La eficiencia de la transformación se refiere a la capacidad de una célula para captar e incorporar ADN exógeno, como los plásmidos , durante un proceso llamado transformación . La eficiencia de la transformación generalmente se mide como la cantidad de transformantes (células que han absorbido el ADN exógeno ) por microgramo de ADN agregado a las células. Una mayor eficiencia de transformación significa que más células pueden absorber el ADN, y una menor eficiencia significa que menos células pueden hacerlo.
En biología molecular , la eficiencia de la transformación es un parámetro crucial; se utiliza para evaluar la capacidad de diferentes métodos para introducir ADN plasmídico en las células y comparar la eficiencia de diferentes plásmidos , vectores y células huésped. Esta eficiencia puede verse afectada por una serie de factores, incluido el método utilizado para introducir el ADN, el tipo de célula y plásmido utilizado y las condiciones bajo las cuales se realiza la transformación. Por lo tanto, medir y optimizar la eficiencia de la transformación es un paso importante en muchas aplicaciones de la biología molecular, incluida la ingeniería genética , la terapia génica y la biotecnología .
Al medir la eficiencia de la transformación, podemos utilizar la información de nuestro experimento para evaluar la eficacia de nuestra transformación. Esta es una cuantificación de cuántas células fueron alteradas por 1 µg de ADN plasmídico. En esencia, es una señal de que el experimento de transformación fue exitoso. [1] Debe determinarse en condiciones de exceso de células. [2]
La eficiencia de la transformación se mide normalmente como el número de células transformadas por el número total de células. Puede representarse como porcentaje o como unidades formadoras de colonias (UFC) por microgramo de ADN.
Una de las formas más comunes de medir la eficiencia de la transformación es realizando un ensayo de formación de colonias . A continuación se muestra un ejemplo de cómo calcular la eficiencia de la transformación utilizando unidades formadoras de colonias (UFC): [3]
Por ejemplo, si coloca en placas 1x 10 7 células y cuenta 1000 colonias, la eficiencia de transformación es: (1000/1x 10 7 ) x 100 = 0,1%
Alternativamente, las UFC se pueden informar por microgramo de ADN utilizado para la transformación. Esto se puede calcular multiplicando el número de colonias por el volumen del cultivo en placas y dividiendo por la cantidad de ADN utilizado.
PCR cuantitativa (qPCR): este método utiliza el hecho de que el ADN plasmídico tendrá un gen o secuencia específica que no está presente en el genoma de la célula huésped y, por lo tanto, puede usarse como objetivo para qPCR. Cuantificando el número de copias de este gen o secuencia específica en las células transformadas, es posible determinar la cantidad de ADN plasmídico presente en la célula y, por tanto, la eficacia de la transformación. [4]
Ensayo fluorescente : este método se basa en el uso de un plásmido que contiene una proteína fluorescente o un gen informador. Luego, las células transformadas se analizan mediante citometría de flujo o microscopía de fluorescencia para determinar el número de células que expresan la proteína fluorescente . Luego se calcula la eficiencia de transformación como el porcentaje de células que expresan la proteína fluorescente. [5]
El número de células viables en una preparación para una reacción de transformación puede oscilar entre 2 x 10 8 y 10 11 ; Los métodos más comunes de preparación de E. coli producen alrededor de 10 10 células viables por reacción. Los plásmidos estándar utilizados para la determinación de la eficacia de la transformación en Escherichia coli son pBR322 u otros vectores de tamaño similar o más pequeños, tales como la serie de vectores pUC. Sin embargo, pueden usarse diferentes vectores para determinar su eficiencia de transformación. Se pueden utilizar de 10 a 100 pg de ADN para la transformación; puede ser necesario más ADN para una transformación de baja eficiencia (generalmente el nivel de saturación se alcanza por encima de 10 ng). [6]
Después de la transformación, el 1% y el 10% de las células se siembran en placas por separado; las células se pueden diluir en medios según sea necesario para facilitar el cultivo en placas. Se puede utilizar una dilución adicional para una transformación de alta eficiencia.
Una eficacia de transformación de 1 x 108 ufc /μg para un plásmido pequeño como pUC19 equivale aproximadamente a 1 entre 2000 moléculas del plásmido utilizado que se introducen en las células. En E. coli , el límite teórico de eficiencia de transformación para los plásmidos más utilizados sería superior a 1×10 11 ufc/μg. En la práctica, el mejor resultado alcanzable puede ser de alrededor de 2 a 4 × 10 10 ufc/μg para un plásmido pequeño como pUC19, y considerablemente menor para plásmidos grandes.
Las células individuales son capaces de absorber muchas moléculas de ADN, pero la presencia de múltiples plásmidos no afecta significativamente la ocurrencia de eventos de transformación exitosos. [7] Varios factores pueden afectar la eficiencia de la transformación: [2]
Tamaño del plásmido : un estudio realizado en E. coli encontró que la eficiencia de la transformación disminuye linealmente al aumentar el tamaño del plásmido , es decir, los plásmidos más grandes se transforman menos bien que los plásmidos más pequeños. [7] [8] [9]
Formas de ADN : los plásmidos superenrollados tienen una eficiencia de transformación ligeramente mejor que los plásmidos relajados; los plásmidos relajados se transforman con alrededor del 75% de eficiencia que los superenrollados. [7] Sin embargo, el ADN lineal y monocatenario tiene una eficiencia de transformación mucho menor. Los ADN monocatenarios se transforman con una eficiencia 10 4 menor que los bicatenarios.
Composición de los medios : la composición de los medios utilizados en el proceso de transformación puede afectar la eficiencia. Por ejemplo, ciertos suplementos multimedia pueden aumentar la competencia natural de las células. [10]
Genotipo de las células : las cepas de clonación pueden contener mutaciones que mejoran la eficiencia de transformación de las células. Por ejemplo, las cepas de E. coli K12 con la mutación deoR , que originalmente confiere a la célula la capacidad de crecer en medios mínimos utilizando inosina como única fuente de carbono, tienen de 4 a 5 veces la eficiencia de transformación de cepas similares sin ella. Para el ADN lineal, que se transforma mal en E. coli , la mutación recBC o recD puede mejorar significativamente la eficiencia de su transformación. [11]
Condiciones de cultivo : las células de E. coli son más susceptibles a volverse competentes cuando crecen rápidamente; por lo tanto, las células normalmente se recolectan en la fase logarítmica inicial del crecimiento celular cuando se preparan células competentes. La densidad óptica óptima para recolectar células normalmente se sitúa en torno a 0,4, aunque puede variar según las diferentes cepas celulares. También se ha descubierto que un valor más alto de 0,94-0,95 produce un buen rendimiento de células competentes, pero esto puede resultar poco práctico cuando el crecimiento celular es rápido. [12]
Presencia de antibióticos : la presencia de antibióticos puede aumentar la eficiencia de la transformación al inhibir el crecimiento de células no transformadas y seleccionar células transformadas que sean resistentes al antibiótico. Por ejemplo, se ha demostrado que el uso de antibióticos β-lactámicos en bacterias productoras de glutamato aumenta su eficiencia de transformación. [13] [14] [15]
Origen de replicación del plásmido : el origen de replicación del plásmido utilizado en el proceso de transformación puede afectar la eficiencia de varias maneras. El número de copias del plásmido en la célula, la actividad del origen de replicación en las células huésped y la expresión de los genes en el plásmido pueden afectar la eficiencia. El plásmido con un origen de replicación con un número de copias alto generalmente tendrá una mayor eficiencia de transfección que uno con un origen de número de copias bajo; el uso de un plásmido con un origen de replicación que esté activo en la célula huésped puede conducir a una mayor eficiencia de transfección. [dieciséis]
Condiciones de transformación : el método de preparación de las células competentes, la duración del choque térmico , la temperatura del choque térmico, el tiempo de incubación después del choque térmico, el medio de crecimiento utilizado, el pH y varios aditivos, todos pueden afectar la eficiencia de transformación de las células. La presencia de contaminantes, así como de ligasa en una mezcla de ligadura, puede reducir la eficiencia de la transformación en la electroporación , [17] y la inactivación de la ligasa o la extracción del ADN con cloroformo puede ser necesaria para la electroporación; alternativamente, solo use una décima parte de la mezcla de ligadura para reducir la cantidad de contaminantes. La preparación normal de células competentes puede producir una eficiencia de transformación que oscila entre 10 6 y 10 8 ufc/μg de ADN. Sin embargo, existen protocolos de métodos químicos para producir células supercompetentes que pueden producir una eficiencia de transformación superior a 1 x 10 9 . [18]
Daño al ADN : la exposición del ADN a la radiación ultravioleta en el procedimiento de electroforesis preparativa estándar en gel de agarosa durante tan solo 45 segundos puede dañar el ADN y esto puede reducir significativamente la eficiencia de la transformación. [19] Sin embargo , agregar citidina o guanosina al tampón de electroforesis en una concentración de 1 mM puede proteger el ADN del daño. Se debe utilizar una radiación UV de mayor longitud de onda (365 nm) que causa menos daño al ADN si es necesario trabajar en el ADN en un transiluminador UV durante un período de tiempo prolongado. Esta longitud de onda UV más larga produce una fluorescencia más débil con el bromuro de etidio intercalado en el ADN, por lo tanto, si es necesario capturar imágenes de las bandas de ADN, se pueden usar radiaciones UV de longitud de onda más corta (302 o 312 nm). Sin embargo, dicha exposición debe limitarse a un período de tiempo muy corto si el ADN se va a recuperar más adelante para su ligadura y transformación.
El método utilizado para introducir el ADN tiene un impacto significativo en la eficiencia de la transformación. [20]
La electroporación tiende a ser más eficiente que los métodos químicos y puede aplicarse a una amplia gama de especies y cepas que antes eran resistentes y recalcitrantes a las técnicas de transformación. [21] [22]
Se ha descubierto que la electroporación tiene un rendimiento promedio típicamente entre 10 4 - 10 8 UFC/ug. Sin embargo, una transformación tiene eficiencias de hasta 0,5-5 x 10 10 unidades formadoras de colonias (UFC) por microgramo de ADN para E. coli . Para muestras que son difíciles de manipular, como bibliotecas de ADNc , ADNg y plásmidos de más de 30 kb, se sugiere utilizar células electrocompetentes que tengan eficiencias de transformación superiores a 1 x 10 10 UFC /μg. Esto asegurará una alta tasa de éxito en la introducción del ADN y la formación de una gran cantidad de colonias. [23] Es importante ajustar y optimizar el tampón de electroporación (aumentar la concentración del tampón de electroporación puede dar como resultado una mayor eficiencia de transformación) y la forma, la fuerza, el número y la cantidad de pulsos. Estos parámetros eléctricos juegan un papel clave en la eficiencia de la transformación. . [24]
La transformación química o el choque térmico se pueden realizar en una instalación de laboratorio sencilla, lo que normalmente produce eficiencias de transformación que son adecuadas para aplicaciones de clonación y subclonación, aproximadamente 10 6 UFC/μg. Uno de los primeros métodos utilizados fue una combinación de CaCl 2 y MgCl 2 para tratar las células. Sin embargo, estos métodos dieron como resultado eficiencias de transformación, con un máximo de 10 5 - 10 6 unidades formadoras de colonias (UFC) por microgramo de ADN plasmídico. [23] Investigaciones posteriores encontraron que ciertos cationes, como Mn 2+ , Ca 2+ , Ba 2+ , Sr 2+ y Mg 2+ podrían tener un efecto positivo en las eficiencias de transformación, siendo el Mn 2+ el que muestra el mayor efecto. [25]
Algunas células bacterianas tienen sistemas de modificación de restricción que pueden degradar plásmidos exógenos que son extraños a la célula huésped. Esto puede reducir en gran medida la eficiencia de la transformación. [26] [20] Esto se debe a los sistemas de restricción en las células receptoras que atacan y destruyen el ADN exógeno. Estos sistemas reconocen el ADN exógeno basándose en diferencias en los patrones de metilación. Para abordar este problema se han aplicado estrategias como alterar la metilación del ADN exógeno utilizando metilasas comerciales o reducir la actividad de restricción en las células receptoras. [27] [28] Por ejemplo, el uso de mutantes negativos para la metilación o la inactivación temporal del sistema de restricción con calor puede reducir la capacidad de la célula receptora para imponer restricciones al ADN exógeno. [29]
{{cite journal}}: Citar diario requiere |journal=( ayuda )