Un microarreglo de anticuerpos (también conocido como matriz de anticuerpos ) es una forma específica de microarreglo de proteínas . En esta tecnología, una colección de anticuerpos capturados se colocan y se fijan en una superficie sólida como vidrio, plástico, membrana o chip de silicio, y se detecta la interacción entre el anticuerpo y su antígeno objetivo. Los microarreglos de anticuerpos se utilizan a menudo para detectar la expresión de proteínas de varios biofluidos, incluidos suero, plasma y lisados de células o tejidos. Los arreglos de anticuerpos se pueden utilizar tanto para investigación básica como para aplicaciones médicas y de diagnóstico. [1] [2] [3] [4]
El concepto y la metodología de los microarrays de anticuerpos fueron introducidos por primera vez por Tse Wen Chang en 1983 en una publicación científica [5] y una serie de patentes, [6] [7] [8] cuando trabajaba en Centocor en Malvern, Pensilvania . Chang acuñó el término "matriz de anticuerpos" y analizó la disposición en "array" de diminutos puntos de anticuerpos sobre pequeñas superficies de vidrio o plástico. Demostró que una cuadrícula de 10×10 (100 en total) y 20×20 (400 en total) de puntos de anticuerpos se podía colocar en una superficie de 1×1 cm. También estimó que si un anticuerpo se recubre a una concentración de 10 μg/mL, que es óptima para la mayoría de los anticuerpos, 1 mg de anticuerpo puede formar 2.000.000 de puntos de 0,25 mm de diámetro. La invención de Chang se centró en el empleo de microarreglos de anticuerpos para la detección y cuantificación de células portadoras de ciertos antígenos de superficie, como antígenos CD y antígenos alotípicos HLA , antígenos particulados, como virus y bacterias, y antígenos solubles. El principio de "una aplicación de muestra, múltiples determinaciones", la configuración del ensayo y la mecánica para colocar puntos absorbentes descritos en el artículo y las patentes deberían ser de aplicación general a diferentes tipos de microarreglos . Cuando Tse Wen Chang y Nancy T. Chang estaban creando Tanox , Inc. en Houston, Texas en 1986, compraron los derechos de las patentes de la matriz de anticuerpos de Centocor como parte de la base tecnológica para construir su nueva empresa. Su primer producto en desarrollo fue un ensayo, denominado "citometría inmunoabsorbente", [9] que podría emplearse para controlar el estado inmunológico, es decir, las concentraciones y proporciones de células T CD3 + , CD4 + y CD8 + , en la sangre de individuos infectados por VIH .
El fundamento teórico de los ensayos de unión de ligandos basados en microarrays de proteínas fue desarrollado por Roger Ekins y colegas a fines de la década de 1980. [10] [11] [12] Según el modelo, los microarrays de anticuerpos no solo permitirían la detección simultánea de un panel de analitos, sino que también serían más sensibles y rápidos que los métodos de detección convencionales. El interés en la detección de grandes conjuntos de proteínas solo surgió como resultado de los logros en genómica de los microarrays de ADN y el Proyecto Genoma Humano .
Los primeros métodos de matriz intentaron miniaturizar los ensayos bioquímicos e inmunobiológicos que se suelen realizar en placas de microtitulación de 96 pocillos. Si bien las matrices de anticuerpos basadas en placas de 96 pocillos tienen una capacidad de alto rendimiento, la pequeña superficie de cada pocillo limita la cantidad de puntos de anticuerpos y, por lo tanto, la cantidad de analitos detectados. Posteriormente, se utilizaron otros soportes sólidos, como portaobjetos de vidrio y membranas de nitrocelulosa, para desarrollar matrices que pudieran albergar paneles más grandes de anticuerpos. [13] Las matrices basadas en membranas de nitrocelulosa son flexibles, fáciles de manipular y tienen una mayor capacidad de unión a proteínas, pero son menos aptas para un alto rendimiento o un procesamiento automatizado. Los portaobjetos de vidrio derivatizados químicamente permiten la impresión de puntos de anticuerpos de tamaño submicrolitro, lo que reduce el área de superficie de la matriz sin sacrificar la densidad de puntos. Esto, a su vez, reduce el volumen de muestra consumido. Las matrices basadas en portaobjetos de vidrio, debido a su estructura lisa y rígida, también se pueden adaptar fácilmente a sistemas de manipulación de líquidos de alto rendimiento.
La mayoría de los sistemas de matriz de anticuerpos emplean uno de dos métodos no competitivos de inmunodetección: detección con un solo anticuerpo (basada en una etiqueta) y detección con dos anticuerpos (basada en un sándwich). Este último método, en el que la detección del analito requiere la unión de dos anticuerpos distintos (un anticuerpo de captura y un anticuerpo reportero, cada uno de los cuales se une a un epítopo único), confiere mayor especificidad y menor señal de fondo en comparación con la inmunodetección basada en etiquetas (donde solo se utiliza un anticuerpo de captura y la detección se logra mediante el etiquetado químico de todas las proteínas en la muestra inicial). Las matrices de anticuerpos basadas en sándwich generalmente alcanzan la mayor especificidad y sensibilidad (niveles de ng – pg) de cualquier formato de matriz; su reproducibilidad también permite realizar análisis cuantitativos. [14] [15] Debido a la dificultad de desarrollar pares de anticuerpos coincidentes que sean compatibles con todos los demás anticuerpos en el panel, las matrices pequeñas a menudo utilizan un enfoque de sándwich. Por el contrario, las matrices de alta densidad son más fáciles de desarrollar a un menor costo utilizando el enfoque basado en una etiqueta de anticuerpo único. En esta metodología, se utiliza un conjunto de anticuerpos específicos y todas las proteínas de una muestra se marcan directamente mediante colorantes fluorescentes o haptenos.
Los usos iniciales de los sistemas de matriz basados en anticuerpos incluyeron la detección de IgG y subclases específicas, [16] [17] el análisis de antígenos, [18] la detección de anticuerpos recombinantes , [19] [20] el estudio de las proteínas quinasas de levadura, [21] el análisis de anticuerpos autoinmunes, [22] y el examen de las interacciones proteína-proteína. [23] [24] [25] El primer enfoque para detectar simultáneamente múltiples citocinas de muestras fisiológicas utilizando la tecnología de matriz de anticuerpos fue realizado por Ruo-Pan Huang y colegas en 2001. [26] Su enfoque utilizó membranas Hybond ECL para detectar un pequeño panel de 24 citocinas de medios acondicionados de cultivo celular y sueros de pacientes y pudo perfilar la expresión de citocinas a niveles fisiológicos. Huang tomó esta tecnología y comenzó un nuevo negocio, RayBiotech, Inc., el primero en comercializar con éxito una matriz de anticuerpos planar.
En los últimos diez años, la sensibilidad del método se ha mejorado mediante una optimización de la química de la superficie, así como mediante protocolos dedicados a su etiquetado químico. [27] Actualmente, la sensibilidad de las matrices de anticuerpos es comparable a la de la prueba ELISA [28] [29] y las matrices de anticuerpos se utilizan regularmente para realizar experimentos de elaboración de perfiles en muestras de tejido, muestras de plasma o suero y muchos otros tipos de muestras. Un objetivo principal de los estudios de elaboración de perfiles basados en matrices de anticuerpos es el descubrimiento de biomarcadores, específicamente para el cáncer. [30] [31] [32] [33] [34] Para la investigación relacionada con el cáncer, en 2010 se informó del desarrollo y la aplicación de una matriz de anticuerpos que comprende 810 anticuerpos diferentes relacionados con el cáncer. [35] También en 2010, se utilizó una matriz de anticuerpos que comprende 507 citocinas, quimiocinas, adipocinas, factores de crecimiento, factores angiogénicos, proteasas, receptores solubles, moléculas de adhesión solubles y otras proteínas para examinar el suero de pacientes con cáncer de ovario e individuos sanos y se encontró una diferencia significativa en la expresión de proteínas entre muestras normales y cancerosas. [36] Más recientemente, las matrices de anticuerpos han ayudado a determinar proteínas séricas específicas relacionadas con la alergia cuyos niveles están asociados con el glioma y pueden reducir el riesgo años antes del diagnóstico. [37] El perfil de proteínas con matrices de anticuerpos también ha demostrado ser exitoso en áreas distintas de la investigación del cáncer, específicamente en enfermedades neurológicas como el Alzheimer. Varios estudios han intentado identificar paneles de biomarcadores que puedan distinguir a los pacientes con Alzheimer, y muchos han utilizado matrices de anticuerpos en este proceso. Jaeger y sus colegas midieron casi 600 proteínas circulantes para descubrir las vías y redes biológicas afectadas en el Alzheimer y exploraron las relaciones positivas y negativas de los niveles de esas proteínas y redes individuales con el rendimiento cognitivo de los pacientes con Alzheimer. [38] Actualmente, la matriz de anticuerpos basada en sándwich más grande disponible comercialmente detecta 1000 proteínas diferentes. [39] Además, existen servicios de perfil de proteínas basados en microarrays de anticuerpos que analizan la abundancia de proteínas y el estado de fosforilación o ubiquitinilación de proteínas de 1030 proteínas en paralelo. [40]
Las matrices de anticuerpos se utilizan a menudo para detectar la expresión de proteínas de muchos tipos de muestras, pero también en aquellas con varias preparaciones. Jiang y sus colegas ilustraron muy bien la correlación entre la expresión de proteínas de la matriz en dos preparaciones de sangre diferentes: suero y manchas de sangre seca. [41] Estas diferentes preparaciones de muestras de sangre se analizaron utilizando tres plataformas de matriz de anticuerpos: basada en sándwich, cuantitativa y basada en etiquetas, y se encontró una fuerte correlación en la expresión de proteínas, lo que sugiere que las manchas de sangre seca, que son un medio más conveniente, seguro y económico de obtener sangre, especialmente en áreas de salud pública no hospitalizadas, se pueden usar de manera efectiva con el análisis de matriz de anticuerpos para el descubrimiento de biomarcadores, el perfil de proteínas y la detección, el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades.
El uso de microarrays de anticuerpos en diferentes áreas de diagnóstico médico ha atraído la atención de los investigadores. El bioensayo digital es un ejemplo de tales dominios de investigación. En esta tecnología, una serie de micropocillos en un chip de vidrio/polímero se siembran con perlas magnéticas (recubiertas con anticuerpos marcados con fluorescencia), se someten a antígenos específicos y luego se caracterizan mediante un microscopio mediante el recuento de pocillos fluorescentes. Recientemente se ha demostrado una plataforma de fabricación rentable (que utiliza polímeros OSTE ) para tales matrices de micropocillos y el sistema modelo de bioensayo se ha caracterizado con éxito. [42] Además, los inmunoensayos en andamios de micropilares de "papel sintético" de tiol-eno han demostrado generar una señal de fluorescencia superior. [43]
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