Los trabajos se iniciaron en 1963, y los aviones permanecieron en servicio hasta 1976, volando principalmente para Sandia, el Laboratorio Nacional de Los Álamos, y el Laboratorio Nacional Lawrence Livermore.

Volando conjuntamente con otros aviones científicos, uno de los NC-135 se las arregló para volar enteramente en eclipse durante 160 segundos, proporcionando valiosos datos científicos.

[7]​[8]​ Un avión, número de serie 61-2666, ha sido modificado como NC-135W para probar equipos y sistemas usados en los aviones de reconocimiento RC-135V y W Rivet Joint.

[9]​[10]​ De 1975 a 1984, los Estados Unidos usaron un NKC-135 en su programa Airborne Laser Lab.

Sin embargo, la amenaza SCUD encarada durante la guerra del Golfo reavivó el interés en un sistema láser aerotransportado, resultando en el Boeing YAL-1.