Ras , de " virus de la rata ", es una familia de proteínas relacionadas que se expresan en todos los linajes celulares y órganos animales. Todos los miembros de la familia de proteínas Ras pertenecen a una clase de proteína llamada GTPasa pequeña y están involucrados en la transmisión de señales dentro de las células ( transducción de señales celulares ). Ras es el miembro prototípico de la superfamilia de proteínas Ras , que están todas relacionadas en la estructura tridimensional y regulan diversos comportamientos celulares.
Cuando Ras se activa mediante señales entrantes, posteriormente activa otras proteínas, que en última instancia activan genes involucrados en el crecimiento , la diferenciación y la supervivencia celular . Las mutaciones en los genes Ras pueden conducir a la producción de proteínas Ras activadas permanentemente, lo que puede causar una señalización no deseada e hiperactiva dentro de la célula, incluso en ausencia de señales entrantes.
Debido a que estas señales dan lugar al crecimiento y la división celular, la señalización hiperactiva de Ras puede, en última instancia, provocar cáncer . [1] Los tres genes Ras en humanos ( HRAS , KRAS y NRAS ) son los oncogenes más comunes en el cáncer humano; las mutaciones que activan permanentemente Ras se encuentran en el 20 al 25 % de todos los tumores humanos y hasta en el 90 % en ciertos tipos de cáncer (p. ej., cáncer de páncreas ). [2] Por este motivo, se están estudiando los inhibidores de Ras como tratamiento para el cáncer y otras enfermedades con sobreexpresión de Ras.
Los dos primeros genes Ras, HRAS y KRAS , fueron identificados [3] a partir de estudios de dos virus causantes de cáncer, el virus del sarcoma de Harvey y el virus del sarcoma de Kirsten, por Edward M. Scolnick y colegas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). [4] Estos virus fueron descubiertos originalmente en ratas durante la década de 1960 por Jennifer Harvey [5] y Werner H. Kirsten , [6] respectivamente, de ahí el nombre de Ra ts arcoma . [ 3] En 1982, los genes ras humanos activados y transformadores fueron descubiertos en células cancerosas humanas por Geoffrey M. Cooper en Harvard, [7] Mariano Barbacid y Stuart A. Aaronson en el NIH, [8] Robert Weinberg en el MIT, [9] y Michael Wigler en el Laboratorio Cold Spring Harbor. [10] Un tercer gen ras fue descubierto posteriormente por investigadores del grupo de Robin Weiss en el Instituto de Investigación del Cáncer , [11] [12] y Michael Wigler en el Laboratorio Cold Spring Harbor, [13] llamado NRAS , por su identificación inicial en células de neuroblastoma humano.
Los tres genes ras humanos codifican proteínas extremadamente similares formadas por cadenas de 188 a 189 aminoácidos. Sus símbolos genéticos son HRAS , NRAS y KRAS , el último de los cuales produce las isoformas K-Ras4A y K-Ras4B a partir de un empalme alternativo . [ cita requerida ]
Ras contiene seis cadenas beta y cinco hélices alfa . [14] Consta de dos dominios: un dominio G de 166 aminoácidos (aproximadamente 20 kDa) que se une a los nucleótidos de guanosina, y una región de orientación de membrana C-terminal (CAAX-COOH, también conocida como caja CAAX), que está modificada por lípidos mediante la farnesil transferasa , RCE1 e ICMT . [ cita requerida ]
El dominio G contiene cinco motivos G que se unen directamente a GDP/GTP. El motivo G1, o bucle P, se une al fosfato beta de GDP y GTP. El motivo G2, también llamado Switch I o SW1, contiene treonina35, que se une al fosfato terminal (γ-fosfato) de GTP y al ion magnesio divalente unido en el sitio activo. El motivo G3, también llamado Switch II o SW2, tiene un motivo DXXGQ. La D es aspartato57, que es específico para la unión de guanina frente a adenina, y la Q es glutamina61, el residuo crucial que activa una molécula de agua catalítica para la hidrólisis de GTP a GDP. El motivo G4 contiene un motivo LVGNKxDL y proporciona una interacción específica con la guanina. El motivo G5 contiene una secuencia de consenso SAK. La A es alanina146, que proporciona especificidad para la guanina en lugar de la adenina.
Los dos motivos de cambio, G2 (SW1) y G3 (SW2), son las partes principales de la proteína que se mueven cuando el GTP se hidroliza en GDP. Este cambio conformacional de los dos motivos de cambio es lo que media la funcionalidad básica como proteína de cambio molecular. Este estado de Ras unido a GTP es el estado "activado", y el estado unido a GDP es el estado "desactivado". Los dos motivos de cambio tienen varias conformaciones cuando se unen a GTP o GDP o no se unen a ningún nucleótido (cuando se unen a SOS1, que libera el nucleótido). [15]
Ras también se une a un ion magnesio que ayuda a coordinar la unión de nucleótidos.
Las proteínas Ras funcionan como interruptores moleculares binarios que controlan las redes de señalización intracelular. Las vías de señalización reguladas por Ras controlan procesos como la integridad del citoesqueleto de actina , la proliferación celular , la diferenciación celular , la adhesión celular , la apoptosis y la migración celular . Las proteínas Ras y relacionadas con Ras suelen estar desreguladas en los cánceres, lo que conduce a un aumento de la invasión y la metástasis y a una disminución de la apoptosis.
Ras activa varias vías, de las cuales la cascada de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAP) ha sido bien estudiada. Esta cascada transmite señales en sentido descendente y da como resultado la transcripción de genes involucrados en el crecimiento y la división celular. [16] Otra vía de señalización activada por Ras es la vía PI3K/AKT/mTOR , que estimula la síntesis de proteínas, la migración y el crecimiento celular e inhibe la apoptosis. [17] [18]
Ras es una proteína que se une a los nucleótidos de guanosina . Específicamente, es una GTPasa pequeña de una sola subunidad , que está relacionada en estructura con la subunidad G α de las proteínas G heterotriméricas (GTPasas grandes). Las proteínas G funcionan como interruptores de señalización binarios con estados "encendido" y "apagado". En el estado "apagado" está unido al nucleótido guanosina difosfato (GDP), mientras que en el estado "encendido", Ras está unido al guanosina trifosfato (GTP), que tiene un grupo fosfato adicional en comparación con el GDP. Este fosfato adicional mantiene las dos regiones de interruptor en una configuración de "resorte cargado" (específicamente Thr-35 y Gly-60). Cuando se liberan, las regiones de interruptor se relajan, lo que provoca un cambio conformacional al estado inactivo. Por lo tanto, la activación y desactivación de Ras y otras proteínas G pequeñas se controlan mediante el ciclo entre las formas activas unidas a GTP y las inactivas unidas a GDP.
El proceso de intercambio del nucleótido unido se ve facilitado por los factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) y las proteínas activadoras de GTPasa (GAP). Según su clasificación, Ras tiene una actividad GTPasa intrínseca , lo que significa que la proteína por sí sola hidrolizará una molécula de GTP unida en GDP. Sin embargo, este proceso es demasiado lento para una función eficiente y, por lo tanto, la GAP para Ras, RasGAP, puede unirse a la maquinaria catalítica de Ras y estabilizarla, suministrando residuos catalíticos adicionales (" dedo de arginina ") de modo que una molécula de agua esté posicionada de manera óptima para el ataque nucleofílico al gamma-fosfato de GTP. Se libera un fosfato inorgánico y la molécula de Ras ahora está unida a un GDP. Dado que la forma unida a GDP está "apagada" o "inactiva" para la señalización, la proteína activadora de GTPasa inactiva Ras activando su actividad GTPasa. Por lo tanto, las GAP aceleran la inactivación de Ras .
Los GEF catalizan una reacción de "empujar y tirar" que libera GDP de Ras. Se insertan cerca del bucle P y del sitio de unión del catión magnesio e inhiben la interacción de estos con el anión gamma fosfato . Los residuos ácidos (negativos) en el interruptor II "tiran" de una lisina en el bucle P lejos del GDP que "empuja" al interruptor I lejos de la guanina. Los contactos que mantienen al GDP en su lugar se rompen y se libera en el citoplasma. Debido a que el GTP intracelular es abundante en relación con el GDP (aproximadamente 10 veces más) [16] GTP reingresa predominantemente al bolsillo de unión de nucleótidos de Ras y recarga el resorte. Por lo tanto, los GEF facilitan la activación de Ras . [14] Los GEF bien conocidos incluyen Son of Sevenless (Sos) y cdc25 que incluyen el dominio RasGEF .
El equilibrio entre la actividad de GEF y GAP determina el estado del nucleótido de guanina de Ras, regulando así la actividad de Ras.
En la conformación unida a GTP, Ras tiene una alta afinidad por numerosos efectores que le permiten llevar a cabo sus funciones. Estos incluyen PI3K . Otras GTPasas pequeñas pueden unirse a adaptadores como la arfaptina o sistemas de segundos mensajeros como la adenilil ciclasa . El dominio de unión de Ras se encuentra en muchos efectores y se une invariablemente a una de las regiones de conmutación, porque estas cambian de conformación entre las formas activa e inactiva. Sin embargo, también pueden unirse al resto de la superficie de la proteína.
Existen otras proteínas que pueden cambiar la actividad de las proteínas de la familia Ras. Un ejemplo es el GDI (inhibidor de la disociación de GDP). Estos actúan retardando el intercambio de GDP por GTP, prolongando así el estado inactivo de los miembros de la familia Ras. Es posible que existan otras proteínas que aumenten este ciclo.
Ras se une a la membrana celular debido a su prenilación y palmitoilación ( HRAS y NRAS ) o la combinación de prenilación y una secuencia polibásica adyacente al sitio de prenilación ( KRAS ). La caja CaaX C-terminal de Ras primero se farnesila en su residuo Cys en el citosol, lo que permite que Ras se inserte libremente en la membrana del retículo endoplasmático y otras membranas celulares. Luego, el tripéptido (aaX) se escinde del extremo C por una endoproteasa específica de la proteína prenil y el nuevo extremo C es metilado por una metiltransferasa . El procesamiento de KRas se completa en esta etapa. Las interacciones electrostáticas dinámicas entre su secuencia básica cargada positivamente con cargas negativas en la hoja interna de la membrana plasmática explican su localización predominante en la superficie celular en estado estacionario. NRAS y HRAS se procesan aún más en la superficie del aparato de Golgi mediante palmitoilación de uno o dos residuos de Cys, respectivamente, adyacentes a la caja CaaX. De este modo, las proteínas se anclan de forma estable a la membrana (balsas lipídicas) y se transportan a la membrana plasmática en vesículas de la vía secretora . La despalmitoilación por las tioesterasas de acil-proteína finalmente libera las proteínas de la membrana, lo que les permite entrar en otro ciclo de palmitoilación y despalmitoilación. [19] Se cree que este ciclo evita la fuga de NRAS y HRAS a otras membranas a lo largo del tiempo y mantiene su localización en estado estable a lo largo del aparato de Golgi , la vía secretora , la membrana plasmática y la vía de endocitosis interconectada .
Los miembros clínicamente más notables de la subfamilia Ras son HRAS , KRAS y NRAS , principalmente por estar implicados en muchos tipos de cáncer. [20]
Sin embargo, también hay muchos otros miembros de esta subfamilia: [21] DIRAS1 ; DIRAS2; DIRAS3 ; ERAS; GEM ; MRAS ; NKIRAS1; NKIRAS2 ; RALA ; RALB ; RAP1A ; RAP1B ; RAP2A ; RAP2B ; RAP2C; RASD1 ; RASD2 ; RASL10A; RASL10B; RASL11A; RASL11B ; RASL12; REM1; REM2; RERG ; RERGL; RRAD ; RRAS ; RRAS2
Las mutaciones en la familia Ras de protooncogenes (que comprende H-Ras, N-Ras y K-Ras) son muy comunes y se encuentran en el 20% al 30% de todos los tumores humanos. [20] Es razonable especular que un enfoque farmacológico que reduzca la actividad de Ras puede representar un posible método para inhibir ciertos tipos de cáncer. Las mutaciones puntuales de Ras son la anomalía más común de los protooncogenes humanos. [22] El inhibidor de Ras, ácido transfarnesiltiosalicílico (FTS, Salirasib), exhibe profundos efectos anticogénicos en muchas líneas celulares cancerosas. [23] [24]
Se ha demostrado que la activación inapropiada del gen desempeña un papel clave en la transducción inadecuada de señales, la proliferación y la transformación maligna. [16]
Las mutaciones en varios genes diferentes, así como en el propio RAS, pueden tener este efecto. Los oncogenes como p210BCR-ABL o el receptor de crecimiento erbB se encuentran aguas arriba de Ras, por lo que si se activan de forma constitutiva, sus señales se transducirán a través de Ras. [ cita requerida ]
El gen supresor tumoral NF1 codifica un gen Ras-GAP; su mutación en la neurofibromatosis implica que es menos probable que Ras se inactive. Ras también puede amplificarse, aunque esto solo ocurre ocasionalmente en los tumores.
Finalmente, los oncogenes Ras pueden ser activados por mutaciones puntuales, de modo que la reacción de la GTPasa ya no puede ser estimulada por GAP; esto aumenta la vida media de los mutantes Ras-GTP activos. [25]
Ras constitutivamente activo ( Ras D ) es aquel que contiene mutaciones que impiden la hidrólisis de GTP, bloqueando así a Ras en un estado permanentemente "encendido".
Las mutaciones más comunes se encuentran en el residuo G12 del bucle P y en el residuo catalítico Q61.
Véase también mutantes "dominantes negativos" como S17N y D119N.
Se observó que el reovirus era un posible agente terapéutico contra el cáncer cuando los estudios sugirieron que se reproduce bien en ciertas líneas celulares cancerosas. Se replica específicamente en células que tienen una vía Ras activada (una vía de señalización celular que está involucrada en el crecimiento y la diferenciación celular). [27] El reovirus se replica y finalmente mata las células tumorales activadas por Ras y, a medida que se produce la muerte celular, las partículas virales de la progenie quedan libres para infectar las células cancerosas circundantes. Se cree que este ciclo de infección, replicación y muerte celular se repite hasta que se destruyen todas las células tumorales que tienen una vía Ras activada. [ cita requerida ]
Otro virus que lisa los tumores y que se dirige específicamente a las células tumorales con una vía Ras activada es un agente basado en el virus del herpes simple tipo II (HSV-2), denominado FusOn-H2. [28] Las mutaciones activadoras de la proteína Ras y de los elementos anteriores de la proteína Ras pueden desempeñar un papel en más de dos tercios de todos los cánceres humanos, incluida la mayoría de las enfermedades metastásicas. La reolisina , una formulación del reovirus, y FusOn-H2 se encuentran actualmente en ensayos clínicos o en desarrollo para el tratamiento de varios tipos de cáncer. [29] Además, un tratamiento basado en siRNA anti- K-RAS mutado (G12D) llamado siG12D LODER se encuentra actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer de páncreas localmente avanzado (NCT01188785, NCT01676259). [30]
En modelos de glioblastoma en ratones, los niveles de SHP2 aumentaron en las células cerebrales cancerosas. La inhibición de SHP2 a su vez inhibió la desfosforilación de Ras. Esto redujo el tamaño de los tumores y el consiguiente aumento de las tasas de supervivencia. [31] [32]
Otras estrategias han intentado manipular la regulación de la localización de Ras mencionada anteriormente. Se han desarrollado inhibidores de la farnesiltransferasa para detener la farnesilación de Ras y, por lo tanto, debilitar su afinidad por las membranas. [2] Otros inhibidores se dirigen al ciclo de palmitoilación de Ras mediante la inhibición de la despalmitoilación por parte de las tioesterasas de acilproteína , lo que potencialmente conduce a una desestabilización del ciclo de Ras. [33]
En [34] se describió una nueva estrategia de búsqueda de inhibidores para las moléculas de Ras mutadas. Las mutaciones de Ras en la posición del residuo 12 inhiben la unión de la molécula GAP reguladora a la Ras mutada, lo que provoca un crecimiento celular descontrolado. La nueva estrategia propone encontrar pequeñas moléculas de pegamento, que unen la Ras mutada a la GAP, prohibiendo el crecimiento celular descontrolado y restaurando la función normal. Para este objetivo, se diseñó una conformación teórica de Ras-GAP con una brecha de varios Å entre las moléculas, y se realizó un acoplamiento in silico de alto rendimiento para encontrar agentes de pegamento. Como prueba de concepto, se describieron dos nuevas moléculas con una actividad biológica satisfactoria.
En la mayoría de los tipos de células de la mayoría de las especies, la mayor parte de Ras es del tipo GDP. Esto es así en el caso de los ovocitos de Xenopus y los fibroblastos de ratón . [35]
Como se mencionó anteriormente, la mayoría de los ovocitos de X. Ras son conjugados con GDP. El Ras de mamífero induce la meiosis en los ovocitos de X. laevis casi con certeza al potenciar la meiosis inducida por insulina , pero no la inducida por progesterona . La síntesis de proteínas no parece ser parte de este paso. La inyección aumenta la síntesis de diacilglicerol a partir de fosfatidilcolina . Algunos efectos de la meiosis son antagonizados por rap1 (y por un Ras modificado para acoplarse incorrectamente). Tanto rap1 como el Ras modificado son coantagonistas con p120Ras GAP en esta vía. [35]
Se expresa en todos los tejidos de Drosophila melanogaster , pero principalmente en las células neuronales. La sobreexpresión es algo letal y, durante el desarrollo, produce anomalías en los ojos y las alas. (Esto es paralelo a anomalías similares debidas a receptores de tirosina quinasa mutados y puede ser la razón de las mismas ). Los genes de D. para rases en mamíferos producen anomalías. [35]
La mayor expresión en Aplysia spp. se encuentra en las células neuronales. [35]
El gen let 60 de C. elegans también parece desempeñar un papel en la formación del receptor de tirosina quinasa en este modelo. La sobreexpresión produce un desarrollo multivulvar debido a su participación en el desarrollo normal de esa región; la sobreexpresión en los sitios efectores es letal. [35]
Esencial en Dictyostelium discoideum . Esto se evidencia por un grave fallo del desarrollo en la expresión deficiente de ras y por un deterioro significativo de varias actividades vitales cuando se expresa artificialmente, como: aumento de la concentración de fosfatos de inositol ; probable reducción de la unión de AMPc a los receptores de quimiotaxis ; y esa es probablemente la razón por la que se altera la síntesis de GMPc . La actividad de la adenilato ciclasa no se ve afectada por ras . [35]
