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Orientación genética

Un gen de ratón quimérico dirigido al gen del color del pelaje agutí , con su descendencia

La selección de genes es una herramienta biotecnológica que se utiliza para cambiar la secuencia de ADN de un organismo (por lo tanto, es una forma de edición genómica ). Se basa en el mecanismo natural de reparación del ADN de la reparación dirigida por homología (HDR), incluida la recombinación homóloga . La selección de genes se puede utilizar para realizar una variedad de tamaños de ediciones de ADN, desde ediciones de ADN más grandes, como la inserción de genes nuevos completos en un organismo, hasta cambios mucho más pequeños en el ADN existente, como un cambio de un solo par de bases. La selección de genes se basa en la presencia de una plantilla de reparación para introducir las ediciones definidas por el usuario en el ADN. El usuario (generalmente un científico) diseñará la plantilla de reparación para que contenga la edición deseada, flanqueada por la secuencia de ADN correspondiente (homóloga) a la región de ADN que el usuario desea editar; por lo tanto, la edición está dirigida a una región genómica particular. De esta manera, la técnica Gene Targeting se distingue de la reparación dirigida por homología natural, durante la cual se utiliza la plantilla de reparación de ADN "natural" de la cromátida hermana para reparar el ADN dañado (la cromátida hermana es la segunda copia del gen). La alteración de la secuencia de ADN en un organismo puede ser útil tanto en un contexto de investigación (por ejemplo, para comprender el papel biológico de un gen) como en biotecnología (por ejemplo, para alterar los rasgos de un organismo, para mejorar las plantas de cultivo).

Métodos

Musgos de Physcomitrella de tipo salvaje y knockout : fenotipos desviados inducidos en transformantes de la biblioteca de alteración genética. Las plantas de Physcomitrella de tipo salvaje y transformadas se cultivaron en medio Knop mínimo para inducir la diferenciación y el desarrollo de gametóforos . Para cada planta, se muestra una vista general (fila superior, la barra de escala corresponde a 1 mm) y un primer plano (fila inferior, la barra de escala equivale a 0,5 mm). A, Planta de musgo de tipo salvaje haploide completamente cubierta de gametóforos frondosos y primer plano de la hoja de tipo salvaje. B–E, Diferentes mutantes. [1]

Para crear un organismo con genes diana, se debe introducir ADN en sus células. Este ADN debe contener todas las partes necesarias para completar la orientación genética. Como mínimo, se trata de la plantilla de reparación de homología, que contiene la edición deseada flanqueada por regiones de ADN homólogas (idénticas en secuencia a) la región diana (estas regiones homólogas se denominan "brazos de homología"). A menudo, también se requiere un gen reportero y/o un marcador seleccionable , para ayudar a identificar y seleccionar células (o "eventos") en los que realmente se ha producido GT. También es una práctica común aumentar las tasas de GT provocando una rotura de doble cadena (DSB) en la región de ADN diana. [2] Por lo tanto, los genes que codifican la nucleasa específica del sitio de interés también pueden transformarse junto con la plantilla de reparación. Estos elementos genéticos necesarios para la GT pueden ensamblarse mediante clonación molecular convencional en bacterias.

Los métodos de selección de genes se han establecido para varios organismos modelo y pueden variar según la especie utilizada. Para seleccionar genes en ratones , el ADN se inserta en células madre embrionarias de ratón en cultivo. Las células con la inserción pueden contribuir al tejido de un ratón mediante la inyección de embriones . Finalmente, se crían ratones quiméricos en los que las células modificadas forman los órganos reproductivos . Después de este paso, todo el cuerpo del ratón se basa en la célula madre embrionaria seleccionada.

Para identificar genes en el musgo , el ADN se incuba junto con protoplastos recién aislados y con polietilenglicol . Como los musgos son organismos haploides , [3] los filamentos del musgo ( protonema ) se pueden analizar directamente para detectar el objetivo, ya sea mediante tratamiento con antibióticos o con PCR . Único entre las plantas , este procedimiento para la genética inversa es tan eficiente como en la levadura . [4] La selección de genes se ha aplicado con éxito al ganado vacuno, las ovejas, los cerdos y muchos hongos.

La frecuencia de selección de genes se puede mejorar significativamente mediante el uso de endonucleasas específicas del sitio, como las nucleasas de dedo de zinc , [5] endonucleasas homing diseñadas , [6] TALENS o, más comúnmente, el sistema CRISPR -Cas. Este método se ha aplicado a especies que incluyen Drosophila melanogaster , [5] tabaco , [7] [8] maíz , [9] células humanas , [10] ratones [11] y ratas . [11]

Comparación con otras formas de ingeniería genética

Un diagrama de Venn para mostrar la relación entre tres tipos de “ingeniería genética”: modificación genética, focalización genética y edición del genoma.

La relación entre la selección de genes, la edición de genes y la modificación genética se describe en el diagrama de Venn que aparece a continuación. Muestra cómo la "ingeniería genética" abarca estas tres técnicas. La edición genómica se caracteriza por realizar pequeñas modificaciones en el genoma en una ubicación específica, a menudo después de cortar la región de ADN objetivo mediante una nucleasa específica del sitio, como CRISPR. [12] La modificación genética generalmente describe la inserción de un transgén (ADN extraño, es decir, un gen de otra especie) en una ubicación aleatoria dentro del genoma. [13] [14] La selección de genes es una herramienta biotecnológica específica que puede conducir a pequeños cambios en el genoma en un sitio específico [2] , en cuyo caso las ediciones causadas por la selección de genes contarían como edición genómica. Sin embargo, la selección de genes también es capaz de insertar genes completos (como transgenes) en el sitio objetivo si el transgén se incorpora a la plantilla de reparación de homología que se utiliza durante la selección de genes. [15] [16] En tales casos, las ediciones causadas por la selección genética se considerarían, en algunas jurisdicciones, equivalentes a una modificación genética, ya que se ha producido la inserción de ADN extraño. [16]

La selección de genes como objetivo es una forma específica de herramienta de edición genómica . Otras herramientas de edición genómica incluyen la mutagénesis dirigida, la edición de bases y la edición de genes primarios , todas las cuales crean ediciones en el ADN endógeno (ADN ya presente en el organismo) en una ubicación genómica específica. [17] [18] Esta naturaleza específica del sitio o "dirigida" de la edición genómica es típicamente lo que hace que la edición genómica sea diferente a la "modificación genética" tradicional que inserta un transgén en una ubicación no específica en el genoma de los organismos, así como la edición genética que realiza pequeñas ediciones en el ADN ya presente en los organismos, versus la inserción de modificación genética de ADN "extraño" de otra especie. [19] [20]

Dado que la edición genética produce cambios más pequeños en el ADN endógeno, muchas mutaciones creadas mediante la edición genómica podrían, en teoría, producirse mediante mutagénesis natural o, en el contexto de las plantas, mediante la reproducción por mutación , que es parte de la reproducción convencional (en contraste, la inserción de un transgén para crear un organismo genéticamente modificado (OGM) no podría producirse de forma natural). Sin embargo, existen excepciones a esta regla general; como se explicó en la introducción, la GT puede introducir una gama de tamaños posibles de ediciones en el ADN; desde ediciones muy pequeñas, como cambiar, insertar o eliminar un par de bases, hasta insertar secuencias de ADN mucho más largas, que en teoría podrían incluir la inserción de un transgén entero. [16] Sin embargo, en la práctica, la GT se utiliza más comúnmente para insertar secuencias más pequeñas. La gama de ediciones posibles a través de la GT puede hacer que sea difícil de regular (véase Regulación).

Posibles resultados de la reparación del ADN después de cortarlo con CRISPR , lo que lleva a la edición genética. Ambas hebras de ADN se cortan con CRISPR-Cas (u otra nucleasa específica del sitio) para crear una rotura de doble cadena (DSB). Luego, la DSB se repara a través de dos vías alternativas de reparación del ADN ( NHEJ o HR ) para dar lugar a mutaciones aleatorias en el sitio de corte ("mutagénesis dirigida") o mutaciones específicas si se proporciona una plantilla de reparación que contenga esas ediciones específicas ("objetivo genético").

Las dos formas más establecidas de edición genética son la selección de genes y la mutagénesis dirigida . Mientras que la selección de genes se basa en la vía de reparación del ADN de reparación dirigida por homología (HDR) (también llamada recombinación homóloga , HR), la mutagénesis dirigida utiliza la unión de extremos no homólogos (NHEJ) del ADN roto. NHEJ es una vía de reparación del ADN propensa a errores, lo que significa que cuando repara el ADN roto puede insertar o eliminar bases de ADN, creando inserciones o deleciones (indels). El usuario no puede especificar cuáles serán estos indels aleatorios, por lo tanto, no puede controlar exactamente qué ediciones se realizan en el sitio objetivo. Sin embargo, puede controlar dónde ocurrirán estas ediciones (es decir, dictar el sitio objetivo) mediante el uso de una nucleasa específica del sitio (anteriormente nucleasas de dedo de zinc y TALENs , ahora comúnmente CRISPR ) para romper el ADN en el sitio objetivo. En la siguiente figura se muestra un resumen de la focalización genética a través de HDR (también llamada recombinación homóloga) y la mutagénesis dirigida a través de NHEJ.

Las técnicas de edición genética más recientemente desarrolladas , la edición primaria y la edición de bases, [18] basadas en los métodos CRISPR-Cas, son alternativas a la selección de genes, que también pueden crear ediciones definidas por el usuario en ubicaciones genómicas específicas. Sin embargo, cada una está limitada en la longitud de inserción de secuencia de ADN posible; la edición de bases está limitada a conversiones de un solo par de bases [21], mientras que la edición primaria solo puede insertar secuencias de hasta ~44 pb. [22] [23] Por lo tanto, la GT sigue siendo el método principal de inserción dirigida (específica de la ubicación) de secuencias largas de ADN para la ingeniería genómica.  

Comparación con el atrapamiento de genes

El atrapamiento de genes se basa en la inserción aleatoria de un casete, mientras que la selección de genes manipula un gen específico. Los casetes se pueden utilizar para muchas cosas diferentes, mientras que las regiones de homología flanqueantes de los casetes de selección de genes deben adaptarse para cada gen. Esto hace que el atrapamiento de genes sea más fácil de manejar para proyectos a gran escala que la selección de genes. Por otro lado, la selección de genes se puede utilizar para genes con transcripciones bajas que pasarían desapercibidos en un análisis de captura. La probabilidad de atrapamiento aumenta con el tamaño del intrón , mientras que para la selección de genes, los genes pequeños se alteran con la misma facilidad.

Aplicaciones

Aplicaciones en sistemas mamíferos

La focalización genética se desarrolló en células de mamíferos en la década de 1980, [24] [25] [26] con diversas aplicaciones posibles como resultado de poder realizar cambios de secuencia específicos en un sitio genómico objetivo, como el estudio de la función genética o la enfermedad humana, particularmente en modelos de ratones. [27] De hecho, la focalización genética se ha utilizado ampliamente para estudiar enfermedades genéticas humanas eliminando (" knocking out ") o agregando (" knocking in ") mutaciones específicas de interés. [28] [29] Anteriormente utilizado para diseñar modelos de células de rata, [30] [31] los avances en tecnologías de focalización genética permiten una nueva ola de modelos isogénicos de enfermedades humanas . Estos modelos son los modelos in vitro más precisos disponibles para los investigadores y facilitan el desarrollo de medicamentos y diagnósticos personalizados, particularmente en oncología . [32] La focalización genética también se ha investigado para la terapia génica para corregir mutaciones causantes de enfermedades. Sin embargo, la baja eficiencia de la entrega de la maquinaria de focalización genética a las células ha dificultado esto, y se han llevado a cabo investigaciones sobre vectores virales para la focalización genética para tratar de abordar estos desafíos. [33]

Aplicaciones en levaduras y musgos

La selección de genes como diana es relativamente eficiente en levaduras, bacterias y musgos (pero es poco común en eucariotas superiores). Por lo tanto, la selección de genes como diana se ha utilizado en enfoques de genética inversa para estudiar la función de los genes en estos sistemas. [34] [35] [36] [37] [38]

Aplicaciones en la ingeniería del genoma vegetal

La selección de genes (GT), o reparación dirigida por homología (HDR), se utiliza rutinariamente en la ingeniería del genoma de plantas para insertar secuencias específicas, [39] con el primer ejemplo publicado de GT en plantas en la década de 1980. [15] Sin embargo, la selección de genes es particularmente desafiante en plantas superiores debido a las bajas tasas de recombinación homóloga, o reparación dirigida por homología, en plantas superiores y la baja tasa de transformación (captación de ADN) por muchas especies de plantas. [40] Sin embargo, ha habido mucho esfuerzo para aumentar las frecuencias de selección de genes en plantas en las últimas décadas, [39] [40] [41] [42] ya que es muy útil poder introducir secuencias específicas en el genoma de la planta para la ingeniería del genoma de la planta. La mejora más significativa en las frecuencias de selección de genes en plantas fue la inducción de roturas de doble cadena a través de nucleasas específicas del sitio como CRISPR, como se describió anteriormente. Otras estrategias incluyen la selección de genes en plantas , mediante la cual la plantilla de reparación de homología se integra en el genoma de la planta y luego se libera mediante corte CRISPR; [43] la regulación positiva de los genes involucrados en la vía de recombinación homóloga; la regulación negativa de la vía competitiva de unión de extremos no homólogos; [39] el aumento del número de copias de la plantilla de reparación homóloga; [44] y la ingeniería de variantes de Cas para optimizarlas para el cultivo de tejidos vegetales. [45] Algunos de estos enfoques también se han utilizado para mejorar la eficiencia de la selección de genes en células de mamíferos. [46]

Entre las plantas que han sido objeto de modificación genética se incluyen Arabidopsis thaliana (la planta modelo más comúnmente utilizada ), arroz, tomate, maíz, tabaco y trigo. [40]

Desafíos técnicos

La selección de genes como diana es una técnica muy prometedora que permite realizar cambios de secuencia definidos por el usuario o inserciones de secuencias en el genoma. Sin embargo, sus principales aplicaciones (modelado de enfermedades humanas e ingeniería del genoma vegetal) se ven obstaculizadas por la baja eficiencia de la recombinación homóloga en comparación con la unión de extremos no homólogos en células de mamíferos y plantas superiores. [47] Como se describió anteriormente, existen estrategias que se pueden emplear para aumentar las frecuencias de selección de genes como diana en plantas y células de mamíferos. [37] Además, los métodos de selección robustos que permiten la selección o el enriquecimiento específico de células en las que se ha producido la selección de genes como diana pueden aumentar las tasas de recuperación de células seleccionadas como diana genética. [48]

Premio Nobel 2007

Mario R. Capecchi , Martin J. Evans y Oliver Smithies recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2007 por su trabajo sobre los "principios para introducir modificaciones genéticas específicas en ratones mediante el uso de células madre embrionarias", o focalización genética. [49]

Regulación de organismos con genes diana

Como se explicó anteriormente, la técnica de la edición genética dirigida es capaz de crear una variedad de tamaños de cambios genéticos, desde mutaciones de un solo par de bases hasta la inserción de secuencias más largas, incluyendo potencialmente transgenes. Esto significa que los productos de la edición genética dirigida pueden ser indistinguibles de la mutación natural, o pueden ser equivalentes a los OGM debido a la inserción de un transgén (ver el diagrama de Venn anterior). Por lo tanto, la regulación de los productos de la edición genética dirigida puede ser un desafío y diferentes países han adoptado diferentes enfoques o están revisando cómo hacerlo como parte de revisiones regulatorias más amplias sobre los productos de la edición genética. [50] [51] [52] Las clasificaciones ampliamente adoptadas dividen los organismos editados genéticamente en 3 clases de "SDN1-3", que hacen referencia a las nucleasas dirigidas al sitio (como CRISPR-Cas) que se utilizan para generar organismos editados genéticamente. [53] [16] Estas clasificaciones de SDN pueden guiar las regulaciones nacionales en cuanto a qué clase de SDN considerarán como "OGM" y, por lo tanto, cuáles están sujetos a regulaciones potencialmente estrictas. 

Históricamente, la Unión Europea (UE) se ha opuesto ampliamente a la tecnología de modificación genética, basándose en su principio de precaución . En 2018, el Tribunal de Justicia de la Unión Europea (TJUE) dictaminó que los cultivos editados genéticamente (incluidos los cultivos con genes específicos) debían considerarse modificados genéticamente [55] y, por lo tanto, estaban sujetos a la Directiva sobre OGM, que impone importantes cargas regulatorias al uso de OGM. Sin embargo, esta decisión fue recibida negativamente por la comunidad científica europea [56] . En 2021, la Comisión Europea consideró que la legislación actual de la UE que regula las técnicas de modificación genética y edición genética (o NGT, por sus siglas en inglés) "no era adecuada para su propósito" y necesitaba adaptarse para reflejar el progreso científico y tecnológico [57] . En julio de 2023, la Comisión Europea publicó una propuesta para cambiar las reglas para ciertos productos de edición genética con el fin de reducir los requisitos regulatorios para los organismos desarrollados con edición genética que contenían cambios genéticos que podrían haber ocurrido de forma natural [58] .

Véase también

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