Esto es una desventaja cuando, por ejemplo, se está estudiando la variabilidad genética de un virus.
En general, la secuenciación del ADN mediante síntesis se lleva a cabo utilizando plataformas NGS disponibles comercialmente siguiendo los pasos que se enumeran a continuación.
A medida que el ritmo de las tecnologías NGS avanza rápidamente, las especificaciones técnicas y los precios cambian.
‡ Longitudes de lectura promedio para las plataformas Roche 454 y Helicos Biosciences.
[27][28][29] Los cebadores directo e inverso se unen covalentemente a alta densidad al portaobjetos en una celda de flujo.
La relación entre los cebadores y la plantilla sobre el soporte define la densidad superficial de los grupos amplificados.
La celda de flujo se expone a reactivos para la extensión basada en polimerasa, el cebado se produce cuando el extremo libre o distal de un fragmento ligado forma un "puente" con un oligonucleótido complementario en la superficie.
[1] [31] Las partes clave son muy similares para todas las realizaciones de SBS e incluyen: Se repiten los pasos 3 y 4 y se ensambla la secuencia a partir de las señales obtenidas en el paso 4.
En un artículo de seguimiento,[2]el concepto se desarrolló aún más y en 1998 se publicó un artículo en el que los autores mostraban que los nucleótidos no incorporados podían eliminarse con una cuarta enzima, la apirasa) que permitía la secuenciación por síntesis a realizarse sin necesidad de eliminar por lavado los nucleótidos no incorporados.
Los grupos de bloqueo 3' se concibieron originalmente como inversión enzimática o química.
[25][33][34] En este enfoque, la reacción de extensión de secuencia no se lleva a cabo mediante polimerasas, sino mediante ADN ligasa y sondas codificadas con una o dos bases.
En su forma más simple, una sonda marcada con fluorescencia se hibrida con su secuencia complementaria adyacente a la plantilla cebada.
Luego se agrega ADN ligasa para unir la sonda marcada con colorante al cebador.
El ciclo puede repetirse utilizando sondas escindibles para eliminar el colorante fluorescente y regenerar un grupo 5′-PO4 para ciclos de ligadura posteriores (ligación encadenada) o eliminando e hibridando un nuevo cebador con la plantilla (ligadura no encadenada).
[36][37] En 2015, Pacific Biosciences lanzó un nuevo instrumento de secuenciación llamado Sequel System, que aumenta la capacidad aproximadamente 6,5 veces.