Los anticuerpos recombinantes son fragmentos de anticuerpos producidos mediante el uso de genes codificantes de anticuerpos recombinantes . [1] En su mayoría consisten en una cadena pesada y ligera de la región variable de la inmunoglobulina . Los anticuerpos recombinantes tienen muchas ventajas tanto en aplicaciones médicas como de investigación, lo que los convierte en un tema popular de exploración y nueva producción contra objetivos específicos. La forma más comúnmente utilizada es el fragmento variable de cadena única (scFv), que ha mostrado los rasgos más prometedores explotables en medicina e investigación humana. [2] A diferencia de los anticuerpos monoclonales producidos mediante tecnología de hibridoma , que pueden perder la capacidad de producir el anticuerpo deseado con el tiempo o el anticuerpo puede sufrir cambios no deseados que afectan su funcionalidad, los anticuerpos recombinantes producidos en presentación en fagos mantienen un alto nivel de especificidad y baja inmunogenicidad . [3] [4]
Existen varios formatos conocidos de anticuerpos recombinantes que se producen comúnmente. Estos son los anticuerpos recombinantes Fab , scFv y diacuerpos. [4] [5] [3] Cada uno de los formatos tiene un potencial ligeramente diferente en aplicaciones y puede usarse en diversos campos de investigación, así como en medicina humana y animal. [6] Otra posibilidad investigada es el desarrollo de anticuerpos antiidiotípicos . Los anticuerpos antiidiotípicos se unen a un paratopo de otro anticuerpo específico. Por lo tanto, puede usarse para medir la presencia de anticuerpos y cargas de fármaco en el suero de los pacientes . [7] En función de su especificidad de unión se pueden distinguir 3 tipos de anticuerpos antiidiotípicos, que se superponen parcialmente con los formatos mencionados anteriormente: los clásicos, un grupo que incluye anticuerpos fragmento Fab, anticuerpos que se unen a idiotopos fuera del sitio de unión del fármaco y anticuerpos, que sólo se unen al complejo ya ensamblado del fármaco unido al objetivo. [7] Los más utilizados son los scFv, los fragmentos Fab y los anticuerpos biespecíficos.
scFv es el más pequeño de los formatos de anticuerpos recombinantes, que es capaz de unirse al antígeno . [8] Tienen un peso molecular de aproximadamente 27 kDa. [9] Están formados por la cadena ligera y pesada de la región variable de una inmunoglobulina. Las dos cadenas están unidas por un conector peptídico flexible . [2] El conector peptídico flexible generalmente consiste en una repetición de secuencia corta . La secuencia está formada por cuatro glicinas y una serina [5] y sirve para estabilizar el fragmento. [8] [10] La funcionalidad puede mejorarse mediante modificaciones químicas específicas del sitio, agregando una etiqueta peptídica o mediante fusión con un gen para lograr la producción de anticuerpos recombinantes bifuncionales. [9] Es importante establecer la actividad vinculante para garantizar una buena funcionalidad del producto. Para determinar la actividad de unión, se realiza de forma rutinaria un ensayo ELISA . [11]
Los fragmentos estructuralmente Fab constan de dos conjuntos de componentes variables y constantes, que crean dos cadenas de polipéptidos. Juntos forman una estructura estable. [5] Como miembro de los anticuerpos antiidiotípicos, los anticuerpos recombinantes del fragmento Fab se unen directamente al parátopo del anticuerpo objetivo. Eso significa que compiten con el fármaco por el sitio de unión y tienen una función inhibidora. Los anticuerpos de fragmentos Fab se pueden utilizar para la detección de fármacos no unidos o libres en el suero. [7] Los anticuerpos Fab también se han utilizado para evitar los efectos adversos causados por la unión inespecífica de la porción Fc del anticuerpo, que falta en el fragmento Fab. [5] En caso de que la inmunoglobulina IgG fuera más adecuada para el tratamiento o alguna otra aplicación particular, también se llevaron a cabo experimentos en los que los fragmentos Fab recombinantes se convirtieron en forma de IgG recombinante. Esta posibilidad amplía aún más el conjunto de posibles estructuras objetivo. [12]
Junto a los fragmentos scFv y Fab, los diacuerpos o anticuerpos recombinantes biespecíficos son el tercer formato principal. [5] Los anticuerpos biespecíficos combinan dos especificidades de unión a antígeno diferentes dentro de una molécula. [10] Los anticuerpos biespecíficos se utilizan para entrecruzar las moléculas diana con dos células diferentes y mediar en la citotoxicidad directa . [13] [14]
La producción de anticuerpos recombinantes sigue un flujo de trabajo básicamente similar. Consiste en determinar la secuencia del producto deseado seguido del refinamiento del codón , luego la síntesis del gen y la generación del constructo. Una vez que la construcción se entrega al laboratorio, se producen las construcciones de expresión, luego se transfieren a un cultivo celular en el proceso llamado transfección y una vez que el cultivo celular produce el anticuerpo recombinante deseado, se recolecta, purifica y analiza regularmente o se usa para más experimentación. Para la producción de anticuerpos recombinantes se utilizan líneas celulares estables como CHO y HEK293. [4] Las optimizaciones de los cultivos de células de mamíferos han llevado a aumentar el rendimiento de anticuerpos de líneas celulares HEK293 o CHO a más de 12 g/litro. [15] En las fases iniciales de la producción de anticuerpos recombinantes era importante lograr el ensamblaje de un fragmento Fv funcional en Escherichia coli . El pliegue correcto es esencial para la funcionalidad del anticuerpo. [16] El segundo requisito previo esencial para la producción moderna de scFv fue el ensamblaje exitoso de anticuerpos recombinantes a partir de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas. [17] Estos dos experimentos permitieron un mayor desarrollo y refinamiento de los anticuerpos recombinantes hasta su forma moderna. El proceso de producción in vitro actual elimina la necesidad de animales de laboratorio. El uso de una biblioteca de Ab humana o sintética, a diferencia de la inmunización de animales y la posterior generación de líneas celulares de hibridoma estables, requiere menos recursos y produce menos desechos, lo que hace que todo el proceso sea más sostenible. [18]
Los anticuerpos monoclonales son esenciales para muchas terapias que se aplican hoy en día en la medicina humana. La primera tecnología exitosa que fue sólida y condujo a una producción estable de los anticuerpos deseados fue la tecnología de hibridoma . Las líneas celulares de hibridoma, que producían grandes cantidades de anticuerpos relativamente puros y predecibles, se introdujeron por primera vez en 1975. [19] Desde entonces, se han utilizado para diversos fines, desde aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas hasta aplicaciones de investigación. A pesar de su papel indiscutible en los descubrimientos científicos y numerosas estrategias de tratamiento, la tecnología del hibridoma presenta a los investigadores algunos obstáculos, como cuestiones éticas, la posibilidad de perder la expresión de la proteína objetivo o una producción prolongada y, lo más importante, el desarrollo de HAMA en pacientes, como se mencionó anteriormente. [4] [20] Por lo tanto, es necesario utilizar diferentes métodos para complementar o incluso reemplazar parcialmente el hibridoma. Los hibridomas siguen siendo una parte esencial de la generación de anticuerpos recombinantes, ya que todavía se utilizan para producir anticuerpos monoclonales, a partir de los cuales los fragmentos Fab, scFv o anticuerpos fusionados somáticamente crean un anticuerpo biespecífico. [5]
La tecnología más comúnmente aplicada para producir anticuerpos recombinantes en el laboratorio hoy en día es la presentación en fagos . [2] [9] [10] [11] [21] [22] La presentación en fagos es un método en el que el anticuerpo recombinante diana se produce en la superficie de un bacteriófago . Esto permite una rápida producción de anticuerpos recombinantes y una fácil manipulación en condiciones de laboratorio. Tanto los anticuerpos recombinantes scFv como los fragmentos Fab se producen de forma rutinaria utilizando la presentación en fagos del anticuerpo. [10] De todos los posibles sistemas de presentación de fagos, el más común es Escherichia coli , debido a su rápido crecimiento y tasa de división y su instalación y mantenimiento económicos. [20]
Se han descrito dos estrategias principales para diseñar los fragmentos scFv. El primero es el llamado enfoque no colineal. Funciona según el principio de heterodimerización de dos cadenas. El enfoque no colineal conduce a la producción de diacuerpos y anticuerpos recombinantes, que combinan dos especificidades. El segundo enfoque se llama colineal y describe el proceso de fusión de dos scFv diferentes con una proteína biológicamente activa. [5]
Los anticuerpos recombinantes cumplen un amplio espectro de funciones que van desde la investigación hasta el diagnóstico y el tratamiento de diversas enfermedades. Su especificidad y baja inmunogenicidad los convierten en una excelente alternativa a las formas tradicionales de tratamiento, ya que aumentan la precisión para atacar moléculas específicas y evitar efectos secundarios adversos.
Los anticuerpos recombinantes se han explorado como tratamiento para el cáncer , [23] VIH , [24] virus del herpes simple (VHS) [22] y más. Los ScFv han sido parte del enfoque terapéutico altamente prometedor de la tecnología de receptores de antígenos quiméricos universales (uniCAR), que muestra resultados prometedores. Los scFv forman parte de la tecnología en forma de módulos diana, que dirigen la respuesta inmune a células cancerosas específicas, expresando el antígeno diana. [23] [25] [26] En el caso de la investigación sobre el tratamiento del VIH, los anticuerpos recombinantes se utilizan más bien por su cualidad neutralizante . [24] Lo mismo ocurre con la infección por HSV. Los anticuerpos recombinantes específicos están diseñados para unirse al proteoglicano de sulfato de heparina (HSP) de la superficie , lo que complica o incluso desactiva la entrada del HSV en la célula huésped. Este es un método que disminuye significativamente la gravedad de la infección por HSV. [22]
Como se mencionó al principio de esta sección, los anticuerpos recombinantes también se pueden utilizar en el diagnóstico; un ejemplo de dicha aplicación diagnóstica es la detección del virus de la rabia . [3] [20] [27] Dado que los anticuerpos de diagnóstico actuales no son tan precisos como sería deseable, los anticuerpos recombinantes ofrecen una alternativa prometedora. En el caso de la infección por rabia, que sólo es tratable poco después de la exposición, un diagnóstico exacto y preciso es vital para la supervivencia del paciente. En comparación con los anticuerpos producidos comercialmente y comúnmente disponibles, los anticuerpos recombinantes son más baratos de producir y más precisos para determinar la infección. Otra ventaja del anticuerpo recombinante es la posible aplicación como anticuerpo neutralizante como parte del tratamiento posterior. [20]
El potencial de los anticuerpos recombinantes en la medicina humana y animal es inmenso, como lo demuestran incluso los pocos ejemplos seleccionados. Como se mencionó anteriormente, los anticuerpos recombinantes y especialmente aquellos que se han desarrollado en presentación en fagos son altamente específicos, tienen una gran farmacocinética y podrían usarse en una amplia gama de tratamientos. Sin embargo, es importante darse cuenta de que no se espera ni se desea que los anticuerpos recombinantes creados en la presentación en fagos reemplacen completamente la producción de anticuerpos del hibridoma sino que la complementen. [4]
Los anticuerpos recombinantes aportan muchas ventajas con su aplicación en medicina e investigación humana. El primero es la eliminación total de las cuestiones éticas porque no hay necesidad de inmunizar a los animales . El cultivo de células CHO para la expresión de anticuerpos recombinantes es una estrategia popular para los productores de anticuerpos, ya que la estructura celular es similar a la del cuerpo humano. Gracias a su tamaño, que es menor que el anticuerpo completo y particularmente de 2000 nm, [28] pero no menor de 8 nm [29], se eliminan del organismo con facilidad y de manera oportuna, a través de la vía renal, que es la autorización deseada. [28] [29] Otra gran ventaja es su monovalencia , lo que significa que son altamente específicos y se unen a un único antígeno. Los investigadores han logrado producir anticuerpos que no tienen otra actividad que la unión al antígeno. [9] Dado que los anticuerpos recombinantes tienen una secuencia definida, son más fiables y reproducibles. [4] En combinación con su pequeño tamaño, se puede aprovechar la gran especificidad para administrar un fármaco altamente específico a un sitio específico precisamente porque el pequeño tamaño predispone a los anticuerpos recombinantes a penetrar los tejidos más fácilmente. Se ha informado que los anticuerpos recombinantes penetran el tejido tumoral mejor que las inmunoglobulinas IgG de longitud completa. [30] El tamaño pequeño también contribuye a una mejor biodistribución en el paciente. [1] En comparación con los anticuerpos derivados de líneas celulares de hibridoma, los anticuerpos recombinantes no causan inmunogenicidad, el infame anticuerpo humano anti-ratón (HAMA). [4] [21] Otras ventajas son los anticuerpos recombinantes afucosilados , que se utilizan con éxito en la lucha contra el cáncer. [31]
Estas fueron las principales ventajas para su uso en pacientes. Sin embargo, el uso de anticuerpos recombinantes también es ventajoso durante su producción en comparación con los anticuerpos monoclonales tradicionales derivados de líneas celulares de hibridoma. La producción es mucho más rápida y tenemos un mejor control sobre el proceso que con la tecnología de hibridoma. Además, los anticuerpos recombinantes pueden diseñarse prácticamente contra cualquier antígeno, del tamaño y forma adecuados, pero no se limitan únicamente a la naturaleza peptídica de un antígeno. Los anticuerpos recombinantes también pueden usarse en forma fusionada con fármacos y/o toxinas, que pueden explotarse aún más en aplicaciones médicas. Por último, pero no menos importante, una de sus ventajas durante la producción es la posibilidad de optimizar y diseñar genéticamente los anticuerpos recombinantes en función de la demanda actual del paciente o investigador. [4] Se requiere un técnico experimentado para realizar la visualización de fagos y, en tercer lugar, es casi inevitable incluir empresas subcontratadas en el proceso de síntesis de genes y generación de construcciones. [1] [4] Sin embargo, en una comparación sistemática de anticuerpos derivados de animales versus anticuerpos recombinantes derivados de presentación en fagos utilizados para aplicaciones de investigación y diagnóstico, el Laboratorio de Referencia de la UE para Alternativas a los Experimentos con Animales (EURL ECVAM) emitió una recomendación a favor de no -anticuerpos derivados de animales en mayo de 2020, [32] basado principalmente en el hecho de que, a diferencia de los anticuerpos derivados de animales, los anticuerpos recombinantes son siempre reactivos proteicos de secuencia definida, lo que permite eliminar algunos de los problemas de calidad atribuidos a los anticuerpos de investigación actuales cuando se fabrican en animales. . [33] [34]