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PÁGINA QPNC

QPNC-PAGE , o Electroforesis Cuantitativa Preparativa Nativa Continua en Gel de Poliacrilamida , es una técnica de electroforesis bioanalítica , unidimensional , de alta resolución y alta precisión aplicada en bioquímica y química bioinorgánica para separar proteínas cuantitativamente por punto isoeléctrico y por elución continua a partir de un gel. columna. [1]

Esta variante híbrida de la electroforesis en gel analítica nativa y la electroforesis en gel de poliacrilamida preparativa es utilizada por los biólogos para descomponer macromoléculas en solución con alta recuperación, por ejemplo, en metaloproteínas activas o nativas en muestras biológicas o en proteínas que contienen cofactores metálicos apropiada e incorrectamente plegadas o en Isoformas de proteínas en mezclas de proteínas complejas . [2]

Introducción

Las proteínas desempeñan varias funciones en los organismos vivos , incluidas reacciones catalíticas y transporte de moléculas o iones dentro de las células , los órganos o todo el cuerpo . La comprensión de los procesos en los organismos humanos, que son impulsados ​​principalmente por reacciones bioquímicas e interacciones proteína-proteína , depende en gran medida de la capacidad de aislar proteínas activas en muestras biológicas para un examen más detallado de la estructura química y la función fisiológica . Esta información esencial puede implicar una indicación importante del estado de salud de un paciente. [3]

Como aproximadamente entre el 30% y el 40% de todas las proteínas conocidas contienen uno o más cofactores de iones metálicos (p. ej., ceruloplasmina , ferritina , proteína precursora de beta amiloide , metaloproteinasa de matriz o metalochaperonas ), es necesario aislar, identificar y cuantificar especialmente las metaloproteínas nativas y desnaturalizadas. después de la biopsia líquida . Muchos de estos cofactores (p. ej., hierro , cobre o zinc ) desempeñan un papel clave en procesos catalíticos enzimáticos vitales o estabilizan moléculas de proteínas globulares . [4] Por lo tanto, la electroforesis en gel de alta precisión y técnicas de separación comparables son muy relevantes como paso inicial del análisis de especiación de proteínas y metales traza , seguido posteriormente por métodos modernos de espectrometría de masas y resonancia magnética para cuantificar e identificar las proteínas solubles de interés. [5]

Método

Mecanismos de separación y amortiguación.

Equipo para electroforesis bioanalítica en gel de elución continua : cámara de electroforesis, bomba peristáltica , recolector de fracciones, bomba de recirculación de buffer y detector UV (en refrigerador), fuente de alimentación y registrador (sobre mesa). [6]

En la electroforesis en gel, las proteínas normalmente se separan por carga , tamaño o forma . [7] El objetivo del enfoque isoeléctrico (IEF), por ejemplo, es separar proteínas según su punto isoeléctrico (pI), es decir, según su carga a diferentes valores de pH . [8] Aquí, se logra un mecanismo similar en una cámara de electroforesis disponible comercialmente (ver fig. Equipo ) para separar biomoléculas cargadas , por ejemplo, superóxido dismutasa (SOD) [9] o alérgenos , [10] en condiciones de pH constante y diferentes velocidades de migración dependiendo de diferentes puntos isoeléctricos de zwitteriones . Las proteínas (metálicas) separadas eluyen secuencialmente, comenzando con el pI más bajo (pI > 2–4) y terminando con el pI más alto (pI < 10,0) de las moléculas de proteína disueltas que se van a analizar. [11]

Debido a las propiedades específicas del gel preparado y la solución tampón de electroforesis que es básica y contiene Tris - HCl y NaN 3 , [6] la mayoría de las proteínas de un sistema biológico (por ejemplo, Helicobacter pylori [12] ) están cargadas negativamente en la solución. y migrará del cátodo al ánodo debido al campo eléctrico . En general, la ecuación de reacción (1) muestra que el grupo lateral carboxilo de un aminoácido proteinógeno está cargado negativamente, la ecuación (2) que los grupos laterales amino son eléctricamente neutros en estas condiciones:

(1) R-COOH + OH − → R-COO − + H 2 O

(2) R-NH 3 + + OH − → R-NH 2 + H 2 O

En el ánodo, los iones de hidrógeno generados electroquímicamente reaccionan con moléculas de Tris para formar iones Tris monovalentes (3). Los iones Tris cargados positivamente migran a través del gel hasta el cátodo donde neutralizan los iones de hidróxido para formar moléculas de Tris y agua (4):

(3) (HOCH 2 ) 3 CNH 2 + H + → [(HOCH 2 ) 3 CNH 3 ] +

(4) [(HOCH 2 ) 3 CNH 3 ] + + OH − → (HOCH 2 ) 3 CNH 2 + H 2 O

Por lo tanto, el mecanismo de amortiguación basado en Tris provoca un pH constante en el sistema de amortiguación continuo con una alta capacidad de amortiguación . [13]

A 25 °C, el tampón Tris tiene un rango de pH efectivo entre 7,5 y 9,0. Bajo las condiciones dadas aquí (que abordan la concentración de componentes del tampón, el mecanismo de tampón, el pH y la temperatura), el pH efectivo se desplaza en el intervalo de aproximadamente 10,0 a 10,5. Todos los sistemas tampón nativos tienen baja conductividad y su pH oscila entre 3,8 y 10,2. Por tanto, se utilizan sistemas de tampón nativos continuos para separar proteínas según su pI. [14]

Aunque el valor de pH (10,00) del tampón de electroforesis no corresponde a un valor de pH fisiológico dentro de un tipo de célula o tejido , las bandas de proteínas en forma de anillo separadas se eluyen continuamente en una solución tampón fisiológica (pH 8,00) y se aíslan en diferentes fracciones. (cf. fig. Electroferograma ). [6] Siempre que la desnaturalización irreversible no pueda demostrarse mediante un procedimiento independiente, la mayoría de las moléculas de proteínas son estables en solución acuosa , a valores de pH de 3 a 10 si la temperatura es inferior a 50 °C. [15] Como el calor Joule y la temperatura generados durante la electroforesis pueden exceder los 50 °C, [16] y, por lo tanto, tener un impacto negativo en la estabilidad y el comportamiento de migración de las proteínas en el gel, el sistema de separación, que consiste en la cámara de electroforesis, El colector de fracciones y otros dispositivos se enfría en un frigorífico a 4 °C, lo que reduce en gran medida el riesgo de corrientes de convección de calor . [17] El sobrecalentamiento del gel se evita mediante el circuito de refrigeración interno de la columna de gel como parte integrada de la cámara de electroforesis y mediante la generación de una potencia constante a través de la fuente de alimentación (ver fig. Equipo ). [18]

Propiedades del gel y tiempo de polimerización.

Las mejores condiciones de polimerización para geles de acrilamida se obtienen a 25-30 °C [19] y la polimerización parece terminar después de 20-30 minutos de reacción, aunque se detectan monómeros residuales (10-30%) después de este tiempo. [20] La copolimerización del monómero de acrilamida (AA)/entrecruzador N,N'-metilenbisacrilamida (Bis-AA) iniciada por reacciones de persulfato de amonio (APS)/ tetrametiletilendiamina (TEMED), es más eficiente a pH alcalino del solución de acrilamida. De este modo, se crean y reticulan cadenas de acrilamida a la vez. Debido a las propiedades del tampón de electroforesis, la polimerización en gel se lleva a cabo a pH 10,00, asegurando un uso eficiente de TEMED y APS como catalizadores de la reacción de polimerización y, al mismo tiempo, suprimiendo una hidrólisis competitiva de la red de polímero de acrilamida producida . Las redes poliméricas son cadenas poliméricas unidas tridimensionalmente . De lo contrario, las proteínas podrían modificarse mediante reacción con monómeros de acrilamida no polimerizados, formando productos de aducción de acrilamida covalentes que pueden dar lugar a bandas múltiples. [21]

Además, el tiempo de polimerización de un gel puede afectar directamente los tiempos de pico de elución de las metaloproteínas separadas en el electroferograma debido a la compresión y dilatación de los geles y sus poros si los tiempos de incubación de la mezcla de reacción (solución de gel) utilizada para preparar un gel no están optimizados (ver fig. Electroferograma , ver apartado Reproducibilidad y recuperación). Para garantizar la máxima reproducibilidad en el tamaño de los poros del gel y obtener un gel de poros grandes completamente polimerizado y no restrictivo para una ejecución de PAGE, el gel de poliacrilamida se polimeriza durante un período de tiempo de 69 horas a temperatura ambiente (RT) en una columna de gel. ubicado en el soporte de fundición. [18] El calor exotérmico generado por los procesos de polimerización se disipa constantemente, mientras que la temperatura puede aumentar rápidamente hasta superar los 75 °C en los primeros minutos, después de los cuales desciende lentamente. [22] Después de 69 horas, el gel ha alcanzado la temperatura ambiente y se encuentra en su estado de energía más bajo , ya que las reacciones químicas básicas y la gelificación están completas. [18] Gelificación significa que el disolvente (agua) queda inmovilizado dentro de la red polimérica mediante enlaces de hidrógeno y también fuerzas de van der Waals . Como resultado, el gel preparado es homogéneo (en términos de distribución homogénea de enlaces cruzados en toda la muestra de gel [23] ), inherentemente estable y libre de monómeros o radicales . Los geles de poliacrilamida frescos son además hidrófilos , eléctricamente neutros y no se unen a proteínas. [24] Los efectos de tamizado debidos a la compresión del gel inducida por la gravedad pueden excluirse por las mismas razones. Por tanto, en un medio sin propiedades de tamizado molecular se puede esperar una alta resolución. [25]

Antes de iniciar una serie electroforética, el gel preparado con 4% T (contenido total de polímero (T)) y 2,67% C (concentración de reticulante (C)) se realiza previamente para equilibrarlo . [6] Es esencialmente no tamizado y óptimo para la electroforesis de proteínas mayores o iguales a 200 k u . Las proteínas migran en él más o menos en función de su libre movilidad. [26] Por estas razones, las interacciones del gel con las biomoléculas son insignificantes y, por lo tanto, las proteínas se separan de forma limpia y predecible en un tiempo de polimerización de 69 horas (cf. fig. Electroferograma ). Las metaloproteínas separadas , incluidas biomoléculas que varían desde aproximadamente < 1 ku hasta más de 30 ku (p. ej., chaperonas metálicas , priones , proteínas transportadoras de metales , amiloides , metaloenzimas , metalopéptidos , metalotioneína , fitoquelatinas ) no se disocian en apoproteínas y cofactores metálicos. [27]

Reproducibilidad y recuperación.

Electroferograma que muestra cuatro ejecuciones de PAGE de una proteína vegetal de alto peso molecular(≈ 200 k Da ) en función del tiempo de polimerización del gel. Método de detección para la determinación de concentraciones de cofactor Cd (en μg/L): GF-AAS . [6]

Las estructuras bioactivas (conformación o forma nativa o 3D) de las moléculas de proteína aisladas no sufren ningún cambio conformacional significativo . Por tanto, las proteínas que contienen cofactor metálico activo se pueden aislar de forma reproducible en las mismas fracciones después de una ejecución de PAGE. [11] Un pico cambiante en el electroferograma respectivo indica que el tiempo estandarizado de polimerización en gel (69 h, temperatura ambiente) no se implementa en un experimento PAGE . Una desviación menor del tiempo de polimerización estandarizado (< 69 h) representa una polimerización incompleta y, por lo tanto, una inestabilidad inherente debido al ablandamiento del gel durante la reticulación de los polímeros a medida que el material alcanza el equilibrio de hinchamiento, [28] mientras se excede este límite de tiempo. (> 69 h) es un indicador del envejecimiento del gel (cf. fig. Electroferograma ). [29] El fenómeno del envejecimiento del gel está estrechamente relacionado con la disminución a largo plazo de la viscosidad de las soluciones acuosas de poliacrilamida [30] y el aumento de la hinchazón de los hidrogeles. [31]

En condiciones estándar, se han recuperado metaloproteínas con diferentes rangos de masa molecular y puntos isoeléctricos en forma biológicamente activa con un rendimiento cuantitativo de más del 95%. [18] Mediante SDS-PAGE preparativa , se pueden recuperar proteínas estándar ( citocromo c , aldolasa , ovoalbúmina y albúmina sérica bovina ) con masas moleculares de 14 a 66 ku con un rendimiento promedio de aproximadamente 73,6%. [32] La isotacoforesis preparativa (ITP) se aplica para aislar proteínas que contienen paladio con masas moleculares de 362 ku (recuperación: 67%) y 158 ku (recuperación: 97%). [33]

Cuantificación e identificación

Las concentraciones fisiológicas ( rango de ppb ) de Fe, Cu, Zn, Ni , Mo , Pd, Co , Mn , Pt , Cr , Cd y otros cofactores metálicos se pueden identificar y cuantificar de forma absoluta en una alícuota de una fracción mediante masa de plasma acoplada inductivamente. espectrometría (ICP-MS) [34] o fluorescencia de rayos X de reflexión total (TXRF), [35] por ejemplo. En el caso de ICP-MS, la información estructural de las metalobiomoléculas asociadas se pierde irreversiblemente debido a la ionización de la muestra con plasma . [36] [37] Otro método de detección de alta sensibilidad establecido para la determinación de oligoelementos en muestras biológicas es la espectrometría de absorción atómica en horno de grafito (GF-AAS) (cf. fig. Electroferograma ). [38] Debido a la alta pureza y la concentración optimizada de las metaloproteínas separadas , por ejemplo, productos farmacéuticos terapéuticos recombinantes elaborados a partir de plantas, como la chaperona de cobre para la superóxido dismutasa (CCS) de plantas medicinales , en algunas fracciones de PAGE específicas, las estructuras relacionadas de estas Los analitos bioactivos se pueden dilucidar cuantitativamente mediante el uso de espectroscopia de RMN en solución en condiciones no desnaturalizantes. [39]

Aplicaciones

Las proteínas metálicas plegadas incorrectamente, por ejemplo, CCS o Cu-Zn-superóxido dismutasa (SOD1) presentes en el cerebro , la sangre u otras muestras clínicas, son indicativas de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA) o la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). [40] Las moléculas activas de CCS o SOD contribuyen al control homeostático intracelular de especies de iones metálicos esenciales (p. ej., Cu 1+/2+ , Zn 2+ , Fe 2+/3+ , Mn 2+ , Ni 3+ ) en organismos. y así, estas biomoléculas pueden equilibrar los procesos prooxidantes y antioxidantes en el citoplasma . [41] De lo contrario, los iones de metales de transición libres o débilmente unidos participan en reacciones tipo Fenton en las que se forman radicales hidroxilo nocivos , que desenfrenadamente serían destructivos para las proteínas. [42] La pérdida de CCS activo aumenta la producción de β-amiloide en las neuronas, lo que, a su vez, es una característica patológica importante de la EA. [43] Por lo tanto, se propone que la chaperona de cobre para la superóxido dismutasa sea uno de los biomarcadores más prometedores de la toxicidad del Cu en estas enfermedades. [44] La CCS debe analizarse principalmente en sangre porque un metanálisis de datos séricos mostró que los pacientes con EA tienen niveles más altos de Cu sérico que los controles sanos . [45]

personas

QPNC-PAGE, originalmente denominado 'PNC-PAGE', fue inventado y desarrollado a finales de la década de 1990 por Bernd Kastenholz [46] y significativamente influenciado por el trabajo pionero de David E. Garfin [47] y muchos otros investigadores citados, como Arne Tiselius , Pier Giorgio Righetti y Andreas Chrambach.

Ver también

Referencias

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Otras lecturas

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