La purificación de proteínas es una serie de procesos destinados a aislar una o varias proteínas de una mezcla compleja, generalmente células , tejidos u organismos completos. La purificación de proteínas es vital para la especificación de la función, estructura e interacciones de la proteína de interés. El proceso de purificación puede separar las partes proteicas y no proteicas de la mezcla y, finalmente, separar la proteína deseada de todas las demás proteínas. Idealmente, para estudiar una proteína de interés, se debe separar de otros componentes de la célula para que los contaminantes no interfieran en el examen de la estructura y función de la proteína de interés. [1] La separación de una proteína de todas las demás suele ser el aspecto más laborioso de la purificación de proteínas. Los pasos de separación generalmente aprovechan las diferencias en el tamaño de las proteínas, las propiedades fisicoquímicas, la afinidad de unión y la actividad biológica . El resultado puro puede denominarse aislado de proteína .
El costo de fabricación de proteínas sigue siendo alto y existe una demanda creciente de desarrollar métodos de purificación de proteínas rápidos y rentables. Comprender los diferentes métodos de purificación de proteínas y optimizar el procesamiento posterior son fundamentales para minimizar los costos de producción y al mismo tiempo mantener la calidad con estándares aceptables de homogeneidad. [2] La purificación de proteínas es preparativa o analítica . Las purificaciones preparativas tienen como objetivo producir una cantidad relativamente grande de proteínas purificadas para su uso posterior. Los ejemplos incluyen la preparación de productos comerciales como enzimas (p. ej., lactasa ), proteínas nutricionales (p. ej., aislado de proteína de soja ) y ciertos productos biofarmacéuticos (p. ej., insulina ). A menudo se implementan varios pasos de purificación preparatoria para eliminar subproductos, como las proteínas de la célula huésped , que representan una amenaza potencial para la salud del paciente. [3] La purificación analítica produce una cantidad relativamente pequeña de una proteína para una variedad de propósitos analíticos o de investigación, incluida la identificación, cuantificación y estudios de la estructura de la proteína , sus modificaciones postraduccionales y su función. Cada paso de un esquema de purificación de proteínas se controla y tiene en cuenta los niveles de purificación y el rendimiento. Un alto nivel de purificación y un bajo rendimiento apenas dejan proteínas con las que experimentar. Por otro lado, un alto rendimiento con bajos niveles de purificación deja muchos contaminantes (proteínas distintas a la de interés) que interfieren en los propósitos de la investigación. [1]
Si el organismo no secreta la proteína de interés en la solución circundante, el primer paso de cada proceso de purificación es la alteración de las células que contienen la proteína. Dependiendo de cuán frágil sea la proteína y cuán estables sean las células, se podría usar, por ejemplo, uno de los siguientes métodos: i) congelación y descongelación repetidas, ii) sonicación , iii) homogeneización por alta presión ( prensa francesa ), iv ) homogeneización mediante molienda (molino de perlas), y v) permeabilización mediante detergentes (por ejemplo, Triton X-100 ) y/o enzimas (por ejemplo, lisozima ). [4] Finalmente, los restos celulares se pueden eliminar mediante centrifugación diferencial, que es un procedimiento en el que el homogeneizado se centrifuga a baja velocidad y luego nuevamente con mayor fuerza para producir un sedimento que consta de núcleos y sobrenadante. Esto produce varias fracciones de densidad decreciente cuando se aplican técnicas de purificación más selectivas a una fracción. [1]
También se liberan proteasas durante la lisis celular , que comenzarán a digerir las proteínas en la solución. Si la proteína de interés es sensible a la proteólisis , se recomienda proceder rápidamente y mantener el extracto frío para ralentizar la digestión. Alternativamente, se pueden añadir uno o más inhibidores de proteasa al tampón de lisis inmediatamente antes de la alteración celular. A veces también es necesario añadir ADNasa para reducir la viscosidad del lisado celular provocada por un alto contenido de ADN .
La centrifugación es un proceso que utiliza la fuerza centrífuga para separar mezclas de partículas de diferentes masas o densidades suspendidas en un líquido. Cuando un recipiente (normalmente un tubo o botella) que contiene una mezcla de proteínas u otras partículas, como células bacterianas, se hace girar a altas velocidades, la inercia de cada partícula produce una fuerza en la dirección de la velocidad de la partícula que es proporcional a su masa. La tendencia de una partícula determinada a moverse a través del líquido debido a esta fuerza se ve compensada por la resistencia que el líquido ejerce sobre la partícula. El efecto neto de "hacer girar" la muestra en una centrífuga es que las partículas masivas, pequeñas y densas se mueven hacia afuera más rápido que las partículas menos masivas o las partículas con más "resistencia" en el líquido. Cuando se "hacen girar" suspensiones de partículas en una centrífuga, se puede formar un "gránulo" en el fondo del recipiente que se enriquece con las partículas más masivas con baja resistencia al líquido.
Las partículas no compactadas permanecen principalmente en el líquido llamado "sobrenadante" y pueden retirarse del recipiente separando así el sobrenadante del sedimento. La velocidad de centrifugación está determinada por la aceleración angular aplicada a la muestra, generalmente medida en comparación con g . Si las muestras se centrifugan durante el tiempo suficiente, las partículas en el recipiente alcanzarán el equilibrio en el que las partículas se acumulan específicamente en un punto del recipiente donde su densidad de flotación se equilibra con la fuerza centrífuga. Una centrifugación de "equilibrio" de este tipo puede permitir una purificación extensa de una partícula determinada.
La centrifugación en gradiente de sacarosa , un gradiente de concentración lineal de azúcar (normalmente sacarosa, glicerol o un medio de gradiente de densidad a base de sílice, como Percoll ), se genera en un tubo de modo que la concentración más alta esté en la parte inferior y la más baja en la parte superior. Percoll es una marca comercial propiedad de las empresas de GE Healthcare. Luego se coloca una muestra de proteína encima del gradiente y se hace girar a altas velocidades en una ultracentrífuga . Esto hace que las macromoléculas pesadas migren hacia el fondo del tubo más rápido que el material más ligero. Durante la centrifugación en ausencia de sacarosa, a medida que las partículas se alejan cada vez más del centro de rotación, experimentan cada vez más fuerza centrífuga (cuanto más se mueven, más rápido se mueven). El problema con esto es que el rango de separación útil dentro del recipiente está restringido a una pequeña ventana observable. Hacer girar una muestra el doble de tiempo no significa que la partícula de interés llegará el doble de distancia; de hecho, irá mucho más allá. Sin embargo, cuando las proteínas se mueven a través de un gradiente de sacarosa, encuentran un líquido de densidad y viscosidad crecientes. Un gradiente de sacarosa diseñado adecuadamente contrarrestará la creciente fuerza centrífuga de modo que las partículas se muevan en estrecha proporción con el tiempo que han estado en el campo centrífugo. Las muestras separadas por estos gradientes se denominan centrifugaciones de "velocidad zonal". Después de separar la proteína/partículas, el gradiente se fracciona y se recoge. En bioquímica, la ultracentrifugación es valiosa para separar biomoléculas y analizar sus propiedades físicas. [1]
La elección del material de partida es clave para el diseño de un proceso de purificación. En una planta o animal, una proteína particular generalmente no se distribuye de manera homogénea por todo el cuerpo; diferentes órganos o tejidos tienen concentraciones mayores o menores de la proteína. El uso de sólo los tejidos u órganos con la concentración más alta disminuye los volúmenes necesarios para producir una cantidad determinada de proteína purificada. Si la proteína está presente en poca abundancia o si tiene un valor alto, los científicos pueden usar tecnología de ADN recombinante para desarrollar células que produzcan grandes cantidades de la proteína deseada (esto se conoce como sistema de expresión ). La expresión recombinante permite etiquetar la proteína, por ejemplo mediante una etiqueta His [5] o una etiqueta Strep [6] para facilitar la purificación, reduciendo el número de pasos de purificación necesarios.
Una purificación analítica generalmente utiliza tres propiedades para separar proteínas. En primer lugar, las proteínas pueden purificarse según sus puntos isoeléctricos pasándolas por un gel con pH graduado o una columna de intercambio iónico. En segundo lugar, las proteínas se pueden separar según su tamaño o peso molecular mediante cromatografía de exclusión molecular o mediante análisis SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio). Las proteínas a menudo se purifican mediante 2D-PAGE y luego se analizan mediante huellas dactilares de masas peptídicas para establecer la identidad de la proteína. Esto es muy útil para fines científicos y los límites de detección de proteínas son hoy en día muy bajos y cantidades de nanogramos de proteína son suficientes para su análisis. En tercer lugar, las proteínas se pueden separar por polaridad/hidrofobicidad mediante cromatografía líquida de alta resolución o cromatografía de fase inversa .
Normalmente, un protocolo de purificación de proteínas contiene uno o más pasos cromatográficos. El procedimiento básico en cromatografía es hacer fluir la solución que contiene la proteína a través de una columna llena de diversos materiales. Diferentes proteínas interactúan de manera diferente con el material de la columna y, por tanto, pueden separarse según el tiempo necesario para pasar la columna o las condiciones necesarias para eluir la proteína de la columna. Normalmente las proteínas se detectan a medida que salen de la columna por su absorbancia a 280 nm. Existen muchos métodos cromatográficos diferentes:
La mayoría de las proteínas requieren algo de sal para disolverse en agua, un proceso llamado salazón. A medida que aumenta la concentración de sal, las proteínas pueden precipitar, un proceso llamado salazón que implica cambiar la solubilidad de las proteínas. [1] Por ejemplo, en la purificación de proteínas en masa, un primer paso común para aislar proteínas es la precipitación con sulfato de amonio (NH 4 ) 2 SO 4 . [7] Esto se realiza agregando cantidades crecientes de sulfato de amonio y recogiendo las diferentes fracciones de proteína precipitada. Posteriormente, el sulfato de amonio se puede eliminar mediante diálisis (separando proteínas de moléculas pequeñas a través de una membrana semipermeable). [1] Durante la etapa de precipitación con sulfato de amonio, los grupos hidrofóbicos presentes en las proteínas quedan expuestos a la atmósfera, atrayendo otros grupos hidrofóbicos; el resultado es la formación de un agregado de componentes hidrófobos. En este caso, el precipitado de proteína normalmente será visible a simple vista . Una ventaja de este método es que puede realizarse de forma económica, incluso con volúmenes muy grandes.
Las primeras proteínas que se purifican son las proteínas solubles en agua. La purificación de proteínas integrales de membrana requiere la alteración de la membrana celular para aislar una proteína particular de otras que se encuentran en el mismo compartimento de la membrana. A veces, se puede aislar primero una fracción particular de la membrana, como aislar las mitocondrias de las células antes de purificar una proteína ubicada en una membrana mitocondrial. Se puede utilizar un detergente como el dodecilsulfato de sodio (SDS) para disolver las membranas celulares y mantener las proteínas de la membrana en solución durante la purificación; sin embargo, debido a que el SDS causa desnaturalización , se pueden usar detergentes más suaves como Triton X-100 o CHAPS para conservar la conformación nativa de la proteína durante la purificación completa.
La cromatografía se puede utilizar para separar proteínas en solución o en condiciones desnaturalizantes mediante el uso de geles porosos. Esta técnica es una separación más discriminatoria y se conoce como cromatografía de exclusión por tamaño . El principio es que las moléculas más pequeñas tienen que atravesar un volumen mayor en una matriz porosa. En consecuencia, las proteínas de un cierto rango de tamaño requerirán un volumen variable de eluyente (disolvente) antes de ser recogidas en el otro extremo de la columna de gel. Las moléculas (o proteínas) más grandes viajarán a través de un volumen menor y eluirán antes que las moléculas más pequeñas.
En el contexto de la purificación de proteínas, el eluyente normalmente se mezcla en diferentes tubos de ensayo. Se descartan todos los tubos de ensayo que no contengan trazas mensurables de la proteína a purificar. La solución restante está formada por la proteína a purificar y cualquier otra proteína de tamaño similar.
Una técnica de cromatografía basada en propiedades moleculares no suele ser suficiente para obtener una proteína de alta pureza. [1] Además del tamaño, la cromatografía de intercambio iónico separa los compuestos según la naturaleza y el grado de su carga iónica. La columna a utilizar se selecciona según su tipo y fuerza de carga. Las resinas de intercambio aniónico tienen carga positiva y se utilizan para retener y separar compuestos cargados negativamente (aniones), mientras que las resinas de intercambio catiónico tienen carga negativa y se utilizan para separar moléculas cargadas positivamente (cationes).
Antes de que comience la separación, se bombea un tampón a través de la columna para equilibrar los iones cargados opuestos. Tras la inyección de la muestra, las moléculas de soluto se intercambiarán con los iones tampón mientras cada uno compite por los sitios de unión en la resina. La duración de la retención de cada soluto depende de la fuerza de su carga. Los compuestos con carga más débil eluirán primero, seguidos por aquellos con cargas sucesivamente más fuertes. Debido a la naturaleza del mecanismo de separación, el pH, el tipo de tampón, la concentración del tampón y la temperatura desempeñan papeles importantes en el control de la separación.
La cromatografía de intercambio iónico es una herramienta muy poderosa para usar en la purificación de proteínas y se usa con frecuencia en separaciones tanto analíticas como preparativas.
La electroforesis de flujo libre (FFE) es una técnica de electroforesis sin portador que permite la separación preparativa de proteínas en una corriente tampón laminar mediante el uso de un campo eléctrico ortogonal. Al utilizar un gradiente de pH, que puede ser inducido, por ejemplo, por anfolitos , esta técnica permite separar isoformas de proteínas hasta una resolución de < 0,02 delta-pI.
Los medios HIC son anfifílicos, con regiones hidrofóbicas e hidrofílicas, lo que permite la separación de proteínas en función de su hidrofobicidad superficial. Las proteínas diana y sus especies agregadas de productos tienden a tener diferentes propiedades hidrofóbicas y su eliminación mediante HIC purifica aún más la proteína de interés. [8] Además, el entorno utilizado normalmente emplea condiciones desnaturalizantes menos duras que otras técnicas de cromatografía, lo que ayuda a preservar la proteína de interés en su estado nativo y funcional. En agua pura, las interacciones entre la resina y las regiones hidrofóbicas de la proteína serían muy débiles, pero esta interacción se mejora aplicando una muestra de proteína a la resina HIC en un tampón de alta fuerza iónica. Luego se reduce la fuerza iónica del tampón para eluir las proteínas en orden de hidrofobicidad decreciente. [9]
La cromatografía de afinidad es otra poderosa técnica de separación que es altamente selectiva para la proteína de interés según la conformación molecular, que frecuentemente utiliza resinas específicas para cada aplicación. Estas resinas tienen ligandos adheridos a sus superficies que son específicos de los compuestos que se van a separar. Con mayor frecuencia, estos ligandos funcionan de manera similar a la de las interacciones anticuerpo-antígeno. Este ajuste de "llave y candado" entre el ligando y su compuesto objetivo lo hace altamente específico, generando frecuentemente un único pico, mientras que todo lo demás en la muestra no se retiene.
Muchas proteínas de membrana son glicoproteínas y pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad con lectinas . Se puede permitir que las proteínas solubilizadas en detergente se unan a una resina de cromatografía que ha sido modificada para tener una lectina unida covalentemente. Las proteínas que no se unen a la lectina se eliminan por lavado y luego las glicoproteínas unidas específicamente se pueden eluir agregando una alta concentración de un azúcar que compita con las glicoproteínas unidas en el sitio de unión de la lectina. Algunas lectinas tienen una unión de alta afinidad con oligosacáridos de glicoproteínas que es difícil de competir con los azúcares, y las glicoproteínas unidas deben liberarse mediante la desnaturalización de la lectina.
La cromatografía de inmunoafinidad utiliza la unión específica de un anticuerpo -antígeno para purificar selectivamente la proteína diana. El procedimiento implica inmovilizar una proteína a un sustrato sólido (p. ej., una perla porosa o una membrana), que luego se une selectivamente al objetivo, mientras todo lo demás fluye a través de él. La proteína objetivo se puede eluir cambiando el pH o la salinidad . El ligando inmovilizado puede ser un anticuerpo (como la inmunoglobulina G ) o puede ser una proteína (como la proteína A ). Debido a que este método no implica la ingeniería de una etiqueta, puede usarse para proteínas de fuentes naturales. [10]
La cromatografía líquida de alta resolución o cromatografía líquida de alta presión es una forma de cromatografía que aplica alta presión para impulsar los solutos a través de la columna más rápido. Esto significa que la difusión es limitada y se mejora la resolución. La forma más común es la HPLC de "fase reversa", donde el material de la columna es hidrofóbico . Las proteínas se eluyen mediante un gradiente de cantidades crecientes de un disolvente orgánico , como el acetonitrilo. Las proteínas eluyen según su hidrofobicidad. Después de la purificación por HPLC, la proteína se encuentra en una solución que solo contiene compuestos volátiles y puede liofilizarse fácilmente. [11] La purificación por HPLC frecuentemente da como resultado la desnaturalización de las proteínas purificadas y, por lo tanto, no es aplicable a proteínas que no se repliegan espontáneamente.
Otra forma de marcar proteínas es diseñar una etiqueta peptídica antigénica en la proteína y luego purificar la proteína en una columna o incubando con una resina suelta recubierta con un anticuerpo inmovilizado . Este procedimiento particular se conoce como inmunoprecipitación . La inmunoprecipitación es capaz de generar una interacción extremadamente específica que normalmente resulta en la unión sólo de la proteína deseada. Las proteínas marcadas purificadas se pueden separar fácilmente de las otras proteínas en solución y luego eluir nuevamente en una solución limpia.
Cuando las etiquetas ya no son necesarias, se pueden eliminar mediante una proteasa. Esto a menudo implica diseñar un sitio de escisión de proteasa entre la etiqueta y la proteína.
Tenga en cuenta que la etiqueta de autoescisión elimina la necesidad de utilizar proteasas para separar la etiqueta de la proteína objetivo de interés durante el proceso de purificación ( p . ej. , CapTag™). [12] [13] El componente principal de la etiqueta es una inteína, que se escinde simplemente después del cambio de pH. Luego, la proteína objetivo pura y sin etiquetas se libera en el tampón de elución.
Al final de una purificación de proteínas, a menudo es necesario concentrar la proteína. Existen diferentes métodos.
Si la solución no contiene ningún otro componente soluble además de la proteína en cuestión, la proteína se puede liofilizar (secar). Esto se hace normalmente después de una ejecución de HPLC. Esto simplemente elimina todos los componentes volátiles, dejando atrás las proteínas.
La ultrafiltración concentra una solución de proteínas utilizando membranas permeables selectivas. La función de la membrana es dejar pasar el agua y las pequeñas moléculas reteniendo la proteína. La solución se fuerza contra la membrana mediante una bomba mecánica, presión de gas o centrifugación.
El método más general para monitorear el proceso de purificación es ejecutando una SDS-PAGE de los diferentes pasos. Este método sólo proporciona una medida aproximada de las cantidades de diferentes proteínas en la mezcla y no puede distinguir entre proteínas con un peso molecular aparente similar .
Si la proteína tiene una característica espectroscópica distintiva o una actividad enzimática , esta propiedad se puede utilizar para detectar y cuantificar la proteína específica y, por tanto, para seleccionar las fracciones de la separación que contienen la proteína. Si hay anticuerpos disponibles contra la proteína, la transferencia Western y ELISA pueden detectar y cuantificar específicamente la cantidad de proteína deseada. Algunas proteínas funcionan como receptores y pueden detectarse durante las etapas de purificación mediante un ensayo de unión de ligando , que a menudo utiliza un ligando radiactivo .
Para evaluar el proceso de purificación de múltiples pasos, la cantidad de proteína específica debe compararse con la cantidad de proteína total. Esto último puede determinarse mediante el ensayo de proteína total de Bradford o mediante absorbancia de luz a 280 nm ; sin embargo, algunos reactivos utilizados durante el proceso de purificación pueden interferir con la cuantificación. Por ejemplo, el imidazol (comúnmente utilizado para la purificación de proteínas recombinantes marcadas con polihistidina) es un análogo de aminoácido y en concentraciones bajas interferirá con el ensayo del ácido bicinconínico (BCA) para la cuantificación de proteínas totales. Las impurezas del imidazol de baja calidad también se absorberán a 280 nm, lo que dará como resultado una lectura inexacta de la concentración de proteínas a partir de la absorbancia UV.
Otro método a considerar es la resonancia de plasmones superficiales (SPR). SPR puede detectar la unión de moléculas libres de etiquetas en la superficie de un chip. Si la proteína deseada es un anticuerpo, la unión se puede traducir directamente en la actividad de la proteína. Se puede expresar la concentración activa de la proteína como porcentaje de la proteína total. La SPR puede ser un método poderoso para determinar rápidamente la actividad de las proteínas y el rendimiento general. Es una tecnología poderosa que requiere un instrumento para funcionar.
La electroforesis en gel es una técnica de laboratorio común que se puede utilizar como método preparativo y analítico. El principio de la electroforesis se basa en el movimiento de un ion cargado en un campo eléctrico. En la práctica, las proteínas se desnaturalizan en una solución que contiene un detergente ( SDS ). En estas condiciones, las proteínas se desdoblan y recubren con moléculas de detergente cargadas negativamente. Las proteínas en SDS-PAGE se separan únicamente por su tamaño.
En los métodos analíticos, la proteína migra en bandas según su tamaño. Cada banda se puede detectar utilizando tintes como el tinte azul de Coomassie o el tinte plateado . Los métodos preparativos para purificar grandes cantidades de proteína requieren la extracción de la proteína del gel electroforético. Esta extracción puede implicar la escisión del gel que contiene una banda o la elución de la banda directamente del gel a medida que sale del extremo del gel.
En el contexto de una estrategia de purificación, la electroforesis en condiciones desnaturalizantes proporciona una resolución mejorada con respecto a la cromatografía de exclusión por tamaño, pero no escala a una gran cantidad de proteínas en una muestra tan bien como las columnas de cromatografía tardía .
Un procedimiento electroforético no desnaturalizante para aislar metaloproteínas bioactivas en mezclas de proteínas complejas es la PAGE nativa preparativa . La integridad o integridad estructural de la proteína aislada debe confirmarse mediante un método independiente. [14]