Tomó posesión de la silla arzobispal en 1553 y gobernó hasta su muerte, durante 16 años continuos.

Se le dio licencia para pasar a Santa Marta cuatro esclavos para su servicio personal y doce criados, algunos de los cuales servirían como sacristanes.

Como aún no se ordenaba obispo y tuvo problemas para hacerlo en Puerto Rico o en Cuba, emprendió viaje hacia Riohacha, pero al parecer, se levantaron los indios Buriticá, que solían ser pacíficos, y Fray Juan tuvo que regresar prematuramente a Santa Marta, teniendo como alternativas ser dispensado o hacer el juramento en Popayán.

La tasación que hizo de los nacidos en el Nuevo Reino, para librarlos de la tiranía y extorsión en que los tenían muchos encomenderos, despertó en los colonos y en algunas justicias reales, una reacción muy contraria hacia él.

Esta colisión de autoridades, alimentada por el patronato regio, ensombreció la acción propiamente espiritual del prelado.

En 1553 comenzaron la construcción los albañiles Pedro Vásquez y Baltasar Díaz, en el lugar en que hoy se encuentra la Catedral Primada de Bogotá.

En 1556, tres años después de iniciar la construcción, las paredes ya se estaban fisurando, pero la obra continuó.

El mismo día,solo, con su hábito religioso, se fue a la cantera, que estaba apartada de la ciudad y trajo sobre sus hombros la primera piedra, a cuyo ejemplo los clérigos, los religiosos y todos los vecinos estuvieron cargando piedra por muchos días".

Durante su estadía en Santafé, De Los Barrios hizo varias solicitudes para volver a España, pero no le fueron concedidas.