresar en las células huésped debido a problemas de insolubilidad, enlaces disulfuro o toxicidad para las células huésped. [1] La matriz de proteínas libre de células hace que muchas de estas proteínas estén disponibles para su uso en microarreglos de proteínas.
A diferencia del ADN, que es una molécula muy estable, las proteínas son una clase heterogénea de moléculas con diferentes propiedades fisicoquímicas y de estabilidad. Mantener el plegamiento y la función de las proteínas en un estado inmovilizado durante largos períodos de almacenamiento es un gran desafío para los microarrays de proteínas. Los métodos sin células brindan la opción de obtener rápidamente microarrays de proteínas a pedido, eliminando así los problemas asociados con el almacenamiento a largo plazo.
El método se puede utilizar con una variedad de plantillas diferentes: productos de PCR, plásmidos y ARNm. Se pueden incluir componentes adicionales durante la síntesis para ajustar el entorno para el plegamiento de proteínas, la formación de enlaces disulfuro, la modificación o la actividad de las proteínas. [3]
Interacciones de proteínas: para detectar interacciones proteína-proteína [4] e interacciones de proteínas con otras moléculas como metabolitos , lípidos , ADN y moléculas pequeñas; [14] ensayo de inhibición enzimática: [8] para la detección de fármacos candidatos de alto rendimiento y para descubrir nuevas enzimas para su uso en biotecnología ; detección de especificidad de anticuerpos. [15]
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