Secuenciación de proteínas
Las proteínas con muchos grupos voluminosos e hidrofóbicos pueden requerir periodos de calentamiento mayores.
Sin embargo, estas condiciones son tan fuertes que algunos aminoácidos (serina, treonina, tirosina, triptófano, glutamina y cisteína) se degradan.
Para evitar este problema, se sugiere que se calienten muestras separadas durante diferentes tiempos, analizando cada disolución resultante y extrapolando a cero el tiempo de hidrólisis.
También se sugiere una variedad de reactivos para prevenir o reducir la degradación como tioles o fenoles para proteger el triptófano y la tirosina del ataque del cloruro, así como pre-oxidar la cisteína.
Los aminoácidos pueden ser separados por cromatografía de intercambio iónico[4] y después derivatizados para facilitar su detección.
Más comúnmente, los aminoácidos son derivatizados y después analizados por cromatografía de fase inversa.
Al añadir los aminoácidos en solución ácida y hacerlos pasar por un buffer que incremente poco a poco el pH, los aminoácidos son eluidos cuando el pH alcanza su respectivo punto isoeléctrico (pI).
La derivatización previa a la columna utiliza el reactivo de Edman para producir un derivado que es detectable por espectroscopía UV-visible.
Una mayor sensibilidad es lograda al utilizar un reactivo que genere derivados fluorescentes.
Todos reaccionan con grupos amino y por lo tanto pueden enlazarse con aminas en las cadenas laterales como las de la lisina, por esta razón, es necesario ser cuidadoso en la interpretación de los cromatogramas para asegurar que se ha elegido el aminoácido correcto.
Este método es muy útil en el caso de que los polipéptidos tengan el grupo N-terminal bloqueado.
Cada ciclo libera y derivatiza un aminoácido N-terminal de la proteína que es después identificado mediante HPLC.
