En biología molecular , [1] [2] [3] la replicación del ADN es el proceso biológico de producir dos réplicas idénticas de ADN a partir de una molécula de ADN original . [4] La replicación del ADN ocurre en todos los organismos vivos y actúa como la parte más esencial de la herencia biológica . Esto es esencial para la división celular durante el crecimiento y la reparación de los tejidos dañados, al mismo tiempo que garantiza que cada una de las nuevas células reciba su propia copia del ADN. [5] La célula posee la propiedad distintiva de división, lo que hace que la replicación del ADN sea esencial.
El ADN está formado por una doble hélice de dos hebras complementarias . La doble hélice describe la apariencia de un ADN bicatenario que, por lo tanto, se compone de dos cadenas lineales que discurren una frente a la otra y se retuercen entre sí para formar. [6] Durante la replicación, estas hebras se separan. Cada hebra de la molécula de ADN original sirve como plantilla para la producción de su contraparte, un proceso conocido como replicación semiconservativa . Como resultado de la replicación semiconservadora, la nueva hélice estará compuesta por una cadena de ADN original y una cadena recién sintetizada. [7] Los mecanismos de corrección celular y verificación de errores garantizan una fidelidad casi perfecta para la replicación del ADN. [8] [9]
En una célula , la replicación del ADN comienza en lugares específicos u orígenes de replicación , [10] en el genoma [11] que contiene el material genético de un organismo. [12] El desenrollado del ADN en el origen y la síntesis de nuevas hebras, acomodados por una enzima conocida como helicasa , da como resultado horquillas de replicación que crecen bidireccionalmente desde el origen. Varias proteínas están asociadas con la horquilla de replicación para ayudar en el inicio y la continuación de la síntesis de ADN . Lo más destacado es que la ADN polimerasa sintetiza las nuevas cadenas agregando nucleótidos que complementan cada cadena (modelo). La replicación del ADN ocurre durante la etapa S de la interfase . [13]
La replicación del ADN (amplificación del ADN) también se puede realizar in vitro (artificialmente, fuera de una célula). [14] Las ADN polimerasas aisladas de células y cebadores de ADN artificiales se pueden utilizar para iniciar la síntesis de ADN en secuencias conocidas en una molécula de ADN molde. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR) y la amplificación mediada por transcripción (TMA) son ejemplos. En marzo de 2021, los investigadores presentaron evidencia que sugiere que una forma preliminar de ARN de transferencia , un componente necesario de la traducción , la síntesis biológica de nuevas proteínas de acuerdo con el código genético , podría haber sido una molécula replicadora en sí misma en el desarrollo temprano de la vida. o abiogénesis . [15] [16]
El ADN existe como una estructura bicatenaria, con ambas hebras enrolladas entre sí para formar la característica doble hélice . Cada hebra de ADN es una cadena de cuatro tipos de nucleótidos . Los nucleótidos del ADN contienen un azúcar desoxirribosa , un fosfato y una nucleobase . Los cuatro tipos de nucleótidos corresponden a las cuatro nucleobases adenina , citosina , guanina y timina , comúnmente abreviadas como A, C, G y T. La adenina y la guanina son bases pu [17] rina , mientras que la citosina y la timina son pirimidinas . Estos nucleótidos forman enlaces fosfodiéster , creando la columna vertebral de fosfato-desoxirribosa de la doble hélice del ADN con las nucleobases apuntando hacia adentro (es decir, hacia la hebra opuesta). Las nucleobases se unen entre hebras mediante enlaces de hidrógeno para formar pares de bases . La adenina se empareja con timina (dos enlaces de hidrógeno) y la guanina se empareja con citosina (tres enlaces de hidrógeno ). [18]
Las cadenas de ADN tienen una direccionalidad , y los diferentes extremos de una sola cadena se denominan "extremo 3' (tres primos)" y "extremo 5' (cinco primos)". Por convención, si se proporciona la secuencia de bases de una sola cadena de ADN, el extremo izquierdo de la secuencia es el extremo 5', mientras que el extremo derecho de la secuencia es el extremo 3'. Las hebras de la doble hélice son antiparalelas, una de ellas de 5' a 3' y la hebra opuesta de 3' a 5'. Estos términos se refieren al átomo de carbono de la desoxirribosa al que se une el siguiente fosfato de la cadena. La direccionalidad tiene consecuencias en la síntesis de ADN, porque la ADN polimerasa puede sintetizar ADN en una sola dirección agregando nucleótidos al extremo 3' de una cadena de ADN.
El emparejamiento de bases complementarias en el ADN (mediante enlaces de hidrógeno ) significa que la información contenida dentro de cada hebra es redundante. Los enlaces fosfodiéster (dentro de las cadenas) son más fuertes que los enlaces de hidrógeno (entre las cadenas). El trabajo real de los enlaces fosfodiéster es donde en los polímeros del ADN se conecta el átomo de carbono 5' de un nucleótido con el átomo de carbono 3' de otro nucleótido, mientras que los enlaces de hidrógeno estabilizan las dobles hélices del ADN a lo largo del eje de la hélice, pero no en la dirección de la misma. eje. [19] Esto hace posible separar los hilos entre sí. Por tanto, los nucleótidos de una única cadena se pueden utilizar para reconstruir nucleótidos de una cadena asociada recién sintetizada. [20]
Las ADN polimerasas son una familia de enzimas que llevan a cabo todas las formas de replicación del ADN. [22] Las ADN polimerasas en general no pueden iniciar la síntesis de nuevas cadenas, sino que solo pueden extender una cadena de ADN o ARN existente emparejada con una cadena plantilla. Para comenzar la síntesis, se debe crear un fragmento corto de ARN, llamado cebador , y emparejarlo con la cadena de ADN molde.
La ADN polimerasa agrega una nueva cadena de ADN al extender el extremo 3' de una cadena de nucleótidos existente, agregando nuevos nucleótidos que coinciden con la cadena plantilla, uno a la vez, mediante la creación de enlaces fosfodiéster . La energía para este proceso de polimerización del ADN proviene de la hidrólisis de los enlaces fosfato (fosfoanhídrido) de alta energía entre los tres fosfatos unidos a cada base no incorporada . Las bases libres con sus grupos fosfato unidos se denominan nucleótidos ; en particular, las bases con tres grupos fosfato unidos se denominan trifosfatos de nucleósidos . Cuando se agrega un nucleótido a una cadena de ADN en crecimiento, la formación de un enlace fosfodiéster entre el fosfato proximal del nucleótido a la cadena en crecimiento va acompañada de la hidrólisis de un enlace fosfato de alta energía con liberación de los dos grupos fosfato distales como una pirofosfato . La hidrólisis enzimática del pirofosfato resultante en fosfato inorgánico consume un segundo enlace fosfato de alta energía y hace que la reacción sea efectivamente irreversible. [Nota 1]
En general, las ADN polimerasas son muy precisas, con una tasa de error intrínseco de menos de un error por cada 10 7 nucleótidos añadidos. [23] Algunas ADN polimerasas también pueden eliminar nucleótidos del extremo de una cadena en desarrollo para reparar bases no coincidentes. Esto se conoce como revisión. Finalmente, los mecanismos de reparación de errores de coincidencia posteriores a la replicación monitorean el ADN en busca de errores, siendo capaces de distinguir errores de coincidencia en la cadena de ADN recién sintetizada de la secuencia de la cadena original. En conjunto, estos tres pasos de discriminación permiten una fidelidad de replicación de menos de un error por cada 10 9 nucleótidos agregados. [23]
La tasa de replicación del ADN en una célula viva se midió por primera vez como la tasa de elongación del ADN del fago T4 en E. coli infectada con fagos . [24] Durante el período de aumento exponencial del ADN a 37 °C, la velocidad fue de 749 nucleótidos por segundo. La tasa de mutación por par de bases por replicación durante la síntesis de ADN del fago T4 es de 1,7 por 10 8 . [25]
La replicación del ADN, como todos los procesos de polimerización biológica, se produce en tres pasos coordinados y catalizados enzimáticamente: iniciación, elongación y terminación.
Para que una célula se divida , primero debe replicar su ADN. [26] La replicación del ADN es un proceso de todo o nada; Una vez que comienza la replicación, continúa hasta su finalización. Una vez que se completa la replicación, no vuelve a ocurrir en el mismo ciclo celular. Esto es posible gracias a la división de iniciación del complejo previo a la replicación .
En la mitosis tardía y en la fase G1 temprana , un gran complejo de proteínas iniciadoras se ensambla en el complejo previo a la replicación en puntos particulares del ADN, conocidos como " orígenes ". [11] [10] En E. coli la proteína iniciadora primaria es el ADN A ; en la levadura , este es el complejo de reconocimiento del origen . [27] Las secuencias utilizadas por las proteínas iniciadoras tienden a ser "ricas en AT" (ricas en bases de adenina y timina), porque los pares de bases AT tienen dos enlaces de hidrógeno (en lugar de los tres formados en un par CG) y, por lo tanto, son más fáciles de hebrar. -separado. [28] En eucariotas, el complejo de reconocimiento del origen cataliza el ensamblaje de proteínas iniciadoras en el complejo previo a la replicación. Además, un informe reciente sugiere que la ORC de levadura en ciernes se dimeriza de manera dependiente del ciclo celular para controlar la concesión de licencias. [29] [30] A su vez, el proceso de dimerización de ORC está mediado por un ciclo de dimerización de Noc3p dependiente del ciclo celular in vivo, y esta función de Noc3p es separable de su función en la biogénesis de ribosomas. Un ciclo de dimerización esencial de Noc3p media la formación de doble hexámero de ORC en la licencia de replicación. ORC y Noc3p se unen continuamente a la cromatina durante todo el ciclo celular. [31] Cdc6 y Cdt1 luego se asocian con el complejo de reconocimiento de origen unido en el origen para formar un complejo más grande necesario para cargar el complejo Mcm en el ADN. En eucariotas, el complejo Mcm es la helicasa que dividirá la hélice del ADN en las bifurcaciones y orígenes de replicación. El complejo Mcm se recluta en la fase G1 tardía y el complejo ORC-Cdc6-Cdt1 lo carga en el ADN mediante la remodelación de proteínas dependiente de ATP. La carga del complejo Mcm en el ADN de origen marca la finalización de la formación del complejo previo a la replicación. [32]
Si las condiciones ambientales son adecuadas en la fase G1 tardía, se activan los complejos G1 y ciclina G1/S - Cdk , que estimulan la expresión de genes que codifican componentes de la maquinaria sintética del ADN. La activación de G1/S-Cdk también promueve la expresión y activación de complejos S-Cdk, que pueden desempeñar un papel en la activación de los orígenes de replicación según la especie y el tipo de célula. El control de estas Cdks varía según el tipo de célula y la etapa de desarrollo. Esta regulación se comprende mejor en la levadura en ciernes , donde las ciclinas S Clb5 y Clb6 son las principales responsables de la replicación del ADN. [33] Los complejos Clb5,6-Cdk1 desencadenan directamente la activación de los orígenes de replicación y, por lo tanto, son necesarios durante toda la fase S para activar directamente cada origen. [32]
De manera similar, también se requiere Cdc7 a través de la fase S para activar los orígenes de replicación. Cdc7 no está activo durante todo el ciclo celular y su activación está estrictamente programada para evitar el inicio prematuro de la replicación del ADN. En G1 tardío, la actividad de Cdc7 aumenta abruptamente como resultado de la asociación con la subunidad reguladora DBF4 , que se une a Cdc7 directamente y promueve su actividad de proteína quinasa. Se ha descubierto que Cdc7 es un regulador limitante de la actividad de origen. Juntos, G1/S-Cdks y/o S-Cdks y Cdc7 colaboran para activar directamente los orígenes de replicación, lo que lleva al inicio de la síntesis de ADN. [32]
En la fase S temprana, la activación de S-Cdk y Cdc7 conduce al ensamblaje del complejo de preiniciación, un complejo proteico masivo formado en el origen. La formación del complejo de preiniciación desplaza a Cdc6 y Cdt1 del complejo de replicación de origen, inactivando y desensamblando el complejo de pre-replicación. La carga del complejo de preiniciación en el origen activa la helicasa Mcm, lo que provoca el desenrollamiento de la hélice del ADN. El complejo de preiniciación también carga α-primasa y otras ADN polimerasas en el ADN. [32]
Después de que la α-primasa sintetiza los primeros cebadores, las uniones cebador-plantilla interactúan con el cargador de abrazadera, que carga la abrazadera deslizante en el ADN para comenzar la síntesis de ADN. Los componentes del complejo de preiniciación permanecen asociados con horquillas de replicación a medida que salen del origen. [32]
La ADN polimerasa tiene actividad 5′-3′. Todos los sistemas de replicación de ADN conocidos requieren un grupo hidroxilo 3' libre antes de que se pueda iniciar la síntesis (nota: la plantilla de ADN se lee en la dirección 3' a 5', mientras que una nueva cadena se sintetiza en la dirección 5' a 3'; esto suele ocurrir). confundido). Se reconocen cuatro mecanismos distintos para la síntesis de ADN:
Los organismos celulares utilizan la primera de estas vías por ser la más conocida. En este mecanismo, una vez que se separan las dos cadenas, la primasa agrega cebadores de ARN a las cadenas molde. La cadena principal recibe un cebador de ARN, mientras que la cadena retrasada recibe varios. La cadena principal se extiende continuamente desde el cebador mediante una ADN polimerasa con alta procesividad , mientras que la cadena retrasada se extiende discontinuamente desde cada cebador formando fragmentos de Okazaki . La RNasa elimina los fragmentos de ARN del cebador y una ADN polimerasa de baja procesividad distinta de la polimerasa replicativa ingresa para llenar los espacios. Cuando se completa esto, se puede encontrar una sola muesca en la hebra principal y varias muescas en la hebra retrasada. La ligasa trabaja para rellenar estas muescas, completando así la molécula de ADN recién replicada.
La primasa utilizada en este proceso difiere significativamente entre bacterias y arqueas / eucariotas . Las bacterias utilizan una primasa que pertenece a la superfamilia de proteínas DnaG que contiene un dominio catalítico del tipo plegado TOPRIM. [34] El pliegue TOPRIM contiene un núcleo α/β con cuatro hebras conservadas en una topología similar a Rossmann . Esta estructura también se encuentra en los dominios catalíticos de la topoisomerasa Ia, la topoisomerasa II, las nucleasas de la familia OLD y las proteínas reparadoras del ADN relacionadas con la proteína RecR.
La primasa utilizada por arqueas y eucariotas, por el contrario, contiene una versión altamente derivada del motivo de reconocimiento de ARN (RRM). Esta primasa es estructuralmente similar a muchas ARN polimerasas virales dependientes de ARN, transcriptasas inversas, ciclasas generadoras de nucleótidos cíclicos y ADN polimerasas de las familias A/B/Y que participan en la replicación y reparación del ADN. En la replicación eucariota, la primasa forma un complejo con Pol α. [35]
Múltiples ADN polimerasas asumen diferentes funciones en el proceso de replicación del ADN. En E. coli , DNA Pol III es la enzima polimerasa principal responsable de la replicación del ADN. Se ensambla en un complejo de replicación en la bifurcación de replicación que exhibe una procesividad extremadamente alta y permanece intacto durante todo el ciclo de replicación. Por el contrario, DNA Pol I es la enzima responsable de reemplazar los cebadores de ARN por ADN. DNA Pol I tiene una actividad exonucleasa de 5′ a 3′ además de su actividad polimerasa, y utiliza su actividad exonucleasa para degradar los cebadores de ARN que se encuentran delante de él mientras extiende la cadena de ADN detrás de él, en un proceso llamado traducción de mella . Pol I es mucho menos procesivo que Pol III porque su función principal en la replicación del ADN es crear muchas regiones cortas de ADN en lugar de unas pocas regiones muy largas.
En eucariotas , la enzima de baja procesividad, Pol α, ayuda a iniciar la replicación porque forma un complejo con primasa. [36] En eucariotas, se cree que la síntesis de la cadena principal la realiza Pol ε; sin embargo, esta opinión ha sido cuestionada recientemente, lo que sugiere un papel para Pol δ. [37] La eliminación del cebador se completa con Pol δ [38] , mientras que Pol ε completa la reparación del ADN durante la replicación.
A medida que continúa la síntesis de ADN, las hebras de ADN originales continúan desenrollándose a cada lado de la burbuja, formando una horquilla de replicación con dos puntas. En las bacterias, que tienen un único origen de replicación en su cromosoma circular, este proceso crea una " estructura theta " (que se asemeja a la letra griega theta: θ). Por el contrario, los eucariotas tienen cromosomas lineales más largos e inician la replicación en múltiples orígenes dentro de estos. [39]
La horquilla de replicación es una estructura que se forma dentro del ADN helicoidal largo durante la replicación del ADN. Es producido por enzimas llamadas helicasas que rompen los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las cadenas de ADN en una hélice. La estructura resultante tiene dos "puntas" ramificadas, cada una formada por una sola hebra de ADN. Estas dos hebras sirven como plantilla para las hebras delantera y trasera, que se crearán a medida que la ADN polimerasa haga coincidir los nucleótidos complementarios con las plantillas; las plantillas pueden denominarse apropiadamente plantilla de hebra principal y plantilla de hebra retrasada.
La ADN polimerasa lee el ADN en la dirección 3' a 5', lo que significa que la nueva cadena se sintetiza en la dirección 5' a 3'. Dado que los moldes de las cadenas principal y rezagada están orientados en direcciones opuestas en la bifurcación de replicación, una cuestión importante es cómo lograr la síntesis de una nueva cadena rezagada de ADN, cuya dirección de síntesis es opuesta a la dirección de la bifurcación de replicación en crecimiento.
La cadena principal es la cadena de ADN nuevo que se sintetiza en la misma dirección que la horquilla de replicación en crecimiento. Este tipo de replicación del ADN es continua.
La hebra rezagada es la hebra de ADN nuevo cuya dirección de síntesis es opuesta a la dirección de la bifurcación de replicación en crecimiento. Debido a su orientación, la replicación de la cadena retrasada es más complicada en comparación con la de la cadena principal. Como consecuencia, se ve que la ADN polimerasa de esta cadena "se queda atrás" de la otra cadena.
La cadena retrasada se sintetiza en segmentos cortos y separados. En la plantilla de la cadena retrasada , una primasa "lee" el ADN plantilla e inicia la síntesis de un cebador de ARN complementario corto . Una ADN polimerasa extiende los segmentos cebados, formando fragmentos de Okazaki . Luego se eliminan los cebadores de ARN y se reemplazan con ADN, y los fragmentos de ADN se unen mediante la ADN ligasa .
En todos los casos, la helicasa está compuesta por seis polipéptidos que envuelven una sola hebra del ADN que se está replicando. Las dos polimerasas están unidas al heximero de helicasa. En los eucariotas, la helicasa se envuelve alrededor de la cadena principal y en los procariotas, alrededor de la cadena rezagada. [40]
A medida que la helicasa desenrolla el ADN en la bifurcación de replicación, el ADN que está delante se ve obligado a girar. Este proceso da como resultado una acumulación de giros en el ADN que se encuentra por delante. [41] Esta acumulación crea una carga de torsión que eventualmente detendría la horquilla de replicación. Las topoisomerasas son enzimas que rompen temporalmente las hebras de ADN, aliviando la tensión provocada por el desenrollamiento de las dos hebras de la hélice del ADN; Las topoisomerasas (incluida la ADN girasa ) logran esto agregando superenrollamientos negativos a la hélice del ADN. [42]
El ADN monocatenario desnudo tiende a plegarse sobre sí mismo formando estructuras secundarias ; estas estructuras pueden interferir con el movimiento de la ADN polimerasa. Para evitar esto, las proteínas de unión monocatenarias se unen al ADN hasta que se sintetiza una segunda cadena, evitando la formación de estructuras secundarias. [43]
El ADN bicatenario está enrollado alrededor de histonas que desempeñan un papel importante en la regulación de la expresión genética, por lo que el ADN replicado debe enrollarse alrededor de histonas en los mismos lugares que el ADN original. [44] Para garantizar esto, las chaperonas de histonas desmontan la cromatina antes de que se replique y reemplazan las histonas en el lugar correcto. Algunos pasos en este reensamblaje son algo especulativos. [45]
Las proteínas de sujeción actúan como una abrazadera deslizante en el ADN, lo que permite que la ADN polimerasa se una a su plantilla y ayude en la procesividad. La cara interior de la abrazadera permite pasar el ADN a través de ella. Una vez que la polimerasa llega al final de la plantilla o detecta ADN bicatenario, la abrazadera deslizante sufre un cambio conformacional que libera la ADN polimerasa. Las proteínas de carga de abrazadera se utilizan para cargar inicialmente la abrazadera, reconociendo la unión entre la plantilla y los cebadores de ARN. [9] :274-5
En la bifurcación de replicación, muchas enzimas de replicación se ensamblan en el ADN formando una compleja máquina molecular llamada replisoma . La siguiente es una lista de las principales enzimas de replicación del ADN que participan en el replisoma: [46]
Experimentos in vitro de una sola molécula (utilizando pinzas ópticas y pinzas magnéticas ) han encontrado interacciones sinérgicas entre las enzimas replisomas ( helicasa , polimerasa y proteína de unión al ADN monocatenario ) y con la horquilla de replicación del ADN que mejora el desenrollado y la replicación del ADN. . [14] Estos resultados conducen al desarrollo de modelos cinéticos que tienen en cuenta las interacciones sinérgicas y su estabilidad. [14]
Los mecanismos de replicación consisten en factores involucrados en la replicación del ADN y que aparecen en los ADNss molde. Las maquinarias de replicación incluyen primosotores y enzimas de replicación; ADN polimerasa, ADN helicasas, abrazaderas de ADN y ADN topoisomerasas, y proteínas de replicación; por ejemplo, proteínas de unión a ADN monocatenarias (SSB). En las maquinarias de replicación estos componentes se coordinan. En la mayoría de las bacterias, todos los factores implicados en la replicación del ADN se encuentran en las horquillas de replicación y los complejos permanecen en las horquillas durante la replicación del ADN. Las maquinarias de replicación también se conocen como replisomas o sistemas de replicación de ADN. Estos términos son términos genéricos para proteínas ubicadas en horquillas de replicación. En las células eucariotas y en algunas bacterias, los replisomas no se forman.
Dado que las maquinarias de replicación no se mueven en relación con los ADN molde, como las fábricas, se les llama fábrica de replicación . [48] En una figura alternativa, las fábricas de ADN son similares a proyectores y los ADN son como películas cinematográficas que pasan constantemente a los proyectores. En el modelo de fábrica de replicación, después de que ambas ADN helicasas para las cadenas principales y rezagadas se cargan en los ADN molde, las helicasas corren a lo largo de los ADN entre sí. Las helicasas permanecen asociadas durante el resto del proceso de replicación. Peter Meister et al. observaron directamente sitios de replicación en levaduras en ciernes mediante el monitoreo de las ADN polimerasas α marcadas con proteína fluorescente verde (GFP). Detectaron la replicación del ADN de pares de loci marcados espaciados simétricamente desde un origen de replicación y descubrieron que la distancia entre los pares disminuía notablemente con el tiempo. [49] Este hallazgo sugiere que el mecanismo de replicación del ADN va con las fábricas de ADN. Es decir, se cargan parejas de fábricas de replicación en los orígenes de replicación y las fábricas se asocian entre sí. Además, los ADN modelo ingresan a las fábricas, lo que provoca la extrusión de los ADN ss modelo y nuevos ADN. El hallazgo de Meister es la primera evidencia directa de la replicación del modelo de fábrica. Investigaciones posteriores han demostrado que las ADN helicasas forman dímeros en muchas células eucariotas y que las maquinarias de replicación bacteriana permanecen en una única ubicación intranuclear durante la síntesis de ADN. [48]
Las fábricas de replicación desenredan las cromátidas hermanas. El desenredo es esencial para distribuir las cromátidas en las células hijas después de la replicación del ADN. Debido a que las cromátidas hermanas después de la replicación del ADN se unen mediante anillos de Cohesina , existe la única posibilidad de que se desenreden en la replicación del ADN. La reparación de maquinarias de replicación como fábricas de replicación puede mejorar la tasa de éxito de la replicación del ADN. Si las horquillas de replicación se mueven libremente en los cromosomas, la catenación de los núcleos se agrava e impide la segregación mitótica. [49]
Los eucariotas inician la replicación del ADN en múltiples puntos del cromosoma, por lo que las horquillas de replicación se encuentran y terminan en muchos puntos del cromosoma. Debido a que los eucariotas tienen cromosomas lineales, la replicación del ADN no puede llegar al final de los cromosomas. Debido a este problema, el ADN se pierde en cada ciclo de replicación desde el final del cromosoma. Los telómeros son regiones de ADN repetitivo cercanas a los extremos y ayudan a prevenir la pérdida de genes debido a este acortamiento. El acortamiento de los telómeros es un proceso normal en las células somáticas . Esto acorta los telómeros del cromosoma de ADN hijo. Como resultado, las células sólo pueden dividirse un cierto número de veces antes de que la pérdida de ADN impida una mayor división. (Esto se conoce como límite de Hayflick ). Dentro de la línea de células germinales , que pasa el ADN a la siguiente generación, la telomerasa extiende las secuencias repetitivas de la región de los telómeros para evitar la degradación. La telomerasa puede volverse activa por error en las células somáticas, lo que a veces conduce a la formación de cáncer . El aumento de la actividad de la telomerasa es una de las características del cáncer.
La terminación requiere que el progreso de la bifurcación de replicación del ADN se detenga o se bloquee. La terminación en un locus específico, cuando ocurre, implica la interacción entre dos componentes: (1) una secuencia del sitio de terminación en el ADN y (2) una proteína que se une a esta secuencia para detener físicamente la replicación del ADN. En varias especies bacterianas, esto se denomina proteína de unión al sitio terminal de replicación del ADN o proteína Ter .
Debido a que las bacterias tienen cromosomas circulares, la terminación de la replicación ocurre cuando las dos horquillas de replicación se encuentran en el extremo opuesto del cromosoma parental. E. coli regula este proceso mediante el uso de secuencias de terminación que, cuando se unen a la proteína Tus , permiten que solo pase una dirección de la horquilla de replicación. Como resultado, las horquillas de replicación están obligadas a encontrarse siempre dentro de la región terminal del cromosoma. [50]
Dentro de los eucariotas, la replicación del ADN está controlada dentro del contexto del ciclo celular . A medida que la célula crece y se divide, avanza a través de etapas del ciclo celular; La replicación del ADN tiene lugar durante la fase S (fase de síntesis). El progreso de la célula eucariota a lo largo del ciclo está controlado por puntos de control del ciclo celular . La progresión a través de los puntos de control se controla mediante interacciones complejas entre varias proteínas, incluidas las ciclinas y las quinasas dependientes de ciclina . [51] A diferencia de las bacterias, el ADN eucariota se replica en los confines del núcleo. [52]
El punto de control G1/S (o punto de control de restricción) regula si las células eucariotas entran en el proceso de replicación del ADN y posterior división. Las células que no pasan por este punto de control permanecen en la etapa G0 y no replican su ADN.
Una vez que el ADN ha pasado por la prueba "G1/S", sólo se puede copiar una vez en cada ciclo celular. Cuando el complejo Mcm se aleja del origen, el complejo previo a la replicación se desmantela. Debido a que no se puede cargar un nuevo complejo de Mcm en un origen hasta que se reactiven las subunidades previas a la replicación, un origen de replicación no se puede usar dos veces en el mismo ciclo celular. [32]
La activación de S-Cdks en la fase S temprana promueve la destrucción o inhibición de componentes complejos individuales previos a la replicación, impidiendo el reensamblaje inmediato. S y M-Cdks continúan bloqueando el ensamblaje complejo previo a la replicación incluso después de que se completa la fase S, lo que garantiza que el ensamblaje no pueda ocurrir nuevamente hasta que toda la actividad de Cdk se reduzca en la mitosis tardía. [32]
En la levadura en ciernes, la inhibición del ensamblaje es causada por la fosforilación dependiente de Cdk de los componentes del complejo previo a la replicación. Al inicio de la fase S, la fosforilación de Cdc6 por Cdk1 provoca la unión de Cdc6 a la proteína ligasa ubiquitina SCF , lo que provoca la destrucción proteolítica de Cdc6. La fosforilación de proteínas Mcm dependiente de Cdk promueve su exportación fuera del núcleo junto con Cdt1 durante la fase S, evitando la carga de nuevos complejos de Mcm en los orígenes durante un ciclo celular único. La fosforilación de Cdk del complejo de replicación de origen también inhibe el ensamblaje del complejo previo a la replicación. La presencia individual de cualquiera de estos tres mecanismos es suficiente para inhibir el ensamblaje complejo previo a la replicación. Sin embargo, las mutaciones de las tres proteínas en la misma célula desencadenan el reinicio en muchos orígenes de replicación dentro de un ciclo celular. [32] [53]
En las células animales, la proteína geminina es un inhibidor clave del ensamblaje del complejo previo a la replicación. Geminin se une a Cdt1, impidiendo su unión al complejo de reconocimiento de origen. En G1, los niveles de geminina se mantienen bajos gracias al APC, que ubiquitina la geminina para atacarla y degradarla. Cuando se destruye la geminina, se libera Cdt1, lo que le permite funcionar en un ensamblaje complejo previo a la replicación. Al final de G1, la APC se inactiva, lo que permite que la geminina se acumule y se una a Cdt1. [32]
La replicación de los genomas de cloroplastos y mitocondriales se produce independientemente del ciclo celular, mediante el proceso de replicación del bucle D.
En las células de los vertebrados, los sitios de replicación se concentran en posiciones llamadas focos de replicación . [49] Los sitios de replicación se pueden detectar mediante inmunotinción de cadenas hijas y enzimas de replicación y monitoreando los factores de replicación etiquetados con GFP. Mediante estos métodos se descubre que en la fase S de la división celular aparecen focos de replicación de diferentes tamaños y posiciones y su número por núcleo es mucho menor que el número de horquillas de replicación genómica.
P. Heun et al. , [49] (2001) rastrearon focos de replicación etiquetados con GFP en células de levadura en ciernes y revelaron que los orígenes de replicación se mueven constantemente en las fases G1 y S y la dinámica disminuyó significativamente en la fase S. [49] Tradicionalmente, los sitios de replicación se fijaban en la estructura espacial de los cromosomas mediante una matriz nuclear o láminas . Los resultados de Heun niegan los conceptos tradicionales de que las levaduras en ciernes no tienen láminas y apoyan que los orígenes de replicación se autoensamblan y forman focos de replicación.
Mediante la activación de los orígenes de replicación, controlada espacial y temporalmente, se regula la formación de focos de replicación. DA Jackson et al. (1998) revelaron que los orígenes vecinos se activan simultáneamente en las células de los mamíferos. [49] La yuxtaposición espacial de sitios de replicación genera agrupamiento de bifurcaciones de replicación. La agrupación rescata las bifurcaciones de replicación estancadas y favorece el progreso normal de las bifurcaciones de replicación. El progreso de las bifurcaciones de replicación se ve inhibido por muchos factores; colisión con proteínas o con complejos que se unen fuertemente al ADN, deficiencia de dNTP, mellas en los ADN molde, etc. Si las bifurcaciones de replicación se atascan y el resto de las secuencias de las bifurcaciones atascadas no se copian, entonces las cadenas hijas obtienen sitios no replicados. Los sitios no replicados en la cadena de uno de los padres mantienen unida la otra cadena, pero no las cadenas hijas. Por lo tanto, las cromátidas hermanas resultantes no pueden separarse entre sí y no pueden dividirse en 2 células hijas. Cuando los orígenes vecinos se disparan y una bifurcación de un origen se detiene, la bifurcación de otro origen accede en una dirección opuesta a la bifurcación detenida y duplica los sitios no replicados. Como otro mecanismo de rescate existe la aplicación de orígenes de replicación latentes , de modo que el exceso de orígenes no se activa en la replicación normal del ADN.
La mayoría de las bacterias no pasan por un ciclo celular bien definido sino que copian continuamente su ADN; Durante el crecimiento rápido, esto puede resultar en la ocurrencia simultánea de múltiples rondas de replicación. [54] En E. coli , la bacteria mejor caracterizada, la replicación del ADN está regulada a través de varios mecanismos, que incluyen: la hemimetilación y el secuestro de la secuencia de origen, la proporción de trifosfato de adenosina (ATP) a difosfato de adenosina (ADP) , y la niveles de proteína ADNA. Todos estos controlan la unión de las proteínas iniciadoras a las secuencias de origen. [55]
Debido a que E. coli metila secuencias de ADN GATC, la síntesis de ADN da como resultado secuencias hemimetiladas. Este ADN hemimetilado es reconocido por la proteína SeqA , que se une y secuestra la secuencia origen; Además, el DnaA (necesario para el inicio de la replicación) se une menos bien al ADN hemimetilado. Como resultado, se impide que los orígenes recién replicados inicien inmediatamente otra ronda de replicación del ADN. [56]
El ATP se acumula cuando la célula está en un medio rico, lo que desencadena la replicación del ADN una vez que la célula ha alcanzado un tamaño específico. El ATP compite con el ADP para unirse al ADN, y el complejo ADN-ATP puede iniciar la replicación. También se requiere una cierta cantidad de proteínas DnaA para la replicación del ADN: cada vez que se copia el origen, la cantidad de sitios de unión para DnaA se duplica, lo que requiere la síntesis de más DnaA para permitir otro inicio de replicación.
En bacterias de rápido crecimiento, como E. coli , la replicación de los cromosomas lleva más tiempo que la división de la célula. Las bacterias resuelven esto iniciando una nueva ronda de replicación antes de que la anterior haya terminado. [57] La nueva ronda de replicación formará el cromosoma de la célula que nace dos generaciones después de la célula en división. Este mecanismo crea ciclos de replicación superpuestos.
Hay muchos eventos que contribuyen al estrés de replicación, entre ellos: [58]
Los investigadores suelen replicar el ADN in vitro mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR utiliza un par de cebadores para abarcar una región objetivo en el ADN molde y luego polimeriza las hebras asociadas en cada dirección a partir de estos cebadores usando una ADN polimerasa termoestable . La repetición de este proceso a través de múltiples ciclos amplifica la región de ADN objetivo. Al comienzo de cada ciclo, la mezcla de plantilla y cebadores se calienta, separando la molécula y la plantilla recién sintetizadas. Luego, a medida que la mezcla se enfría, ambos se convierten en plantillas para el recocido de nuevos cebadores, y la polimerasa se extiende a partir de ellos. Como resultado, el número de copias de la región objetivo se duplica en cada ronda, aumentando exponencialmente . [59]
