El hermano materno de sir Humphrey, sir Walter Raleigh, obtuvo posteriormente la carta real entregada a su hermano por la reina Isabel I y más adelante llevó a cabo los detalles del documento mediante sus delegados Ralph Lane y Richard Grenville, el primo lejano de Raleigh.

Hasta hoy siguen sin hallarse pruebas definitivas sobre el destino final de los colonos.

Esta especificaba que Raleigh estaba obligado a establecer una colonia en Norteamérica o perdería su derecho de colonización.

Basándose en esta información, Raleigh organizó una segunda expedición, dirigida por sir Richard Grenville.

White fue elegido gobernador con posterioridad y Raleigh nombró a doce asistentes para ayudar en el asentamiento de Roanoke.

El comandante de la flota, Simão Fernandes, se negó entonces a permitir el regreso de los colonos a los barcos e insistió en que fundaran la nueva colonia en Roanoke.

Poco después un nativo mató al colono George Howe mientras este buscaba cangrejos en Albemarle Sound.

Cruzar el Atlántico en esa época del año significaba correr un riesgo considerable, como demuestra la afirmación de Fernandes, cuyo navío apenas pudo completar el viaje.

Los planes para enviar una flota de rescate tuvieron que ser aplazados por la negativa del capitán a volver durante el invierno.

Finalmente consiguió pasaje en una expedición corsaria que aceptó detenerse en Roanoke al volver del Caribe.

Irónicamente, el texto de Harriot no llegó a Inglaterra o a las imprentas del país hasta 1588, cuando ya se había producido el aciago destino de la "Colonia Perdida".

A pesar de ello Raleigh todavía esperaba sacar beneficio del viaje, y el barco de Mace tomó tierra en los Outer Banks para recolectar plantas aromáticas como sassafras que le reportaran unas ganancias aceptables al volver a Inglaterra.

Para cuando pudieron prestarle atención al asunto de los colonos, el tiempo había empeorado y se vieron forzados a volver sin ni siquiera llegar a la isla de Roanoke.

Pero del mismo modo que la guerra anglo-española impidió a White volver a tiempo, las autoridades españolas en el Nuevo Mundo no pudieron reunir el suficiente apoyo de la metrópoli para semejante empresa.

En su libro del año 2000, Roanoke: Solving the Mystery of the Lost Colony, la historiadora Lee Miller planteó que algunos de los supervivientes de la Colonia Perdida podrían haber buscado refugio con los chowanoke, quienes fueron atacados a su vez por otra tribu, identificada por la Colonia de Jamestown como los "mandoag" (palabra algonquina utilizada habitualmente para las naciones enemigas).

Se ha especulado que los mencionados "mandoag" pudieron ser los tuscarora, una tribu de lengua iroquesa, o los eno, también llamados wainoke.

El conocido como "Mapa de Zúñiga" (que recibió su nombre por Pedro de Zúñiga, embajador español en Inglaterra, quien se hizo con una copia y se la entregó a Felipe II), dibujado en torno a 1607 por el habitante de Jamestown Francis Nelson, otorga credibilidad a esta afirmación.

En el mapa se puede leer que "four men clothed that came from roonock" ("cuatro hombres vestidos provenientes de roonock") vivían en un poblado iroqués en el Neuse.

De hecho, cuando posteriores habitantes se encontraron por última vez con esos nativos, descubrieron que estos ya hablaban inglés y conocían el cristianismo.

Sin embargo no existen pruebas documentadas de una conexión entre los saponi y los colonos.

Además de todas estas posibilidades, Samuel A'Court Ashe estaba convencido de que los colonos se habían trasladado hacia el oeste a orillas del río Chowan del Condado de Bertie, y Conway Whittle Sams creía que tras haber sido atacados por los wanchese y los powhatan, los colonos se dispersaron por varios lugares: el río Chowan, y al sur de los ríos Pamlico y Neuse.

El historiador David Beers Quinn desarrolló la hipótesis de que la colonia se trasladó al completo y más adelante fue destruida.

Según parece el Jefe Powhatan mostró diversas herramientas de hierro inglesas para probar su afirmación, pero no se han encontrado ni cuerpos ni pruebas arqueológicas que apoyen esta teoría, y lo descubierto en la aldea chesepian ubicada en Great Neck Point, en lo que hoy es Virginia Beach, sugiere que la tribu chesepian estaba relacionada con los pamlico de Carolina en vez de con los powhatan.

Otra posibilidad es la de que los colonos simplemente se cansaran de esperar e intentaran volver a Inglaterra por sus propios medios y que perecieran en el intento.

Cuando el gobernador White se marchó en 1587 les dejó a los colonos una pinaza y algunos pequeñas embarcaciones para que exploraran la costa o para ayudar en el traslado de la colonia al continente.

Otra teoría estaría relacionada con la posibilidad de que los españoles hubieran destruido la colonia.

Estos fragmentos están hechos de papel contemporáneo con el del mapa.

Lane consultó a investigadores del Museo Británico de Londres, donde el mapa había permanecido desde 1866, qué podía hallarse bajo los fragmentos, lo que dio origen a una investigación conjunta.

Algunos estudiosos especulan sobre si los colonos se trasladaron a ese lugar, en lo que hoy se conoce como Salmon Creek en la comunidad de Merry Hill en el Condado de Bertie.

Entre los integrantes del reparto a lo largo del tiempo se cuentan Andy Griffith (que interpretó a sir Walter Raleigh), William Ivey Long, Chris Elliott, Terrence Mann y el corresponsal de The Daily Show Dan Bakkedahl.