La historia de la biología molecular comienza en la década de 1930 con la convergencia de varias disciplinas biológicas y físicas que hasta entonces eran distintas: la bioquímica , la genética , la microbiología , la virología y la física . Con la esperanza de comprender la vida en su nivel más fundamental, numerosos físicos y químicos también se interesaron por lo que luego se convertiría en la biología molecular .
En su sentido moderno, la biología molecular intenta explicar los fenómenos de la vida a partir de las propiedades macromoleculares que los generan. Dos categorías de macromoléculas en particular son el foco de atención del biólogo molecular: 1) los ácidos nucleicos , entre los cuales el más famoso es el ácido desoxirribonucleico (o ADN), el constituyente de los genes , y 2) las proteínas , que son los agentes activos de los organismos vivos. Una definición del alcance de la biología molecular es, por lo tanto, caracterizar la estructura, la función y las relaciones entre estos dos tipos de macromoléculas. Esta definición relativamente limitada bastará para permitirnos establecer una fecha para la llamada "revolución molecular", o al menos establecer una cronología de sus desarrollos más fundamentales.
En sus primeras manifestaciones, la biología molecular (nombre acuñado por Warren Weaver, de la Fundación Rockefeller , en 1938 [1] ) era una idea de explicaciones físicas y químicas de la vida, más que una disciplina coherente. Tras el advenimiento de la teoría cromosómica mendeliana de la herencia en la década de 1910 y la maduración de la teoría atómica y la mecánica cuántica en la década de 1920, tales explicaciones parecían estar al alcance. Weaver y otros alentaron (y financiaron) la investigación en la intersección de la biología, la química y la física, mientras que físicos prominentes como Niels Bohr y Erwin Schrödinger dirigieron su atención a la especulación biológica. Sin embargo, en las décadas de 1930 y 1940 no estaba en absoluto claro qué investigación interdisciplinaria (si es que alguna) daría frutos; el trabajo en química coloidal , biofísica y biología de la radiación , cristalografía y otros campos emergentes parecían prometedores.
En 1940, George Beadle y Edward Tatum demostraron la existencia de una relación precisa entre genes y proteínas. [2] En el curso de sus experimentos que conectaban la genética con la bioquímica, cambiaron del pilar de la genética, Drosophila, a un organismo modelo más apropiado , el hongo Neurospora ; la construcción y explotación de nuevos organismos modelo se convertiría en un tema recurrente en el desarrollo de la biología molecular. En 1944, Oswald Avery , trabajando en el Instituto Rockefeller de Nueva York , demostró que los genes están compuestos de ADN [3] (véase el experimento de Avery-MacLeod-McCarty ). En 1952, Alfred Hershey y Martha Chase confirmaron que el material genético del bacteriófago , el virus que infecta a las bacterias, está compuesto de ADN [4] (véase el experimento de Hershey-Chase ). En 1953, James Watson y Francis Crick descubrieron la estructura de doble hélice de la molécula de ADN basándose en los descubrimientos realizados por Rosalind Franklin . [5] En 1961, François Jacob y Jacques Monod demostraron que los productos de ciertos genes regulaban la expresión de otros genes actuando sobre sitios específicos en el borde de esos genes. También plantearon la hipótesis de la existencia de un intermediario entre el ADN y sus productos proteicos, al que llamaron ARN mensajero . [6] Entre 1961 y 1965, se determinó la relación entre la información contenida en el ADN y la estructura de las proteínas: existe un código, el código genético , que crea una correspondencia entre la sucesión de nucleótidos en la secuencia de ADN y una serie de aminoácidos en las proteínas.
En abril de 2023, los científicos, basándose en nuevas evidencias, concluyeron que Rosalind Franklin fue una colaboradora y un "actor igualitario" en el proceso de descubrimiento del ADN, y no lo contrario, como pudo haberse presentado posteriormente después del momento del descubrimiento. [7] [8] [9]
Los principales descubrimientos de la biología molecular se produjeron en un período de sólo veinticinco años. Se necesitaron otros quince años para que nuevas y más sofisticadas tecnologías, reunidas hoy bajo el nombre de ingeniería genética , permitieran aislar y caracterizar genes, en particular los de organismos muy complejos.
Si evaluamos la revolución molecular en el contexto de la historia biológica, es fácil notar que es la culminación de un largo proceso que comenzó con las primeras observaciones a través del microscopio. El objetivo de estos primeros investigadores era comprender el funcionamiento de los organismos vivos describiendo su organización a nivel microscópico. A partir de finales del siglo XVIII, la caracterización de las moléculas químicas que componen los seres vivos ganó cada vez más atención, junto con el nacimiento de la química fisiológica en el siglo XIX, desarrollada por el químico alemán Justus von Liebig y después el nacimiento de la bioquímica a principios del siglo XX, gracias a otro químico alemán , Eduard Buchner . Entre las moléculas estudiadas por los químicos y las minúsculas estructuras visibles al microscopio óptico , como el núcleo celular o los cromosomas, había una zona oscura, "el mundo de las dimensiones ignoradas", como lo llamó el químico-físico Wolfgang Ostwald . Este mundo está poblado de coloides , compuestos químicos cuya estructura y propiedades no estaban bien definidas.
Los éxitos de la biología molecular se derivaron de la exploración de ese mundo desconocido mediante las nuevas tecnologías desarrolladas por químicos y físicos: difracción de rayos X , microscopía electrónica , ultracentrifugación y electroforesis . Estos estudios revelaron la estructura y función de las macromoléculas.
Un hito en ese proceso fue el trabajo de Linus Pauling en 1949, que por primera vez relacionó la mutación genética específica en pacientes con enfermedad de células falciformes con un cambio demostrado en una proteína individual, la hemoglobina en los eritrocitos de individuos heterocigotos u homocigotos .
El desarrollo de la biología molecular es también el encuentro de dos disciplinas que han experimentado un progreso considerable en el transcurso de los primeros treinta años del siglo XX: la bioquímica y la genética. La primera estudia la estructura y la función de las moléculas que componen los seres vivos. Entre 1900 y 1940 se describieron los procesos centrales del metabolismo : el proceso de digestión y la absorción de los elementos nutritivos derivados de la alimentación, como los azúcares. Cada uno de estos procesos está catalizado por una enzima determinada . Las enzimas son proteínas, como los anticuerpos presentes en la sangre o las proteínas responsables de la contracción muscular. En consecuencia, el estudio de las proteínas, de su estructura y síntesis, se convirtió en uno de los principales objetivos de los bioquímicos.
La segunda disciplina de la biología que se desarrolló a principios del siglo XX es la genética. Tras el redescubrimiento de las leyes de Mendel a través de los estudios de Hugo de Vries , Carl Correns y Erich von Tschermak en 1900, esta ciencia empezó a tomar forma gracias a la adopción por parte de Thomas Hunt Morgan , en 1910, de un organismo modelo para los estudios genéticos, la famosa mosca de la fruta ( Drosophila melanogaster ). Poco después, Morgan demostró que los genes se localizan en los cromosomas. Tras este descubrimiento, continuó trabajando con Drosophila y, junto con otros numerosos grupos de investigación, confirmó la importancia del gen en la vida y el desarrollo de los organismos. Sin embargo, la naturaleza química de los genes y sus mecanismos de acción seguían siendo un misterio. Los biólogos moleculares se dedicaron a la determinación de la estructura y la descripción de las complejas relaciones entre genes y proteínas.
El desarrollo de la biología molecular no fue sólo el fruto de una especie de "necesidad" intrínseca a la historia de las ideas, sino que fue un fenómeno típicamente histórico, con todas sus incógnitas, imponderables y contingencias: los notables avances de la física a principios del siglo XX pusieron de relieve el relativo retraso de la evolución de la biología, que se convirtió en la "nueva frontera" en la búsqueda de conocimientos sobre el mundo empírico. Además, los avances de la teoría de la información y de la cibernética en los años cuarenta, en respuesta a las exigencias militares, aportaron a la nueva biología un número significativo de ideas fecundas y, sobre todo, de metáforas.
La elección de las bacterias y de su virus, el bacteriófago, como modelos para el estudio de los mecanismos fundamentales de la vida fue casi natural —son los organismos vivos más pequeños que se conocen— y al mismo tiempo fruto de elecciones individuales. Este modelo debe su éxito, sobre todo, a la fama y al sentido de organización de Max Delbrück , un físico alemán, que supo crear un dinámico grupo de investigación, con sede en Estados Unidos, cuyo ámbito exclusivo era el estudio de los bacteriófagos: el grupo de los fagos . [10]
El grupo de fagos era una red informal de biólogos que llevaba a cabo investigaciones básicas principalmente sobre el bacteriófago T4 e hizo numerosas contribuciones fundamentales a la genética microbiana y los orígenes de la biología molecular a mediados del siglo XX. En 1961, Sydney Brenner , uno de los primeros miembros del grupo de fagos, colaboró con Francis Crick , Leslie Barnett y Richard Watts-Tobin en el Laboratorio Cavendish de Cambridge para realizar experimentos genéticos que demostraron la naturaleza básica del código genético de las proteínas . [11] Estos experimentos, llevados a cabo con mutantes del gen rIIB del bacteriófago T4, mostraron que para un gen que codifica una proteína, tres bases secuenciales del ADN del gen especifican cada aminoácido sucesivo de la proteína. Por lo tanto, el código genético es un código de tripletes, donde cada triplete (llamado codón) especifica un aminoácido particular. También descubrieron que los codones no se superponen entre sí en la secuencia de ADN que codifica una proteína, y que dicha secuencia se lee desde un punto de partida fijo. Durante 1962-1964, los investigadores del fago T4 brindaron la oportunidad de estudiar la función de prácticamente todos los genes que son esenciales para el crecimiento del bacteriófago en condiciones de laboratorio. [12] [13] Estos estudios se vieron facilitados por el descubrimiento de dos clases de mutantes letales condicionales . Una clase de estos mutantes se conoce como mutantes ámbar . [14] Otra clase de mutantes letales condicionales se conoce como mutantes sensibles a la temperatura . [15] Los estudios de estas dos clases de mutantes condujeron a un conocimiento considerable de numerosos problemas biológicos fundamentales. De este modo, se obtuvo una comprensión de las funciones e interacciones de las proteínas empleadas en la maquinaria de replicación del ADN , reparación del ADN y recombinación del ADN . Además, se obtuvo una comprensión de los procesos por los cuales los virus se ensamblan a partir de componentes de proteínas y ácidos nucleicos ( morfogénesis molecular ). También se dilucidó el papel de los codones de terminación de cadena . Un estudio notable utilizó mutantes ámbar defectuosos en el gen que codifica la proteína principal de la cabeza del bacteriófago T4. [16] Este experimento proporcionó evidencia sólida para la "hipótesis de la secuencia", ampliamente aceptada pero aún no demostrada antes de 1964, de que la secuencia de aminoácidos de una proteína está especificada por la secuencia de nucleótidos del gen.Determinación de la proteína. Por lo tanto, este estudio demostró la colinealidad del gen con su proteína codificada.
El panorama geográfico de los desarrollos de la nueva biología estuvo condicionado sobre todo por los trabajos precedentes. Estados Unidos, donde la genética se había desarrollado más rápidamente, y el Reino Unido, donde coexistían investigaciones genéticas y bioquímicas de niveles muy avanzados, estaban en la vanguardia. Alemania, la cuna de las revoluciones en física, con las mejores mentes y los laboratorios de genética más avanzados del mundo, debería haber tenido un papel primordial en el desarrollo de la biología molecular. Pero la historia decidió de otra manera: la llegada de los nazis en 1933 -y, en un grado menos extremo, el endurecimiento de las medidas totalitarias en la Italia fascista- provocó la emigración de un gran número de científicos judíos y no judíos. La mayoría de ellos huyeron a Estados Unidos o al Reino Unido, lo que dio un impulso adicional al dinamismo científico de esas naciones. Estos movimientos acabaron convirtiendo a la biología molecular en una ciencia verdaderamente internacional desde el principio.
El estudio del ADN es una parte central de la biología molecular.
En el siglo XIX, los bioquímicos aislaron inicialmente el ADN y el ARN (mezclados) de los núcleos celulares. Se dieron cuenta con relativa rapidez de la naturaleza polimérica de sus aislados de "ácidos nucleicos", pero recién más tarde se dieron cuenta de que los nucleótidos eran de dos tipos: uno que contenía ribosa y el otro desoxirribosa . Fue este descubrimiento posterior el que llevó a la identificación y denominación del ADN como una sustancia distinta del ARN.
Friedrich Miescher (1844-1895) descubrió en 1869 una sustancia a la que llamó «nucleína». Un poco más tarde, aisló una muestra pura del material que hoy se conoce como ADN del esperma del salmón y, en 1889, su alumno, Richard Altmann , lo denominó «ácido nucleico». Se descubrió que esta sustancia existía únicamente en los cromosomas.
En 1919, Phoebus Levene, del Instituto Rockefeller , identificó los componentes (las cuatro bases, el azúcar y la cadena de fosfato) y demostró que los componentes del ADN estaban unidos en el orden fosfato-azúcar-base. Llamó a cada una de estas unidades nucleótido y sugirió que la molécula de ADN consistía en una cadena de unidades de nucleótidos unidas entre sí a través de los grupos fosfato, que son la "columna vertebral" de la molécula. Sin embargo, Levene pensaba que la cadena era corta y que las bases se repetían en el mismo orden fijo. Torbjörn Caspersson y Einar Hammersten demostraron que el ADN era un polímero.
En 1927, Nikolai Koltsov propuso que los rasgos hereditarios se heredarían a través de una "molécula hereditaria gigante" que estaría formada por "dos cadenas especulares que se replicarían de forma semiconservativa utilizando cada cadena como plantilla". [17] Max Delbrück , Nikolay Timofeev-Ressovsky y Karl G. Zimmer publicaron resultados en 1935 que sugerían que los cromosomas son moléculas muy grandes cuya estructura puede modificarse mediante el tratamiento con rayos X , y que al cambiar así su estructura era posible cambiar las características hereditarias gobernadas por esos cromosomas. En 1937, William Astbury produjo los primeros patrones de difracción de rayos X a partir del ADN. No pudo proponer la estructura correcta, pero los patrones mostraron que el ADN tenía una estructura regular y, por lo tanto, podría ser posible deducir cuál era esta estructura.
En 1943, Oswald Theodore Avery y un equipo de científicos descubrieron que los rasgos propios de la forma "lisa" del neumococo podían transferirse a la forma "rugosa" de la misma bacteria simplemente haciendo que la forma "lisa" (S) muerta estuviera disponible para la forma "rugosa" (R) viva. De manera bastante inesperada, las bacterias vivas del neumococo R se transformaron en una nueva cepa de la forma S, y las características S transferidas resultaron ser hereditarias. Avery llamó al medio de transferencia de rasgos el principio transformador ; identificó al ADN como el principio transformador, y no a la proteína como se pensaba anteriormente. Básicamente, rehizo el experimento de Frederick Griffith . En 1953, Alfred Hershey y Martha Chase realizaron un experimento ( experimento de Hershey-Chase ) que demostró, en el fago T2 , que el ADN es el material genético (Hershey compartió el premio Nobel con Luria).
En la década de 1950, tres grupos se propusieron determinar la estructura del ADN. El primer grupo que empezó fue el del King's College de Londres , dirigido por Maurice Wilkins , al que se unió más tarde Rosalind Franklin . Otro grupo, formado por Francis Crick y James Watson, estaba en Cambridge . Un tercer grupo estaba en Caltech , dirigido por Linus Pauling . Crick y Watson construyeron modelos físicos utilizando varillas y bolas de metal, en los que incorporaron las estructuras químicas conocidas de los nucleótidos, así como la posición conocida de los enlaces que unen un nucleótido con el siguiente a lo largo del polímero. En el King's College, Maurice Wilkins y Rosalind Franklin examinaron los patrones de difracción de rayos X de las fibras de ADN. De los tres grupos, solo el grupo de Londres fue capaz de producir patrones de difracción de buena calidad y, por tanto, producir datos cuantitativos suficientes sobre la estructura.
En 1948, Pauling descubrió que muchas proteínas tenían formas helicoidales (ver hélice alfa ). Pauling había deducido esta estructura a partir de patrones de rayos X y de intentos de modelar físicamente las estructuras. (Más tarde, Pauling también sugeriría una estructura helicoidal de tres cadenas incorrecta del ADN basándose en los datos de Astbury). Incluso en los datos iniciales de difracción del ADN de Maurice Wilkins, era evidente que la estructura implicaba hélices. Pero esta idea era solo el comienzo. Quedaban las preguntas de cuántas hebras se unían, si este número era el mismo para cada hélice, si las bases apuntaban hacia el eje helicoidal o en dirección opuesta y, en última instancia, cuáles eran los ángulos y coordenadas explícitos de todos los enlaces y átomos. Tales preguntas motivaron los esfuerzos de modelado de Watson y Crick.
En su modelado, Watson y Crick se limitaron a lo que consideraban química y biológicamente razonable. Aun así, el abanico de posibilidades era muy amplio. En 1952 se produjo un gran avance, cuando Erwin Chargaff visitó Cambridge e inspiró a Crick con una descripción de los experimentos que Chargaff había publicado en 1947. Chargaff había observado que las proporciones de los cuatro nucleótidos varían entre una muestra de ADN y la siguiente, pero que para determinados pares de nucleótidos (adenina y timina, guanina y citosina), los dos nucleótidos siempre están presentes en proporciones iguales.
Utilizando la difracción de rayos X , así como otros datos de Rosalind Franklin y su información de que las bases estaban apareadas, James Watson y Francis Crick llegaron al primer modelo preciso de la estructura molecular del ADN en 1953, que fue aceptado mediante inspección por Rosalind Franklin. [18] El descubrimiento fue anunciado el 28 de febrero de 1953; el primer artículo de Watson/Crick apareció en Nature el 25 de abril de 1953. Sir Lawrence Bragg , el director del Laboratorio Cavendish , donde trabajaban Watson y Crick, dio una charla en la Escuela de Medicina del Guy's Hospital de Londres el jueves 14 de mayo de 1953, que resultó en un artículo de Ritchie Calder en el News Chronicle de Londres, el viernes 15 de mayo de 1953, titulado "Por qué eres tú. El secreto más cercano de la vida". La noticia llegó a los lectores de The New York Times al día siguiente; Victor K. McElheny , al investigar su biografía, "Watson y el ADN: haciendo una revolución científica", encontró un recorte de un artículo de seis párrafos del New York Times escrito en Londres y fechado el 16 de mayo de 1953, con el titular "Se escanea la forma de la 'unidad de vida' en la célula". El artículo se publicó en una edición temprana y luego se eliminó para hacer espacio para noticias consideradas más importantes. ( El New York Times publicó posteriormente un artículo más largo el 12 de junio de 1953). El periódico de pregrado de la Universidad de Cambridge también publicó su propio artículo breve sobre el descubrimiento el sábado 30 de mayo de 1953. El anuncio original de Bragg en una Conferencia Solvay sobre proteínas en Bélgica el 8 de abril de 1953 no fue publicado por la prensa. En 1962, Watson, Crick y Maurice Wilkins recibieron conjuntamente el Premio Nobel de Fisiología o Medicina por su determinación de la estructura del ADN.
El modelo de Watson y Crick despertó un gran interés inmediatamente después de su presentación. Llegaron a su conclusión el 21 de febrero de 1953 y el 28 de febrero hicieron su primer anuncio. En una influyente presentación en 1957, Crick expuso el " dogma central de la biología molecular ", que predijo la relación entre el ADN, el ARN y las proteínas, y articuló la "hipótesis de la secuencia". En 1958 se produjo una confirmación crítica del mecanismo de replicación que implicaba la estructura de doble hélice en forma del experimento de Meselson-Stahl . El ARN mensajero (ARNm) fue identificado como un intermediario entre las secuencias de ADN y la síntesis de proteínas por Brenner , Meselson y Jacob en 1961. [19] Luego, el trabajo de Crick y colaboradores demostró que el código genético se basaba en tripletes de bases no superpuestos, llamados codones, y Har Gobind Khorana y otros descifraron el código genético poco tiempo después (1966). Estos hallazgos representan el nacimiento de la biología molecular .
Los primeros trabajos sobre biología estructural del ARN coincidieron, más o menos, con los trabajos realizados sobre el ADN a principios de los años 50. En su influyente artículo de 1953, Watson y Crick sugirieron que el amontonamiento de van der Waals por el grupo 2'OH de la ribosa impediría que el ARN adoptara una estructura de doble hélice idéntica al modelo que propusieron, lo que ahora conocemos como ADN en forma B. [20] Esto provocó preguntas sobre la estructura tridimensional del ARN: ¿podría esta molécula formar algún tipo de estructura helicoidal y, de ser así, cómo? Al igual que con el ADN, los primeros trabajos estructurales sobre el ARN se centraron en el aislamiento de polímeros de ARN nativos para el análisis de difracción de fibras. En parte debido a la heterogeneidad de las muestras analizadas, los primeros patrones de difracción de fibras solían ser ambiguos y no fácilmente interpretables. En 1955, Marianne Grunberg-Manago y sus colegas publicaron un artículo que describía la enzima polinucleótido fosforilasa , que escindía un grupo fosfato de los difosfatos de nucleótidos para catalizar su polimerización. [21] Este descubrimiento permitió a los investigadores sintetizar polímeros de nucleótidos homogéneos, que luego combinaron para producir moléculas de doble cadena. Estas muestras produjeron los patrones de difracción de fibras más fácilmente interpretables obtenidos hasta el momento, lo que sugiere una estructura helicoidal ordenada para el ARN cognado de doble cadena que difería de la observada en el ADN. Estos resultados allanaron el camino para una serie de investigaciones sobre las diversas propiedades y propensiones del ARN. A finales de la década de 1950 y principios de la de 1960, se publicaron numerosos artículos sobre diversos temas de la estructura del ARN, incluida la hibridación ARN-ADN, [22] ARN de triple cadena, [23] e incluso cristalografía a pequeña escala de dinucleótidos de ARN (GC y AU) en disposiciones primitivas similares a hélices. [24] Para una revisión más profunda de los primeros trabajos en biología estructural del ARN, consulte el artículo The Era of RNA Awakening: Structural biology of RNA in the early years de Alexander Rich . [25]
A mediados de los años 1960, se estaba estudiando intensamente el papel del ARNt en la síntesis de proteínas. En ese momento, los ribosomas ya habían sido implicados en la síntesis de proteínas y se había demostrado que una cadena de ARNm era necesaria para la formación de estas estructuras. En una publicación de 1964, Warner y Rich demostraron que los ribosomas activos en la síntesis de proteínas contenían moléculas de ARNt unidas en los sitios A y P, y discutieron la noción de que estas moléculas ayudaban en la reacción de la peptidil transferasa . [26] Sin embargo, a pesar de la considerable caracterización bioquímica, la base estructural de la función del ARNt seguía siendo un misterio. En 1965, Holley et al. purificaron y secuenciaron la primera molécula de ARNt, proponiendo inicialmente que adoptaba una estructura de hoja de trébol, basada principalmente en la capacidad de ciertas regiones de la molécula para formar estructuras de tallo y bucle. [27] El aislamiento del ARNt resultó ser el primer gran logro en la biología estructural del ARN. Tras la publicación de Robert W. Holley , numerosos investigadores comenzaron a trabajar en el aislamiento de ARNt para el estudio cristalográfico, desarrollando métodos mejorados para aislar la molécula mientras trabajaban. En 1968, varios grupos habían producido cristales de ARNt, pero estos demostraron ser de calidad limitada y no arrojaron datos con las resoluciones necesarias para determinar la estructura. [28] En 1971, Kim et al. lograron otro avance, produciendo cristales de ARNt PHE de levadura que difractaban a resoluciones de 2-3 Ångström utilizando espermina , una poliamina natural , que se unía al ARNt y lo estabilizaba. [29] Sin embargo, a pesar de tener cristales adecuados, la estructura del ARNt PHE no se resolvió inmediatamente con alta resolución; más bien, se necesitó un trabajo pionero en el uso de derivados de metales pesados y mucho más tiempo para producir un mapa de densidad de alta calidad de la molécula completa. En 1973, Kim et al. produjeron un mapa de 4 Ångström de la molécula de ARNt en el que pudieron rastrear inequívocamente toda la cadena principal. [30] Esta solución sería seguida por muchas más, a medida que varios investigadores trabajaban para refinar la estructura y, de ese modo, dilucidar más a fondo los detalles de las interacciones de apareamiento y apilamiento de bases, y validar la arquitectura publicada de la molécula.
La estructura del ARNt PHE es notable en el campo de la estructura de los ácidos nucleicos en general, ya que representó la primera solución de una estructura de ácido nucleico de cadena larga de cualquier tipo (ARN o ADN), precediendo a la solución de Richard E. Dickerson de un dodecámero en forma B por casi una década. [31] Además, el ARNt PHE demostró muchas de las interacciones terciarias observadas en la arquitectura del ARN que no se categorizarían ni se comprenderían más a fondo durante los años venideros, proporcionando una base para toda la investigación estructural del ARN futura.
Durante un tiempo considerable después de las primeras estructuras de ARNt, el campo de la estructura del ARN no avanzó dramáticamente. La capacidad de estudiar una estructura de ARN dependía del potencial para aislar el ARN diana. Esto resultó limitante para el campo durante muchos años, en parte porque otros objetivos conocidos (es decir, el ribosoma) eran significativamente más difíciles de aislar y cristalizar. Además, debido a que simplemente no se habían identificado otros objetivos de ARN interesantes, o no se entendían lo suficiente como para considerarlos interesantes, simplemente faltaban cosas para estudiar estructuralmente. Como tal, durante unos veinte años después de la publicación original de la estructura PHE del ARNt , solo se resolvieron las estructuras de un puñado de otros objetivos de ARN, y casi todos ellos pertenecían a la familia del ARN de transferencia. [32] Esta desafortunada falta de alcance eventualmente se superaría en gran parte debido a dos avances importantes en la investigación de ácidos nucleicos: la identificación de ribozimas y la capacidad de producirlos mediante transcripción in vitro .
Posteriormente a la publicación de Tom Cech que implicaba al intrón del grupo I de Tetrahymena como ribozima autocatalítica, [33] y el informe de Sidney Altman sobre la catálisis por ARN ribonucleasa P , [34] se identificaron varios otros ARN catalíticos a fines de la década de 1980, [35] incluyendo la ribozima cabeza de martillo . En 1994, McKay et al. publicaron la estructura de un 'complejo inhibidor de ribozima de ARN-ADN cabeza de martillo ' con una resolución de 2,6 Ångström, en el que la actividad autocatalítica de la ribozima se interrumpió mediante la unión a un sustrato de ADN. [36] La conformación de la ribozima publicada en este artículo finalmente demostró ser uno de varios estados posibles, y aunque esta muestra en particular era catalíticamente inactiva, estructuras posteriores han revelado su arquitectura de estado activo. Esta estructura fue seguida por la publicación de Jennifer Doudna de la estructura de los dominios P4-P6 del intrón del grupo I de Tetrahymena , un fragmento de la ribozima que originalmente se hizo famosa por Cech. [37] La segunda cláusula en el título de esta publicación —Principios del empaquetamiento del ARN— evidencia de manera concisa el valor de estas dos estructuras: por primera vez, se pudieron hacer comparaciones entre estructuras de ARNt bien descritas y aquellas de ARN globulares fuera de la familia de transferencia. Esto permitió construir el marco de categorización para la estructura terciaria del ARN. Ahora era posible proponer la conservación de motivos, pliegues y varias interacciones estabilizadoras locales. Para una revisión temprana de estas estructuras y sus implicaciones, véase RNA FOLDS: Insights from recent crystal structures , de Doudna y Ferre-D'Amare. [38]
Además de los avances que se estaban logrando en la determinación de la estructura global mediante cristalografía, a principios de los años 1990 también se vio la implementación de la RMN como una técnica poderosa en la biología estructural del ARN. Coincidiendo con las estructuras de ribozimas a gran escala que se resolvían cristalográficamente, se resolvieron varias estructuras de ARN pequeños y ARN complejos con fármacos y péptidos mediante RMN. [39] Además, la RMN ahora se estaba utilizando para investigar y complementar las estructuras cristalinas, como lo ejemplifica la determinación de una estructura aislada de motivo de receptor de tetraloop publicada en 1997. [40] Investigaciones como esta permitieron una caracterización más precisa de las interacciones de apareamiento de bases y apilamiento de bases que estabilizaron los pliegues globales de grandes moléculas de ARN. La importancia de comprender los motivos estructurales terciarios del ARN fue proféticamente bien descrita por Michel y Costa en su publicación en la que identificaron el motivo tetraloop : "...no debería sorprendernos que las moléculas de ARN autoplegables hicieran un uso intensivo de solo un conjunto relativamente pequeño de motivos terciarios. Identificar estos motivos ayudaría enormemente a las empresas de modelado, que seguirán siendo esenciales mientras la cristalización de ARN grandes siga siendo una tarea difícil". [41]
El resurgimiento de la biología estructural del ARN a mediados de la década de 1990 ha provocado una verdadera explosión en el campo de la investigación estructural de los ácidos nucleicos. Desde la publicación de las estructuras hammerhead y P 4-6 , se han realizado numerosas contribuciones importantes al campo. Algunos de los ejemplos más notables incluyen las estructuras de los intrones del Grupo I y del Grupo II , [42] y el ribosoma resuelto por Nenad Ban y colegas en el laboratorio de Thomas Steitz . [43] Las primeras tres estructuras se produjeron utilizando transcripción in vitro , y esa RMN ha desempeñado un papel en la investigación de componentes parciales de las cuatro estructuras, testimonio de la indispensabilidad de ambas técnicas para la investigación del ARN. Más recientemente, el Premio Nobel de Química de 2009 fue otorgado a Ada Yonath , Venkatraman Ramakrishnan y Thomas Steitz por su trabajo estructural sobre el ribosoma, lo que demuestra el papel destacado que ha tenido la biología estructural del ARN en la biología molecular moderna.
Las proteínas fueron reconocidas como una clase distinta de moléculas biológicas en el siglo XVIII por Antoine Fourcroy y otros. Los miembros de esta clase (llamados "albuminoides", Eiweisskörper o matières albuminoides ) fueron reconocidos por su capacidad de coagularse o flocular bajo diversos tratamientos como el calor o el ácido; ejemplos bien conocidos a principios del siglo XIX incluían la albúmina de clara de huevo , la albúmina del suero sanguíneo , la fibrina y el gluten de trigo . La similitud entre la cocción de las claras de huevo y la cuajada de la leche se reconoció incluso en la antigüedad; por ejemplo, el nombre de albúmina para la proteína de la clara de huevo fue acuñado por Plinio el Viejo a partir del latín albus ovi (clara de huevo).
Con el asesoramiento de Jöns Jakob Berzelius , el químico holandés Gerhardus Johannes Mulder realizó análisis elementales de proteínas animales y vegetales comunes. Para sorpresa de todos, todas las proteínas tenían casi la misma fórmula empírica , aproximadamente C 400 H 620 N 100 O 120 con átomos individuales de azufre y fósforo. Mulder publicó sus hallazgos en dos artículos (1837, 1838) y planteó la hipótesis de que existía una sustancia básica ( Grundstoff ) de las proteínas, y que era sintetizada por las plantas y absorbida por los animales durante la digestión. Berzelius fue uno de los primeros defensores de esta teoría y propuso el nombre de "proteína" para esta sustancia en una carta fechada el 10 de julio de 1838.
El nombre proteína que él propone para el óxido orgánico de fibrina y albúmina , lo quise derivar de [la palabra griega ] πρωτειος, porque parece ser la sustancia primitiva o principal de la nutrición animal.
Mulder continuó identificando los productos de la degradación de proteínas, como el aminoácido leucina , para el que encontró un peso molecular (casi correcto) de 131 Da .
El peso molecular mínimo sugerido por los análisis de Mulder fue de aproximadamente 9 kDa , cientos de veces más grande que otras moléculas en estudio. Por lo tanto, la estructura química de las proteínas (su estructura primaria ) fue un área activa de investigación hasta 1949, cuando Fred Sanger secuenció la insulina . La teoría (correcta) de que las proteínas eran polímeros lineales de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos fue propuesta de forma independiente y simultánea por Franz Hofmeister y Emil Fischer en la misma conferencia en 1902. Sin embargo, algunos científicos eran escépticos de que macromoléculas tan largas pudieran ser estables en solución. En consecuencia, se propusieron numerosas teorías alternativas de la estructura primaria de las proteínas, por ejemplo, la hipótesis coloidal de que las proteínas eran ensamblajes de moléculas pequeñas, la hipótesis del ciclol de Dorothy Wrinch , la hipótesis de la dicetopiperazina de Emil Abderhalden y la hipótesis del pirrol/piperidina de Troensgard (1942). La mayoría de estas teorías tenían dificultades para explicar el hecho de que la digestión de las proteínas producía péptidos y aminoácidos . Theodor Svedberg demostró finalmente que las proteínas son macromoléculas de composición bien definida (y no mezclas coloidales) mediante ultracentrifugación analítica . La posibilidad de que algunas proteínas sean asociaciones no covalentes de dichas macromoléculas fue demostrada por Gilbert Smithson Adair (mediante la medición de la presión osmótica de la hemoglobina ) y, más tarde, por Frederic M. Richards en sus estudios sobre la ribonucleasa S. La espectrometría de masas de proteínas ha sido durante mucho tiempo una técnica útil para identificar modificaciones postraduccionales y, más recientemente, para investigar la estructura de las proteínas.
La mayoría de las proteínas son difíciles de purificar en cantidades superiores a un miligramos, incluso utilizando los métodos más modernos. Por lo tanto, los primeros estudios se centraron en las proteínas que podían purificarse en grandes cantidades, por ejemplo, las de la sangre , la clara de huevo , varias toxinas y las enzimas digestivas/metabólicas obtenidas de los mataderos . Durante la Segunda Guerra Mundial se desarrollaron muchas técnicas de purificación de proteínas en un proyecto dirigido por Edwin Joseph Cohn para purificar las proteínas de la sangre para ayudar a mantener con vida a los soldados. A finales de la década de 1950, la Armour Hot Dog Co. purificó 1 kg (= un millón de miligramos) de ribonucleasa A pancreática bovina pura y la puso a disposición de científicos de todo el mundo a bajo coste. [44] Este generoso acto convirtió a la ARNasa A en la principal proteína de la investigación básica durante las siguientes décadas, lo que dio lugar a varios premios Nobel.
El estudio del plegamiento de proteínas comenzó en 1910 con un famoso artículo de Harriette Chick y CJ Martin , en el que demostraron que la floculación de una proteína estaba compuesta por dos procesos distintos: la precipitación de una proteína a partir de una solución estaba precedida por otro proceso llamado desnaturalización , en el que la proteína se volvía mucho menos soluble, perdía su actividad enzimática y se volvía más reactiva químicamente. A mediados de la década de 1920, Tim Anson y Alfred Mirsky propusieron que la desnaturalización era un proceso reversible, una hipótesis correcta que inicialmente fue ridiculizada por algunos científicos como "deshervir el huevo". Anson también sugirió que la desnaturalización era un proceso de dos estados ("todo o nada"), en el que una transición molecular fundamental daba como resultado cambios drásticos en la solubilidad, la actividad enzimática y la reactividad química; señaló además que los cambios de energía libre tras la desnaturalización eran mucho menores que los que suelen estar involucrados en las reacciones químicas. En 1929, Hsien Wu planteó la hipótesis de que la desnaturalización era el desdoblamiento de las proteínas, un cambio puramente conformacional que daba como resultado la exposición de las cadenas laterales de los aminoácidos al disolvente. Según esta hipótesis (correcta), la exposición de las cadenas laterales alifáticas y reactivas al disolvente hacía que la proteína fuera menos soluble y más reactiva, mientras que la pérdida de una conformación específica causaba la pérdida de la actividad enzimática. Aunque se consideró plausible, la hipótesis de Wu no fue aceptada de inmediato, ya que se sabía muy poco sobre la estructura y la enzimología de las proteínas y otros factores podían explicar los cambios en la solubilidad, la actividad enzimática y la reactividad química. A principios de la década de 1960, Chris Anfinsen demostró que el plegamiento de la ribonucleasa A era completamente reversible sin necesidad de cofactores externos, verificando así la "hipótesis termodinámica" del plegamiento de proteínas de que el estado plegado representa el mínimo global de energía libre para la proteína.
La hipótesis del plegamiento de proteínas fue seguida por la investigación de las interacciones físicas que estabilizan las estructuras proteicas plegadas. El papel crucial de las interacciones hidrofóbicas fue hipotetizado por Dorothy Wrinch e Irving Langmuir , como un mecanismo que podría estabilizar sus estructuras de ciclol . Aunque apoyada por JD Bernal y otros, esta hipótesis (correcta) fue rechazada junto con la hipótesis del ciclol, que fue refutada en la década de 1930 por Linus Pauling (entre otros). En cambio, Pauling defendió la idea de que la estructura de las proteínas se estabilizaba principalmente por enlaces de hidrógeno , una idea propuesta inicialmente por William Astbury (1933). Sorprendentemente, la teoría incorrecta de Pauling sobre los enlaces de hidrógeno resultó en sus modelos correctos para los elementos de estructura secundaria de las proteínas, la hélice alfa y la lámina beta . La interacción hidrofóbica fue restaurada a su prominencia correcta por un famoso artículo en 1959 de Walter Kauzmann sobre la desnaturalización, basado en parte en el trabajo de Kaj Linderstrøm-Lang . La naturaleza iónica de las proteínas fue demostrada por Bjerrum, Weber y Arne Tiselius , pero Linderstrom-Lang demostró que las cargas eran generalmente accesibles al solvente y no estaban unidas entre sí (1949).
La estructura secundaria y terciaria de baja resolución de las proteínas globulares se investigó inicialmente mediante métodos hidrodinámicos, como la ultracentrifugación analítica y la birrefringencia de flujo . Los métodos espectroscópicos para investigar la estructura de las proteínas (como el dicroísmo circular , la fluorescencia, la absorbancia en el ultravioleta cercano y el infrarrojo) se desarrollaron en la década de 1950. Las primeras estructuras de proteínas con resolución atómica se resolvieron mediante cristalografía de rayos X en la década de 1960 y mediante RMN en la década de 1980. A partir de 2019 , el Protein Data Bank tiene más de 150.000 estructuras de proteínas con resolución atómica. En tiempos más recientes, la microscopía crioelectrónica de grandes conjuntos macromoleculares ha alcanzado la resolución atómica, y la predicción computacional de la estructura de proteínas de pequeños dominios proteicos se está acercando a la resolución atómica. [actualizar]
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