La cinética de enzimas

Estudio de velocidades de reacciones bioquímicas catalizadas por una enzima.

Dihidrofolato reductasa de E. coli con sus dos sustratos dihidrofolato (derecha) y NADPH (izquierda), unidos en el sitio activo. La proteína se muestra como un diagrama de cinta , con hélices alfa en rojo, vainas beta en amarillo y bucles en azul. ( APD : 7DFR ​)

La cinética enzimática es el estudio de las velocidades de reacciones químicas catalizadas por enzimas . En cinética enzimática, se mide la velocidad de reacción y se investigan los efectos de variar las condiciones de la reacción. Estudiar la cinética de una enzima de esta manera puede revelar el mecanismo catalítico de esta enzima, su papel en el metabolismo , cómo se controla su actividad y cómo un fármaco o un modificador ( inhibidor o activador ) podría afectar la velocidad.

Una enzima (E) es una molécula de proteína que sirve como catalizador biológico para facilitar y acelerar una reacción química en el cuerpo. Lo hace mediante la unión de otra molécula, su sustrato (S), sobre el que actúa la enzima para formar el producto deseado. El sustrato se une al sitio activo de la enzima para producir un complejo enzima-sustrato ES, y se transforma en un complejo enzima-producto EP y de allí al producto P, a través de un estado de transición ES*. La serie de pasos se conoce como mecanismo :

E + S ⇄ ES ⇄ ES* ⇄ EP ⇄ E + P

Este ejemplo supone el caso más simple de una reacción con un sustrato y un producto. Existen casos tales: por ejemplo, una mutasa como la fosfoglucomutasa cataliza la transferencia de un grupo fosfo de una posición a otra, e isomerasa es un término más general para una enzima que cataliza cualquier reacción de un solo sustrato y un solo producto, como la triosafosfato isomerasa. . Sin embargo, estas enzimas no son muy comunes y son muy superadas en número por las enzimas que catalizan reacciones de dos sustratos y dos productos: estas incluyen, por ejemplo, las deshidrogenasas dependientes de NAD, como la alcohol deshidrogenasa , que cataliza la oxidación del etanol por NAD ^+. . Las reacciones con tres o cuatro sustratos o productos son menos comunes, pero existen. No es necesario que el número de productos sea igual al número de sustratos; por ejemplo, la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa tiene tres sustratos y dos productos.

Cuando las enzimas se unen a múltiples sustratos, como la dihidrofolato reductasa (que se muestra a la derecha), la cinética enzimática también puede mostrar la secuencia en la que se unen estos sustratos y la secuencia en la que se liberan los productos. Un ejemplo de enzimas que se unen a un único sustrato y liberan múltiples productos son las proteasas , que escinden un sustrato proteico en dos productos polipeptídicos. Otros unen dos sustratos, como la ADN polimerasa que une un nucleótido al ADN . Aunque estos mecanismos suelen ser una serie compleja de pasos, normalmente hay un paso que determina la velocidad y que determina la cinética general. Este paso determinante de la velocidad puede ser una reacción química o un cambio conformacional de la enzima o de los sustratos, como los implicados en la liberación de producto(s) de la enzima.

El conocimiento de la estructura de la enzima es útil para interpretar los datos cinéticos. Por ejemplo, la estructura puede sugerir cómo se unen los sustratos y productos durante la catálisis; qué cambios ocurren durante la reacción; e incluso el papel de residuos de aminoácidos particulares en el mecanismo. Algunas enzimas cambian significativamente de forma durante el mecanismo; en tales casos, es útil determinar la estructura de la enzima con y sin análogos de sustrato unidos que no sufren la reacción enzimática.

No todos los catalizadores biológicos son enzimas proteicas: los catalizadores basados ​​en ARN , como las ribozimas y los ribosomas , son esenciales para muchas funciones celulares, como el empalme y la traducción del ARN . La principal diferencia entre ribozimas y enzimas es que los catalizadores de ARN están compuestos de nucleótidos, mientras que las enzimas están compuestas de aminoácidos. Las ribozimas también realizan un conjunto más limitado de reacciones, aunque sus mecanismos de reacción y cinética pueden analizarse y clasificarse mediante los mismos métodos.

Principios generales

A medida que se añaden mayores cantidades de sustrato a una reacción, los sitios de unión de enzimas disponibles se llenan hasta el límite de . Más allá de este límite, la enzima se satura con sustrato y la velocidad de reacción deja de aumentar. ${\displaystyle V_{\max }}$

La reacción catalizada por una enzima utiliza exactamente los mismos reactivos y produce exactamente los mismos productos que la reacción no catalizada. Al igual que otros catalizadores , las enzimas no alteran la posición de equilibrio entre sustratos y productos. ^[1] Sin embargo, a diferencia de las reacciones químicas no catalizadas, las reacciones catalizadas por enzimas muestran una cinética de saturación. Para una concentración de enzima determinada y para concentraciones de sustrato relativamente bajas, la velocidad de reacción aumenta linealmente con la concentración de sustrato; las moléculas de enzima son en gran medida libres para catalizar la reacción, y una mayor concentración de sustrato significa una velocidad cada vez mayor a la que la enzima y las moléculas de sustrato se encuentran entre sí. Sin embargo, a concentraciones de sustrato relativamente altas, la velocidad de reacción se acerca asintóticamente al máximo teórico; Casi todos los sitios activos de la enzima están ocupados por sustratos, lo que produce saturación, y la velocidad de reacción está determinada por la tasa de recambio intrínseco de la enzima. ^{[2] La} _{concentración} de sustrato a medio camino entre estos dos casos limitantes se denota por KM . Por tanto, KM es la concentración _de sustrato a la que la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. ^[2]

Las dos propiedades importantes de la cinética enzimática son la facilidad con la que la enzima puede saturarse con un sustrato y la velocidad máxima que puede alcanzar. Conocer estas propiedades sugiere lo que una enzima podría hacer en la célula y puede mostrar cómo responderá la enzima a los cambios en estas condiciones.

Ensayos enzimáticos

Curva de progreso de una reacción enzimática. La pendiente en el período de velocidad inicial es la velocidad de reacción inicial v . La ecuación de Michaelis-Menten describe cómo esta pendiente varía con la concentración de sustrato.

Los ensayos enzimáticos son procedimientos de laboratorio que miden la velocidad de las reacciones enzimáticas. Dado que las enzimas no son consumidas por las reacciones que catalizan, los ensayos enzimáticos generalmente siguen cambios en la concentración de sustratos o productos para medir la velocidad de reacción. Hay muchos métodos de medición. Los ensayos espectrofotométricos observan el cambio en la absorbancia de la luz entre productos y reactivos; Los ensayos radiométricos implican la incorporación o liberación de radiactividad para medir la cantidad de producto elaborado a lo largo del tiempo. Los ensayos espectrofotométricos son los más convenientes ya que permiten medir continuamente la velocidad de la reacción. Aunque los ensayos radiométricos requieren la extracción y el recuento de muestras (es decir, son ensayos discontinuos), suelen ser extremadamente sensibles y pueden medir niveles muy bajos de actividad enzimática. ^[3] Un enfoque análogo es utilizar espectrometría de masas para monitorear la incorporación o liberación de isótopos estables a medida que el sustrato se convierte en producto. En ocasiones, un ensayo falla y los enfoques son esenciales para resucitar un ensayo fallido.

Los ensayos enzimáticos más sensibles utilizan láseres enfocados a través de un microscopio para observar cambios en moléculas de enzimas individuales a medida que catalizan sus reacciones. Estas mediciones utilizan cambios en la fluorescencia de los cofactores durante el mecanismo de reacción de una enzima o tintes fluorescentes agregados en sitios específicos de la proteína para informar los movimientos que ocurren durante la catálisis. ^[4] Estos estudios proporcionan una nueva visión de la cinética y la dinámica de enzimas individuales, a diferencia de la cinética enzimática tradicional, que observa el comportamiento promedio de poblaciones de millones de moléculas de enzimas. ^{[5] [6]}

Arriba se muestra un ejemplo de curva de progreso para un ensayo enzimático. La enzima produce un producto a una velocidad inicial aproximadamente lineal durante un corto período después del inicio de la reacción. A medida que avanza la reacción y se consume el sustrato, la velocidad disminuye continuamente (siempre que el sustrato no esté todavía en niveles de saturación). Para medir la velocidad inicial (y máxima), los ensayos enzimáticos generalmente se llevan a cabo mientras la reacción ha progresado solo un pequeño porcentaje hasta su finalización total. La duración del período de velocidad inicial depende de las condiciones del ensayo y puede variar desde milisegundos hasta horas. Sin embargo, los equipos para mezclar líquidos rápidamente permiten mediciones cinéticas rápidas a velocidades iniciales de menos de un segundo. ^[7] Estos ensayos muy rápidos son esenciales para medir la cinética previa al estado estacionario, que se analizan a continuación.

La mayoría de los estudios de cinética enzimática se concentran en esta parte inicial, aproximadamente lineal, de las reacciones enzimáticas. Sin embargo, también es posible medir la curva de reacción completa y ajustar estos datos a una ecuación de velocidad no lineal . Esta forma de medir las reacciones enzimáticas se denomina análisis de curva de progreso. ^[8] Este enfoque es útil como alternativa a la cinética rápida cuando la velocidad inicial es demasiado rápida para medirla con precisión.

Las pautas de Estándares para informar datos enzimológicos brindan la información mínima requerida para informar de manera integral datos cinéticos y de equilibrio de investigaciones de actividades enzimáticas, incluidas las condiciones experimentales correspondientes. Las directrices se han desarrollado para informar datos sobre enzimas funcionales con rigor y solidez.

Reacciones de sustrato único

Las enzimas con mecanismos de sustrato único incluyen isomerasas como la triosafosfatoisomerasa o la bifosfoglicerato mutasa , liasas intramoleculares como la adenilato ciclasa y la ribozima cabeza de martillo , una ARN liasa. ^[9] Sin embargo, algunas enzimas que solo tienen un sustrato no entran en esta categoría de mecanismos. La catalasa es un ejemplo de esto, ya que la enzima reacciona con una primera molécula de sustrato de peróxido de hidrógeno , se oxida y luego se reduce con una segunda molécula de sustrato. Aunque interviene un solo sustrato, la existencia de una enzima intermedia modificada significa que el mecanismo de la catalasa es en realidad un mecanismo de ping-pong, un tipo de mecanismo que se analiza en la sección Reacciones con múltiples sustratos a continuación.

Cinética de Michaelis-Menten

Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, su velocidad de catálisis no muestra una respuesta lineal al aumento del sustrato. Si la velocidad inicial de la reacción se mide en un rango de concentraciones de sustrato (indicadas como [S]), la velocidad de reacción inicial ( ) aumenta a medida que aumenta [S], como se muestra a la derecha. Sin embargo, a medida que [S] aumenta, la enzima se satura con sustrato y la velocidad inicial alcanza Vmax , la velocidad máxima _de la enzima. ${\displaystyle v_{0}}$

A la derecha se muestra el modelo cinético de Michaelis-Menten de una reacción de sustrato único . Hay una reacción bimolecular inicial entre la enzima E y el sustrato S para formar el complejo enzima-sustrato ES. La velocidad de la reacción enzimática aumenta con el aumento de la concentración del sustrato hasta un cierto nivel llamado _Vmax ; en Vmax _, el aumento en la concentración del sustrato no causa ningún aumento en la velocidad de reacción ya que no hay más enzima (E) disponible para reaccionar con el sustrato (S). Aquí, la velocidad de reacción depende del complejo ES y la reacción se convierte en una reacción unimolecular de orden cero. Aunque el mecanismo enzimático para la reacción unimolecular puede ser bastante complejo, normalmente hay un paso enzimático determinante de la velocidad que permite modelar esta reacción como un paso catalítico único con una constante de velocidad unimolecular _aparente kcat . Si la ruta de reacción transcurre a través de uno o varios intermedios, k _cat será una función de varias constantes de velocidad elementales, mientras que en el caso más simple de una sola reacción elemental (por ejemplo, sin intermedios) será idéntica a la constante de velocidad unimolecular elemental k ₂ . La constante de velocidad unimolecular aparente kcat también se denomina número de recambio y denota el número máximo de reacciones enzimáticas catalizadas por segundo _. ${\displaystyle {\ce {ES ->[k_{cat}] E + P}}}$

La ecuación de Michaelis-Menten ^[10] describe cómo la velocidad de reacción (inicial) v ₀ depende de la posición del equilibrio de unión del sustrato y la constante de velocidad k ₂ .

${\displaystyle v_{0}={\frac {V_{\max }[{\ce {S}}]}{K_{M}+[{\ce {S}}]}}}$    (Ecuación de Michaelis-Menten)

con las constantes

${\displaystyle {\begin{aligned}K_{M}\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{2}+k_{-1}}{k_{1}}}\approx K_{D}\\V_{\max }\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ k_{cat}{\ce {[E]}}_{tot}\end{aligned}}}$

Esta ecuación de Michaelis-Menten es la base de la mayoría de las cinéticas enzimáticas de sustrato único. Dos suposiciones cruciales subyacen a esta ecuación (aparte de la suposición general acerca de que el mecanismo no implica inhibición intermedia o de producto, y no hay alostericidad ni cooperatividad ). La primera suposición es la llamada hipótesis del estado casi estacionario (o hipótesis del estado pseudoestable), es decir, que la concentración de la enzima unida al sustrato (y por tanto también de la enzima no unida) cambia mucho más lentamente que las del producto y sustrato y, por lo tanto, el cambio en el tiempo del complejo se puede establecer en cero . La segunda suposición es que la concentración total de enzimas no cambia con el tiempo, por lo tanto . Puede encontrar una derivación completa aquí . ${\displaystyle d{\ce {[ES]}}/{dt}\;{\overset {!}{=}}\;0}$ ${\displaystyle {\ce {[E]}}_{\text{tot}}={\ce {[E]}}+{\ce {[ES]}}\;{\overset {!}{=}}\;{\text{const}}}$

La constante de Michaelis KM se define experimentalmente como la concentración _a la cual la velocidad de la reacción enzimática es la mitad de _Vmax , lo que se puede verificar sustituyendo [S] = KM en la ecuación de Michaelis-Menten y también _se puede ver gráficamente. Si el paso enzimático que determina la velocidad es lento en comparación con la disociación del sustrato ( ₎ , la constante de Michaelis KM es aproximadamente la constante de disociación _KD del complejo ES. ${\displaystyle k_{2}\ll k_{-1}}$

Si es pequeño en comparación con entonces el término y también se forma muy poco complejo ES, por lo tanto . Por lo tanto, la tasa de formación de producto es ${\displaystyle {\ce {[S]}}}$ ${\displaystyle K_{M}}$ ${\displaystyle [{\ce {S}}]/(K_{M}+[{\ce {S}}])\approx [{\ce {S}}]/K_{M}}$ ${\displaystyle {\ce {[E]_{\rm {tot}}\approx [E]}}}$

${\displaystyle v_{0}\approx {\frac {k_{cat}}{K_{M}}}{\ce {[E][S]}}\qquad \qquad {\text{if }}[{\ce {S}}]\ll K_{M}}$

Por lo tanto, la velocidad de formación del producto depende de la concentración de la enzima así como de la concentración del sustrato; la ecuación se asemeja a una reacción bimolecular con una constante de velocidad de pseudosegundo orden correspondiente . Esta constante es una medida de la eficiencia catalítica . Las enzimas más eficientes alcanzan una a en el rango de 10 ⁸ – 10 ¹⁰ M ⁻¹ s ⁻¹ . Estas enzimas son tan eficientes que catalizan eficazmente una reacción cada vez que encuentran una molécula de sustrato y, por lo tanto, han alcanzado un límite teórico superior de eficiencia ( límite de difusión ); y a veces se las denomina enzimas cinéticamente perfectas . ^[11] Pero la mayoría de las enzimas están lejos de ser perfectas: los valores promedio de y son aproximadamente y , respectivamente. ^[12] ${\displaystyle k_{2}/K_{M}}$ ${\displaystyle k_{2}/K_{M}}$   ${\displaystyle k_{2}/K_{\rm {M}}}$ ${\displaystyle k_{2}}$ ${\displaystyle 10^{5}{\rm {s}}^{-1}{\rm {M}}^{-1}}$ ${\displaystyle 10{\rm {s}}^{-1}}$

Uso directo de la ecuación de Michaelis-Menten para el análisis cinético del curso del tiempo

Las velocidades observadas predichas por la ecuación de Michaelis-Menten se pueden utilizar para modelar directamente la desaparición del sustrato en el tiempo y la producción de producto mediante la incorporación de la ecuación de Michaelis-Menten en la ecuación de la cinética química de primer orden. Sin embargo, esto sólo puede lograrse si se reconoce el problema asociado con el uso del número de Euler en la descripción de la cinética química de primer orden. es decir, e ^{− k} es una constante dividida que introduce un error sistemático en los cálculos y puede reescribirse como una constante única que representa el sustrato restante después de cada período de tiempo. ^[13]

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-k)^{t}\,}$

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-v/[S]_{0})^{t}\,}$

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-(V_{\max }[S]_{0}/(K_{M}+[S]_{0})/[S]_{0}))^{t}\,}$

En 1983, Stuart Beal (y también de forma independiente Santiago Schnell y Claudio Mendoza en 1997) derivaron una solución en forma cerrada para el análisis cinético del curso del tiempo del mecanismo de Michaelis-Menten. ^{[14] [15]} La solución, conocida como ecuación de Schnell-Mendoza, tiene la forma:

${\displaystyle {\frac {[S]}{K_{M}}}=W\left[F(t)\right]\,}$

donde W[ ] es la función Lambert-W . ^{[16] [17]} y donde F(t) es

${\displaystyle F(t)={\frac {[S]_{0}}{K_{M}}}\exp \!\left({\frac {[S]_{0}}{K_{M}}}-{\frac {V_{\max }}{K_{M}}}\,t\right)\,}$

Esta ecuación está englobada por la siguiente ecuación, obtenida por Berberan-Santos, ^[18] que también es válida cuando la concentración inicial del sustrato es cercana a la de la enzima,

${\displaystyle {\frac {[S]}{K_{M}}}=W\left[F(t)\right]-{\frac {V_{\max }}{k_{cat}K_{M}}}\ {\frac {W\left[F(t)\right]}{1+W\left[F(t)\right]}}\,}$

donde W[ ] es nuevamente la función Lambert-W .

Gráficos lineales de la ecuación de Michaelis-Menten

Lineweaver-Burk o gráfico recíproco doble de datos cinéticos, que muestra la importancia de las intersecciones y el gradiente del eje.

La gráfica de v versus [S] anterior no es lineal; aunque inicialmente lineal en [S] bajo, se curva para saturarse en [S] alto. _{Antes de la} era moderna del ajuste de curvas no lineal en las computadoras, esta no linealidad podía dificultar la estimación precisa _de KM y Vmax . Por lo tanto, varios investigadores desarrollaron linealizaciones de la ecuación de Michaelis-Menten, como el diagrama de Lineweaver-Burk , el diagrama de Eadie-Hofstee y el diagrama de Hanes-Woolf . Todas estas representaciones lineales pueden ser útiles para visualizar datos, pero ninguna debe usarse para determinar parámetros cinéticos, ya que hay software disponible que permite una determinación más precisa mediante métodos de regresión no lineal . ^[19]

El diagrama de Lineweaver-Burk o diagrama recíproco doble es una forma común de ilustrar datos cinéticos. Esto se produce tomando el recíproco de ambos lados de la ecuación de Michaelis-Menten. Como se muestra a la derecha, esta es una forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten y produce una línea recta con la ecuación y = m x + c con una intersección con el eje y equivalente a 1/ V _max y una intersección con el eje x de la gráfica. representando −1/ K _M .

${\displaystyle {\frac {1}{v}}={\frac {K_{M}}{V_{\max }[{\mbox{S}}]}}+{\frac {1}{V_{\max }}}}$

Naturalmente, no se pueden tomar valores experimentales con 1/[S] negativo; el valor límite inferior 1/[S] = 0 (la intersección con el eje y ) corresponde a una concentración de sustrato infinita, donde 1/v=1/V _máx como se muestra a la derecha; por tanto, la intersección con el eje x es una extrapolación de los datos experimentales tomados en concentraciones positivas. De manera más general, el gráfico de Lineweaver-Burk distorsiona la importancia de las mediciones tomadas en concentraciones bajas de sustrato y, por lo tanto, puede producir estimaciones _{inexactas de} Vmax y KM . ^[20] Un método de trazado lineal más preciso es el gráfico de Eadie-Hofstee . En este caso, v se traza frente a v /[S]. En la tercera representación lineal común, el diagrama de Hanes-Woolf , [S]/ v se representa frente a [S]. En general, la normalización de datos puede ayudar a disminuir la cantidad de trabajo experimental y aumentar la confiabilidad del resultado, y es adecuada para análisis tanto gráficos como numéricos. ^[21]

Importancia práctica de las constantes cinéticas.

El estudio de la cinética enzimática es importante por dos razones básicas. En primer lugar, ayuda a explicar cómo funcionan las enzimas y, en segundo lugar, ayuda a predecir cómo se comportan las enzimas en los organismos vivos. Las constantes cinéticas definidas anteriormente, KM y Vmax , son fundamentales para intentar comprender cómo trabajan juntas las enzimas para _{controlar el} metabolismo .

Hacer estas predicciones no es trivial, ni siquiera para sistemas simples. Por ejemplo, el oxaloacetato lo forma la malato deshidrogenasa dentro de la mitocondria . El oxalacetato puede luego ser consumido por la citrato sintasa , la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa o la aspartato aminotransferasa , alimentándose del ciclo del ácido cítrico , la gluconeogénesis o la biosíntesis del ácido aspártico , respectivamente. Ser capaz de predecir cuánto oxalacetato entra en qué vía requiere conocimiento de la concentración de oxalacetato, así como de la concentración y cinética de cada una de estas enzimas. Este objetivo de predecir el comportamiento de las vías metabólicas alcanza su expresión más compleja en la síntesis de enormes cantidades de datos cinéticos y de expresión genética en modelos matemáticos de organismos completos. Alternativamente, una simplificación útil del problema del modelado metabólico es ignorar la cinética enzimática subyacente y confiar únicamente en la información sobre la estequiometría de la red de reacción, una técnica llamada análisis de equilibrio de flujo . ^{[22] [23]}

Cinética de Michaelis-Menten con intermedia

También se podría considerar el caso menos simple

${\displaystyle {\ce {{E}+S<=>[k_{1}][k_{-1}]ES->[k_{2}]EI->[k_{3}]{E}+P}}}$

donde existe un complejo con la enzima y un intermedio y el intermedio se convierte en producto en un segundo paso. En este caso tenemos una ecuación muy similar ^[24]

${\displaystyle v_{0}=k_{cat}{\frac {{\ce {[S] [E]_0}}}{K_{M}^{\prime }+{\ce {[S]}}}}}$

pero las constantes son diferentes

${\displaystyle {\begin{aligned}K_{M}^{\prime }\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{3}}{k_{2}+k_{3}}}K_{M}={\frac {k_{3}}{k_{2}+k_{3}}}\cdot {\frac {k_{2}+k_{-1}}{k_{1}}}\\k_{cat}\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\dfrac {k_{3}k_{2}}{k_{2}+k_{3}}}\end{aligned}}}$

Vemos que para el caso límite , cuando el último paso es mucho más rápido que el paso anterior, obtenemos nuevamente la ecuación original. Matemáticamente tenemos entonces y . ${\displaystyle k_{3}\gg k_{2}}$ ${\displaystyle {\ce {EI -> E + P}}}$ ${\displaystyle K_{M}^{\prime }\approx K_{M}}$ ${\displaystyle k_{cat}\approx k_{2}}$

Reacciones multisustrato

Las reacciones con múltiples sustratos siguen ecuaciones de velocidad complejas que describen cómo se unen los sustratos y en qué secuencia. El análisis de estas reacciones es mucho más sencillo si la concentración del sustrato A se mantiene constante y el sustrato B varía. En estas condiciones, la enzima se comporta como una enzima de un solo sustrato y una gráfica de v por [S] da constantes aparentes _de KM y V _máx para el sustrato B. Si se realiza un conjunto de estas mediciones a diferentes concentraciones fijas de A, Estos datos se pueden utilizar para determinar cuál es el mecanismo de la reacción. Para una enzima que toma dos sustratos A y B y los convierte en dos productos P y Q, existen dos tipos de mecanismo: complejo ternario y ping-pong.

Mecanismos complejos ternarios

Mecanismo complejo ternario de orden aleatorio para una reacción enzimática. La ruta de reacción se muestra como una línea y los intermedios enzimáticos que contienen los sustratos A y B o los productos P y Q están escritos debajo de la línea.

En estas enzimas, ambos sustratos se unen a la enzima al mismo tiempo para producir un complejo ternario BEF. El orden de unión puede ser aleatorio (en un mecanismo aleatorio) o los sustratos deben unirse en una secuencia particular (en un mecanismo ordenado). Cuando un conjunto de curvas v por [S] (A fija, B variable) de una enzima con un mecanismo de complejo ternario se trazan en un diagrama de Lineweaver-Burk , el conjunto de líneas producidas se cruzará.

Las enzimas con mecanismos de complejo ternario incluyen la glutatión S -transferasa , ^[25] la dihidrofolato reductasa ^[26] y la ADN polimerasa . ^[27] Los siguientes enlaces muestran animaciones breves de los mecanismos del complejo ternario de las enzimas dihidrofolato reductasa ^[β] y ADN polimerasa ^[γ] .

Mecanismos de ping-pong

${\displaystyle {\ce {\overset {}{E->[{\ce {A \atop \downarrow }}]EA<=>E^{\ast }P->[{\ce {P \atop \uparrow }}]E^{\ast }->[{\ce {B \atop \downarrow }}]E^{\ast }B<=>EQ->[{\ce {Q \atop \uparrow }}]E}}}}$

Mecanismo de ping-pong para una reacción enzimática. Los intermedios contienen los sustratos A y B o los productos P y Q.

Como se muestra a la derecha, las enzimas con mecanismo de ping-pong pueden existir en dos estados, E y una forma químicamente modificada de la enzima E*; esta enzima modificada se conoce como intermedia . En tales mecanismos, el sustrato A se une, cambia la enzima a E*, por ejemplo, transfiriendo un grupo químico al sitio activo y luego se libera. Sólo después de que se libera el primer sustrato, el sustrato B puede unirse y reaccionar con la enzima modificada, regenerando la forma E no modificada. Cuando se traza un conjunto de curvas v por [S] (A fija, B variable) de una enzima con un mecanismo de ping-pong en un diagrama de Lineweaver-Burk, se producirá un conjunto de líneas paralelas. Esto se llama trama secundaria .

Las enzimas con mecanismos de ping-pong incluyen algunas oxidorreductasas como la tioredoxina peroxidasa , ^[28] transferasas como la acilneuraminato citidililtransferasa ^[29] y serina proteasas como la tripsina y la quimotripsina . ^[30] Las serina proteasas son una familia de enzimas muy común y diversa, que incluye enzimas digestivas (tripsina, quimotripsina y elastasa), varias enzimas de la cascada de coagulación sanguínea y muchas otras. En estas serina proteasas, el intermedio E* es una especie de acil-enzima formada por el ataque de un residuo de serina del sitio activo sobre un enlace peptídico en un sustrato proteico. Aquí se incluye una breve animación que muestra el mecanismo de la quimotripsina. ^[δ]

Catálisis reversible y la ecuación de Haldane.

Los factores externos pueden limitar la capacidad de una enzima para catalizar una reacción en ambas direcciones (mientras que la naturaleza de un catalizador en sí misma significa que no puede catalizar solo una dirección, según el principio de reversibilidad microscópica ). Consideremos el caso de una enzima que cataliza la reacción en ambos sentidos:

${\displaystyle {\ce {{E}+{S}<=>[k_{1}][k_{-1}]ES<=>[k_{2}][k_{-2}]{E}+{P}}}}$

La velocidad inicial de la reacción en estado estacionario es ${\displaystyle v_{0}={\frac {d\,[{\rm {P}}]}{dt}}={\frac {(k_{1}k_{2}\,[{\rm {S}}]-k_{-1}k_{-2}[{\rm {P}}])[{\rm {E}}]_{0}}{k_{-1}+k_{2}+k_{1}\,[{\rm {S}}]+k_{-2}\,[{\rm {P}}]}}}$

${\displaystyle v_{0}}$es positivo si la reacción avanza en dirección directa ( ) y negativo en caso contrario. ${\displaystyle S\rightarrow P}$

El equilibrio requiere eso , lo cual ocurre cuando . Esto muestra que la termodinámica fuerza una relación entre los valores de las 4 constantes de velocidad. ${\displaystyle v=0}$ ${\displaystyle {\frac {[{\rm {P}}]_{\rm {eq}}}{[{\rm {S}}]_{\rm {eq}}}}={\frac {k_{1}k_{2}}{k_{-1}k_{-2}}}=K_{\rm {eq}}}$

Los valores de las tasas máximas hacia adelante y hacia atrás, obtenidos para , y , respectivamente, son y , respectivamente. Su relación no es igual a la constante de equilibrio, lo que implica que la termodinámica no limita la relación de las tasas máximas. Esto explica que las enzimas pueden ser mucho "mejores catalizadores" ( en términos de velocidades máximas ) en una dirección particular de la reacción. ^[31] ${\displaystyle [{\rm {S}}]\rightarrow \infty }$ ${\displaystyle [{\rm {P}}]=0}$ ${\displaystyle [{\rm {S}}]=0}$ ${\displaystyle [{\rm {P}}]\rightarrow \infty }$ ${\displaystyle V_{\rm {max}}^{f}=k_{2}{\rm {[E]}}_{tot}}$ ${\displaystyle V_{\rm {max}}^{b}=-k_{-1}{\rm {[E]}}_{tot}}$

On también puede derivar las dos constantes de Michaelis y . La ecuación de Haldane es la relación . ${\displaystyle K_{M}^{S}=(k_{-1}+k_{2})/k_{1}}$ ${\displaystyle K_{M}^{P}=(k_{-1}+k_{2})/k_{-2}}$ ${\displaystyle K_{\rm {eq}}={\frac {[{\rm {P}}]_{\rm {eq}}}{[{\rm {S}}]_{\rm {eq}}}}={\frac {V_{\rm {max}}^{f}/K_{M}^{S}}{V_{\rm {max}}^{b}/K_{M}^{P}}}}$

Por lo tanto, la termodinámica limita la relación entre los valores hacia adelante y hacia atrás, no la relación de valores. ${\displaystyle V_{\rm {max}}/K_{M}}$ ${\displaystyle V_{\rm {max}}}$

Cinética no Michaelis-Menten

Curva de saturación de una reacción enzimática que muestra la cinética sigmoidea.

Muchos sistemas enzimáticos diferentes siguen un comportamiento no Michaelis-Menten. Unos pocos ejemplos seleccionados incluyen la cinética de enzimas autocatalíticas, enzimas cooperativas y alostéricas, enzimas interfaciales e intracelulares, enzimas procesivas, etc. Algunas enzimas producen una gráfica sigmoidea v por [S], que a menudo indica unión cooperativa del sustrato al sitio activo. Esto significa que la unión de una molécula de sustrato afecta la unión de moléculas de sustrato posteriores. Este comportamiento es más común en enzimas multiméricas con varios sitios activos que interactúan. ^[32] Aquí, el mecanismo de cooperación es similar al de la hemoglobina , donde la unión del sustrato a un sitio activo altera la afinidad de los otros sitios activos por las moléculas del sustrato. La cooperatividad positiva ocurre cuando la unión de la primera molécula de sustrato aumenta la afinidad de los otros sitios activos por el sustrato. La cooperatividad negativa ocurre cuando la unión del primer sustrato disminuye la afinidad de la enzima por otras moléculas de sustrato.

Las enzimas alostéricas incluyen la tirosil ARNt-sintetasa de mamíferos, que muestra cooperatividad negativa, ^{[33] y} la aspartato transcarbamoilasa bacteriana ^[34] y la fosfofructoquinasa , ^[35] que muestran cooperatividad positiva.

La cooperatividad es sorprendentemente común y puede ayudar a regular las respuestas de las enzimas a los cambios en las concentraciones de sus sustratos. La cooperatividad positiva hace que las enzimas sean mucho más sensibles al [S] y sus actividades pueden mostrar grandes cambios en un rango estrecho de concentración de sustrato. Por el contrario, la cooperatividad negativa hace que las enzimas sean insensibles a pequeños cambios en [S].

La ecuación de Hill ^[36] se utiliza a menudo para describir cuantitativamente el grado de cooperatividad en cinéticas que no son de Michaelis-Menten. El coeficiente de Hill derivado n mide cuánto afecta la unión del sustrato a un sitio activo a la unión del sustrato a los otros sitios activos. Un coeficiente de Hill de <1 indica cooperatividad negativa y un coeficiente de >1 indica cooperatividad positiva .

Cinética previa al estado estacionario

Curva de progreso previa al estado estacionario, que muestra la fase de explosión de una reacción enzimática.

En el primer momento después de que una enzima se mezcla con el sustrato, no se forma ningún producto ni existen intermediarios . El estudio de los siguientes milisegundos de la reacción se denomina cinética previa al estado estacionario. Por lo tanto, la cinética previa al estado estacionario se ocupa de la formación y el consumo de intermediarios enzima-sustrato (como ES o E*) hasta que se alcanzan sus concentraciones en estado estacionario .

Este enfoque se aplicó por primera vez a la reacción de hidrólisis catalizada por quimotripsina . ^[37] A menudo, la detección de un intermediario es una prueba vital en las investigaciones sobre el mecanismo que sigue una enzima. Por ejemplo, en los mecanismos de ping-pong que se muestran arriba, las mediciones cinéticas rápidas pueden seguir la liberación del producto P y medir la formación de la enzima modificada intermedia E*. ^[38] En el caso de la quimotripsina, este intermedio se forma mediante un ataque al sustrato por parte de la serina nucleofílica en el sitio activo y la formación del intermedio acil-enzima.

En la figura de la derecha, la enzima produce E* rápidamente en los primeros segundos de la reacción. Luego, la velocidad disminuye a medida que se alcanza el estado estacionario. Esta rápida fase de explosión de la reacción mide un único recambio de la enzima. En consecuencia, la cantidad de producto liberada en esta ráfaga, mostrada como la intersección en el eje y del gráfico, también proporciona la cantidad de enzima funcional que está presente en el ensayo. ^[39]

Mecanismo químico

Un objetivo importante de medir la cinética enzimática es determinar el mecanismo químico de una reacción enzimática, es decir, la secuencia de pasos químicos que transforman el sustrato en producto. Los enfoques cinéticos discutidos anteriormente mostrarán a qué ritmo se forman y se interconvierten los intermediarios , pero no pueden identificar exactamente cuáles son estos intermediarios.

Las mediciones cinéticas tomadas en diversas condiciones de solución o en enzimas o sustratos ligeramente modificados a menudo arrojan luz sobre este mecanismo químico, ya que revelan el paso o los intermedios que determinan la velocidad en la reacción. Por ejemplo, la ruptura de un enlace covalente con un átomo de hidrógeno es un paso común que determina la velocidad. Cuál de las posibles transferencias de hidrógeno determina la velocidad se puede demostrar midiendo los efectos cinéticos de sustituir cada hidrógeno por deuterio , su isótopo estable . La velocidad cambiará cuando se reemplace el hidrógeno crítico, debido a un efecto isotópico cinético primario , que ocurre porque los enlaces con el deuterio son más difíciles de romper que los enlaces con el hidrógeno. ^[40] También es posible medir efectos similares con otras sustituciones de isótopos, como ¹³ C/ ¹² C y ¹⁸ O/ ¹⁶ O, pero estos efectos son más sutiles. ^[41]

Los isótopos también se pueden utilizar para revelar el destino de diversas partes de las moléculas del sustrato en los productos finales. Por ejemplo, a veces resulta difícil discernir el origen de un átomo de oxígeno en el producto final; ya que puede haber provenido del agua o de parte del sustrato. Esto se puede determinar sustituyendo sistemáticamente el isótopo estable ¹⁸ O del oxígeno en las diversas moléculas que participan en la reacción y comprobando el isótopo en el producto. ^[42] El mecanismo químico también se puede dilucidar examinando la cinética y los efectos isotópicos en diferentes condiciones de pH, ^[43] alterando los iones metálicos u otros cofactores unidos , ^[44] mediante mutagénesis dirigida de residuos de aminoácidos conservados, o estudiando el comportamiento de la enzima en presencia de análogos del sustrato(s). ^[45]

Inhibición y activación enzimática.

Esquema cinético de inhibidores enzimáticos reversibles.

Los inhibidores de enzimas son moléculas que reducen o suprimen la actividad enzimática, mientras que los activadores de enzimas son moléculas que aumentan la tasa catalítica de las enzimas. Estas interacciones pueden ser reversibles (es decir, la eliminación del inhibidor restablece la actividad enzimática) o irreversibles (es decir, el inhibidor inactiva permanentemente la enzima).

Inhibidores reversibles

Tradicionalmente, los inhibidores de enzimas reversibles se han clasificado en competitivos , no competitivos o no competitivos , según sus efectos sobre _la KM y _la Vmáx . Estos diferentes efectos resultan de la unión del inhibidor a la enzima E, al complejo enzima-sustrato ES, o a ambos, respectivamente. La división de estas clases surge de un problema en su derivación y resulta en la necesidad de utilizar dos constantes de vinculación diferentes para un evento de vinculación. La unión de un inhibidor y su efecto sobre la actividad enzimática son dos cosas claramente diferentes, otro problema que las ecuaciones tradicionales no reconocen. En la inhibición no competitiva, la unión del inhibidor da como resultado una inhibición del 100% de la enzima únicamente y no considera la posibilidad de algo intermedio. ^[46] En la inhibición no competitiva, el inhibidor se unirá a una enzima en su sitio alostérico; por lo tanto, la afinidad de unión, o inversa de KM , del sustrato con la enzima seguirá siendo la misma _. Por otro lado, la Vmax _disminuirá en relación con una enzima no inhibida. En un gráfico de Lineweaver-Burk, la presencia de un inhibidor no competitivo se ilustra mediante un cambio en la intersección con el eje y, definido como 1/V _máx . La intersección con el eje x, definida como −1/ K _M , seguirá siendo la misma. En la inhibición competitiva, el inhibidor se unirá a una enzima en el sitio activo, compitiendo con el sustrato. Como resultado, el _KM aumentará y el Vmax _seguirá siendo el mismo. ^[47] La ​​forma común del término inhibidor también oscurece la relación entre la unión del inhibidor a la enzima y su relación con cualquier otro término de unión, ya sea la ecuación de Michaelis-Menten o una curva dosis-respuesta asociada con la unión del receptor de ligando. Para demostrar la relación se puede hacer el siguiente reordenamiento:

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{1+{\cfrac {[I]}{K_{i}}}}}={\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {[I]+K_{i}}{K_{i}}}}}$

Agregando cero al final ([I]-[I])

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {[I]+K_{i}}{[I]+K_{i}-[I]}}}}$

Dividiendo por [I]+K _i

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {1}{1-{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}}}=V_{\max }-V_{\max }{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

Esta notación demuestra que, de manera similar a la ecuación de Michaelis-Menten, donde la velocidad de reacción depende del porcentaje de la población de enzimas que interactúa con el sustrato, el efecto del inhibidor es el resultado del porcentaje de la población de enzimas que interactúa con el inhibidor. El único problema con esta ecuación en su forma actual es que supone una inhibición absoluta de la enzima con la unión del inhibidor, cuando en realidad puede haber una amplia gama de efectos desde el 100% de inhibición de la rotación del sustrato hasta sólo >0%. Para tener en cuenta esto, la ecuación se puede modificar fácilmente para permitir diferentes grados de inhibición al incluir un término delta V _máx .

${\displaystyle V_{\max }-\Delta V_{\max }{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

o

${\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

Este término puede luego definir la actividad enzimática residual presente cuando el inhibidor interactúa con enzimas individuales en la población. Sin embargo, la inclusión de este término tiene el valor agregado de permitir la posibilidad de activación si el término Vmax _secundario resulta ser mayor que el término inicial. Para tener en cuenta también la posibilidad de activación, la notación se puede reescribir reemplazando el inhibidor "I" con un término modificador denominado aquí "X".

${\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {[X]}{[X]+K_{x}}}}$

Si bien esta terminología resulta en una forma simplificada de abordar los efectos cinéticos relacionados con la velocidad máxima de la ecuación de Michaelis-Menten, resalta problemas potenciales con el término utilizado para describir los efectos relacionados con _el KM . El KM relacionado con la afinidad de la enzima por el sustrato debería, en la mayoría de los casos _, relacionarse con cambios potenciales en el sitio de unión de la enzima que resultarían directamente de las interacciones del inhibidor de la enzima. _{Como tal ,} un término similar al propuesto anteriormente para modular Vmax debería ser apropiado en la mayoría de las situaciones: ^[48]

${\displaystyle K_{m1}-(K_{m1}-K_{m2}){\cfrac {[X]}{[X]+K_{x}}}}$

Inhibidores irreversibles

Los inhibidores de enzimas también pueden inactivar enzimas de forma irreversible, generalmente modificando covalentemente los residuos del sitio activo. Estas reacciones, que pueden denominarse sustratos suicidas, siguen funciones de desintegración exponencial y suelen ser saturables. Por debajo de la saturación, siguen una cinética de primer orden con respecto al inhibidor. La inhibición irreversible podría clasificarse en dos tipos distintos. El etiquetado de afinidad es un tipo de inhibición irreversible en el que un grupo funcional que es altamente reactivo modifica un residuo catalíticamente crítico en la proteína de interés para provocar la inhibición. La inhibición basada en mecanismos, por otro lado, implica la unión del inhibidor seguida de alteraciones mediadas por enzimas que transforman a este último en un grupo reactivo que modifica irreversiblemente la enzima.

Discurso filosófico sobre la reversibilidad y la irreversibilidad de la inhibición

Habiendo discutido la inhibición reversible y la inhibición irreversible en los dos títulos anteriores, habría que señalar que el concepto de reversibilidad (o irreversibilidad) es una construcción puramente teórica que depende exclusivamente del marco temporal del ensayo, es decir, un ensayo reversible. implicar asociación y disociación de la molécula inhibidora en escalas de tiempo de minutos parecería irreversible si un ensayo evaluara el resultado en segundos y viceversa. Existe una serie continua de comportamientos inhibidores que abarcan la reversibilidad y la irreversibilidad en un período de tiempo de ensayo determinado y no arbitrario. Hay inhibidores que muestran un comportamiento de inicio lento y la mayoría de estos inhibidores, invariablemente, también muestran una unión estrecha a la proteína objetivo de interés.

Mecanismos de catálisis.

La variación de energía en función de la coordenada de reacción muestra la estabilización del estado de transición por una enzima.

El modelo preferido para la interacción enzima-sustrato es el modelo de ajuste inducido. ^[49] Este modelo propone que la interacción inicial entre la enzima y el sustrato es relativamente débil, pero que estas interacciones débiles inducen rápidamente cambios conformacionales en la enzima que fortalecen la unión. Estos cambios conformacionales también acercan los residuos catalíticos del sitio activo a los enlaces químicos del sustrato que se alterarán en la reacción. ^[50] Los cambios conformacionales se pueden medir mediante dicroísmo circular o interferometría de polarización dual . Después de que se produce la unión, uno o más mecanismos de catálisis reducen la energía del estado de transición de la reacción al proporcionar una vía química alternativa para la reacción. Los mecanismos de catálisis incluyen catálisis por tensión de enlace; por proximidad y orientación; por donantes o aceptores de protones de sitio activo; catálisis covalente y tunelización cuántica . ^{[38] [51]}

La cinética enzimática no puede demostrar qué modos de catálisis utiliza una enzima. Sin embargo, algunos datos cinéticos pueden sugerir posibilidades de ser examinadas mediante otras técnicas. Por ejemplo, un mecanismo de ping-pong con cinética previa al estado estacionario en fase de explosión sugeriría que la catálisis covalente podría ser importante en el mecanismo de esta enzima. Alternativamente, la observación de un fuerte efecto del pH en Vmax pero no en _KM podría indicar que un residuo en _el sitio activo necesita estar en un estado de ionización particular para que ocurra la catálisis.

Historia

En 1902, Victor Henri propuso una teoría cuantitativa de la cinética enzimática, ^[52] pero en ese momento aún no se reconocía la importancia experimental de la concentración de iones de hidrógeno . Después de que Peter Lauritz Sørensen definiera la escala de pH logarítmica e introdujera el concepto de amortiguación en 1909 ^[53], la química alemana Leonor Michaelis y la Dra. Maud Leonora Menten (investigadora postdoctoral en el laboratorio de Michaelis en ese momento) repitieron los experimentos de Henri y confirmaron su ecuación, que ahora se conoce generalmente como cinética de Michaelis-Menten (a veces también cinética de Henri-Michaelis-Menten ). ^[54] Su trabajo fue desarrollado aún más por GE Briggs y JBS Haldane , quienes derivaron ecuaciones cinéticas que todavía se consideran ampliamente hoy como un punto de partida en el modelado de la actividad enzimática. ^[55]

La principal contribución del enfoque de Henri-Michaelis-Menten fue pensar en reacciones enzimáticas en dos etapas. En el primero, el sustrato se une reversiblemente a la enzima, formando el complejo enzima-sustrato. A esto a veces se le llama complejo de Michaelis. Luego, la enzima cataliza el paso químico de la reacción y libera el producto. La cinética de muchas enzimas se describe adecuadamente mediante el modelo simple de Michaelis-Menten, pero todas las enzimas tienen movimientos internos que no se tienen en cuenta en el modelo y pueden tener contribuciones significativas a la cinética de reacción general. Esto se puede modelar introduciendo varias vías de Michaelis-Menten que están conectadas con tasas fluctuantes, ^{[56] [57] [58]} , que es una extensión matemática del mecanismo básico de Michaelis Menten. ^[59]

Software

ENZO (Enzyme Kinetics) es una herramienta de interfaz gráfica para construir modelos cinéticos de reacciones catalizadas por enzimas. ENZO genera automáticamente las ecuaciones diferenciales correspondientes a partir de un esquema de reacción enzimática estipulado. Estas ecuaciones diferenciales se procesan mediante un solucionador numérico y un algoritmo de regresión que ajusta los coeficientes de las ecuaciones diferenciales a las curvas de evolución temporal observadas experimentalmente. ENZO permite una evaluación rápida de esquemas de reacción rivales y puede usarse para pruebas de rutina en cinética enzimática. ^[60]

Ver también

• Dinámica de proteínas
• Enzima de difusión limitada
• Modelo de adsorción de Langmuir

Notas a pie de página

α. ^ Enlace: Tutorial interactivo de cinética de Michaelis-Menten (se requiere Java)

β. ^ Enlace: mecanismo de dihidrofolato reductasa (Gif)

γ. ^ Enlace: mecanismo de la ADN polimerasa (Gif)

δ. ^ Enlace: Mecanismo de quimotripsina (se requiere Flash)

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Otras lecturas

Introductorio

• Cornish-Bowden A (2012). Fundamentos de la cinética enzimática (4ª ed.). Weinheim: Wiley-Blackwell. ISBN 978-3-527-33074-4.
• Stevens L, Precio NC (1999). Fundamentos de enzimología: la biología celular y molecular de las proteínas catalíticas . Oxford [Oxfordshire]: Oxford University Press. ISBN 978-0-19-850229-6.
• Bugg T (2004). Introducción a la química de enzimas y coenzimas . Cambridge, MA: Editores Blackwell. ISBN 978-1-4051-1452-3.
• Segel IH (1993). Cinética enzimática: comportamiento y análisis de sistemas enzimáticos de equilibrio rápido y estado estacionario . Nueva York: Wiley. ISBN 978-0-471-30309-1.

Avanzado

• Fersht A (1999). Estructura y mecanismo en la ciencia de las proteínas: una guía para la catálisis enzimática y el plegamiento de proteínas . San Francisco: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-3268-6.
• Schnell S, Maini PK (2004). "Un siglo de cinética enzimática: fiabilidad de las estimaciones de KM _y v _max ". Comentarios sobre Biología Teórica . 8 (2–3): 169–87. CiteSeerX  10.1.1.493.7178 . doi :10.1080/08948550302453.
• Walsh C (1979). Mecanismos de reacción enzimática . San Francisco: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-0070-8.
• Cleland WW, Cook P (2007). Cinética y mecanismo enzimático . Nueva York: Garland Science. ISBN 978-0-8153-4140-6.

enlaces externos

• Animación de un ensayo enzimático: muestra los efectos de la manipulación de las condiciones del ensayo.
• MACiE: una base de datos de mecanismos de reacción enzimática
• ENZIMA — Base de datos de nomenclatura de enzimas Expasy
• ENZO: aplicación web para una construcción sencilla y pruebas rápidas de modelos cinéticos de reacciones catalizadas por enzimas.
• ExCatDB: una base de datos de mecanismos catalíticos enzimáticos
• BRENDA: base de datos completa de enzimas, que proporciona sustratos, inhibidores y diagramas de reacción.
• SABIO-RK: una base de datos de cinética de reacción.
• Grupo de investigación de Joseph Kraut, Universidad de California en San Diego: animaciones de varios mecanismos de reacción enzimática
• Simbolismo y terminología en cinética enzimática: una explicación completa de los conceptos y la terminología en cinética enzimática
• Una introducción a la cinética de enzimas: un conjunto accesible de tutoriales en línea sobre cinética de enzimas
• Tutorial animado de cinética enzimática: un tutorial animado con audio