En 1504 Ayllón fue nombrado alcalde mayor el magistrado principal y oficial administrativo de Concepción (ahora Santo Domingo).

Ayllón se enfrentó a cargos de enriquecimiento injusto, pero aparentemente pudo defenderse con éxito sin perjudicar su carrera ni su riqueza.

[1]​ Mientras tanto, el rey Fernando estaba preocupado por su falta de control en las Indias y la creciente influencia del nuevo gobernador, Diego Colón.

Hizo que Ayllón y los demás jueces de la audiencia fueran suspendidos en 1517 e investigados por supuestos abusos.

Sin embargo, cuando Cisneros fue destituido de la regencia, la residencia se truncó y los jueces fueron restituidos en sus cargos en 1520.

La Audiencia Real de Santo Domingo estaba temerosa de que la disputa entre Cortés y Velázquez escalara, por lo que cuando se oyó que Velázquez preunía una expedición para arrestar a Cortés, la audiencia envió a Ayllón a Cuba para prohibirle tal acción y hacerle ver la impiedad de comenzar una guerra civil entre conquistadores.

Los informes de Vázquez tardaron en alcanzar la audiencia real, pero serían determinantes en los litigios entre Cortés y Velázquez.

El piloto, Francisco Gordillo, había sido contratado por Ayllón para dirigir una expedición esclavista a las Bahamas.

Más tarde ese mismo año viajó a España por negocios para la audiencia, pero aprovechó la oportunidad para defender personalmente su caso en favor de la nueva tierra.

Se le permitió establecer un asentamiento en la costa oriental y realizar comercio con los nativos locales.

Se le prohibió implementar una encomienda u otros medios de forzar el trabajo indígena.

[1]​ Antes de regresar a La Española, Ayllón fue enviado a Puerto Rico, donde había sido requerido para completar una serie de investigaciones y auditorías pendientes sobre funcionarios gubernamentales actuales y anteriores.

Contrató a Quexos para dirigir un viaje que constaba de dos carabelas y unos sesenta tripulantes.

No está claro cuánto más al norte viajó Quexos, tal vez hasta la bahía de Chesapeake.

Su barco más grande chocó contra un banco de arena y se hundió.

Ayllón buscó un sitio adecuado para establecer un asentamiento en la cercana isla Pawleys, pero el suelo era pobre y una población indígena escasa ofrecía pocas posibilidades de un comercio rentable.

Basándose en sus informes, Ayllón decidió trasladarse unas 200 millas al sur hasta un «río poderoso», probablemente Sapelo Sound en la actual Georgia.