Estudió matemáticas durante 1564 en la Universidad de Padua, donde se hizo amigo del gran poeta italiano Torquato Tasso.Estudió matemáticas con Federico Commandino durante este período y se convirtió en uno de sus discípulos más fieles.Galileo, entonces un joven de 26 años, prometedor pero desempleado, había escrito un ensayo sobre el equilibrio hidrostático, que sorprendió a Guidobaldo por su genialidad.Guidobaldo escribió un influyente libro sobre la perspectiva, titulado Perspectivae Libri VI, publicado en Pésaro en 1600.Varios pintores, arquitectos y el escenógrafo teatral Nicola Sabbatini utilizaron este conocimiento geométrico en sus obras.
