Un reloj circadiano , u oscilador circadiano , también conocido como despertador interno, es un oscilador bioquímico que realiza ciclos con una fase estable y está sincronizado con la hora solar .
El período in vivo de un reloj de este tipo es necesariamente casi exactamente de 24 horas (el día solar actual de la Tierra ). En la mayoría de los organismos vivos, los relojes circadianos sincronizados internamente hacen posible que el organismo anticipe los cambios ambientales diarios correspondientes al ciclo día-noche y ajuste su biología y comportamiento en consecuencia.
El término circadiano deriva del latín circa (sobre) muere (un día), ya que cuando se les quitan las señales externas (como la luz ambiental), no llegan a exactamente 24 horas. Los relojes en humanos en un laboratorio con poca luz constante, por ejemplo, tendrán un promedio de aproximadamente 24,2 horas por día, en lugar de 24 horas exactamente. [1]
El reloj biológico normal oscila con un período endógeno de exactamente 24 horas y se activa cuando recibe suficientes señales correctivas diarias del entorno, principalmente de la luz del día y de la oscuridad. Los relojes circadianos son los mecanismos centrales que impulsan los ritmos circadianos . Constan de tres componentes principales:
El reloj se reinicia cuando un organismo detecta señales de tiempo ambientales, de las cuales la principal es la luz. Los osciladores circadianos son omnipresentes en los tejidos del cuerpo, donde se sincronizan mediante señales tanto endógenas como externas para regular la actividad transcripcional a lo largo del día de una manera específica del tejido. [2] El reloj circadiano está entrelazado con la mayoría de los procesos metabólicos celulares y se ve afectado por el envejecimiento del organismo. [3] Los mecanismos moleculares básicos del reloj biológico se han definido en especies de vertebrados , Drosophila melanogaster , plantas , hongos , bacterias , [4] [5] y presumiblemente también en Archaea . [6] [7] [8]
En 2017, el Premio Nobel de Fisiología o Medicina fue concedido a Jeffrey C. Hall , Michael Rosbash y Michael W. Young "por sus descubrimientos de los mecanismos moleculares que controlan el ritmo circadiano" en las moscas de la fruta. [9]
En los vertebrados, el reloj circadiano maestro está contenido en el núcleo supraquiasmático (SCN), un grupo de nervios bilateral de unas 20.000 neuronas. [10] [11] El SCN en sí está ubicado en el hipotálamo , una pequeña región del cerebro situada directamente encima del quiasma óptico , donde recibe información de células ganglionares fotosensibles especializadas en la retina a través del tracto retinohipotalámico .
El SCN mantiene el control en todo el cuerpo sincronizando "osciladores esclavos", que exhiben sus propios ritmos de casi 24 horas y controlan los fenómenos circadianos en el tejido local. [12] A través de mecanismos de señalización intercelular como el péptido intestinal vasoactivo , el SCN envía señales a otros núcleos hipotalámicos y a la glándula pineal para modular la temperatura corporal y la producción de hormonas como el cortisol y la melatonina ; Estas hormonas ingresan al sistema circulatorio e inducen efectos controlados por el reloj en todo el organismo.
Sin embargo, no está claro exactamente qué señal (o señales) activan los principales relojes bioquímicos contenidos en los tejidos de todo el cuerpo. Consulte la sección "regulación de los osciladores circadianos" a continuación para obtener más detalles.
La evidencia de una base genética de los ritmos circadianos en eucariotas superiores comenzó con el descubrimiento del locus período ( per ) en Drosophila melanogaster a partir de pantallas genéticas avanzadas completadas por Ron Konopka y Seymour Benzer en 1971. [13] A través del análisis de mutantes per circadianos y mutaciones adicionales en los genes del reloj de Drosophila , se ha propuesto un modelo que abarca bucles de retroalimentación autorreguladora positiva y negativa de transcripción y traducción . Los genes centrales del "reloj" circadiano se definen como genes cuyos productos proteicos son componentes necesarios para la generación y regulación de los ritmos circadianos. Se han sugerido modelos similares en mamíferos y otros organismos. [14] [15]
Sin embargo, los estudios en cianobacterias cambiaron nuestra visión del mecanismo del reloj, ya que Kondo y sus colegas descubrieron que estos organismos unicelulares podían mantener una sincronización precisa de 24 horas en ausencia de transcripción, es decir, no había necesidad de una transcripción. Traducción de bucle de retroalimentación autorreguladora para ritmos. [16] Además, este reloj fue reconstruido en un tubo de ensayo (es decir, en ausencia de cualquier componente celular), lo que demuestra que se pueden formar relojes precisos de 24 horas sin la necesidad de circuitos de retroalimentación genética. [17] Sin embargo, este mecanismo sólo era aplicable a las cianobacterias y no era genérico.
En 2011, se produjo un gran avance en la comprensión del laboratorio Reddy de la Universidad de Cambridge . Este grupo descubrió ritmos circadianos en proteínas redox ( peroxiredoxinas ) en células que carecían de núcleo: los glóbulos rojos humanos. [18] En estas células, no había transcripción ni circuitos genéticos y, por lo tanto, no había bucle de retroalimentación. Se hicieron observaciones similares en un alga marina [19] y posteriormente en glóbulos rojos de ratón. [20] Más importante aún, las oscilaciones redox demostradas por los ritmos de peroxiredoxina ahora se han observado en múltiples reinos distantes de la vida (eucariotas, bacterias y arqueas), cubriendo el árbol evolutivo. [6] [21] Por lo tanto, los relojes redox parecen ser el reloj del abuelo , y los circuitos de retroalimentación genética son los principales mecanismos de salida para controlar la fisiología y el comportamiento de las células y los tejidos. [22] [23]
Por tanto, el modelo del reloj debe considerarse como producto de una interacción entre circuitos transcripcionales y elementos no transcripcionales como las oscilaciones redox y los ciclos de fosforilación de proteínas. [24] [25]
La eliminación selectiva de genes de componentes conocidos del reloj circadiano humano demuestra que se utilizan mecanismos compensatorios activos y redundancia para mantener la función del reloj. [26] [27] [28] [29] Se han identificado y caracterizado varios genes del reloj de mamíferos a través de experimentos en animales que albergan mutaciones knockout específicas, inducidas químicamente y de origen natural, y varios enfoques genómicos comparativos. [26]
La mayoría de los componentes del reloj identificados son activadores o represores transcripcionales que modulan la estabilidad de las proteínas y la translocación nuclear y crean dos circuitos de retroalimentación entrelazados . [30] En el circuito de retroalimentación primario, los miembros de la familia de factores de transcripción básicos hélice-bucle-hélice (bHLH)-PAS (Period-Arnt-Single-minded), CLOCK y BMAL1 , se heterodimerizan en el citoplasma para formar un complejo que, Después de la translocación al núcleo , inicia la transcripción de genes diana, como los genes del 'período' de los genes del reloj central ( PER1 , PER2 y PER3 ) y dos genes de criptocromo ( CRY1 y CRY2 ). La retroalimentación negativa se logra mediante heterodímeros PER:CRY que se trasladan de regreso al núcleo para reprimir su propia transcripción al inhibir la actividad de los complejos CLOCK:BMAL1. [5] Otro bucle regulador se induce cuando los heterodímeros CLOCK:BMAL1 activan la transcripción de Rev-ErbA y Rora, dos receptores nucleares huérfanos relacionados con el ácido retinoico. REV-ERBa y RORa posteriormente compiten para unirse a los elementos de respuesta del receptor huérfano relacionados con el ácido retinoico (RORES) presentes en el promotor Bmal1. Mediante la unión posterior de RORES, los miembros de ROR y REV-ERB pueden regular Bmal1 . Mientras que los ROR activan la transcripción de Bmal1 , los REV-ERB reprimen el mismo proceso de transcripción. Por lo tanto, la oscilación circadiana de Bmal1 está regulada tanto positiva como negativamente por ROR y REV-ERB. [30]
En D. melanogaster , el ciclo genético (CYC) es el ortólogo de BMAL1 en mamíferos. Por tanto, los dímeros CLOCK-CYC activan la transcripción de genes circadianos. El gen atemporal (TIM) es el ortólogo de los CRY de mamíferos como inhibidor; D. melanogaster CRY funciona como un fotorreceptor. En las moscas, CLK-CYC se une a los promotores de genes regulados circadianos sólo en el momento de la transcripción. También existe un bucle estabilizador donde el gen vrille (VRI) inhibe mientras que la proteína 1 del dominio PAR (PDP1) activa la transcripción del reloj. [31]
En el hongo filamentoso N. crassa , el mecanismo del reloj es análogo, pero no ortólogo, al de los mamíferos y las moscas. [32]
El reloj circadiano de las plantas tiene componentes completamente diferentes a los de los relojes de animales, hongos o bacterias. El reloj de las plantas tiene una similitud conceptual con el reloj de los animales en el sentido de que consta de una serie de bucles de retroalimentación transcripcional entrelazados . Los genes implicados en el reloj muestran su máxima expresión a una hora fija del día. Los primeros genes identificados en el reloj de la planta fueron TOC1 , CCA1 y LHY . La expresión máxima de los genes CCA1 y LHY ocurre al amanecer, y la expresión máxima del gen TOC1 ocurre aproximadamente al anochecer. Las proteínas CCA1/LHY y TOC1 reprimen la expresión de los genes de cada una. El resultado es que a medida que los niveles de proteína CCA1/LHY comienzan a reducirse después del amanecer, se libera la represión en el gen TOC1, lo que permite que aumenten la expresión de TOC1 y los niveles de proteína TOC1. A medida que aumentan los niveles de proteína TOC1, se suprime aún más la expresión de los genes CCA1 y LHY. Lo contrario de esta secuencia ocurre durante la noche para restablecer la expresión máxima de los genes CCA1 y LHY al amanecer. Hay mucha más complejidad incorporada en el reloj, con múltiples bucles que involucran a los genes PRR, el Complejo Vespertino y las proteínas GIGANTIA y ZEITLUPE sensibles a la luz.
En los ritmos circadianos bacterianos , las oscilaciones de la fosforilación de la proteína Kai C de cianobacterias se reconstituyeron en un sistema libre de células (un reloj in vitro ) incubando KaiC con KaiA , KaiB y ATP . [17]
Durante mucho tiempo, se pensó que los ciclos de activación/represión transcripcional impulsados por los reguladores transcripcionales que constituyen el reloj circadiano eran la principal fuerza impulsora de la expresión de genes circadianos en los mamíferos. Sin embargo, más recientemente se informó que sólo el 22% de los genes cíclicos del ARN mensajero son impulsados por la transcripción de novo. [33] Posteriormente se informaron mecanismos postranscripcionales a nivel de ARN que impulsan la expresión rítmica de proteínas, como la dinámica de poliadenilación del ARNm. [34]
Fustin [ ¿quién? ] y sus colaboradores identificaron la metilación de adenosinas internas (m 6 A) dentro del ARNm (en particular, de las transcripciones del reloj) como un regulador clave del período circadiano. La inhibición de la metilación de m 6 A mediante la inhibición farmacológica de las metilaciones celulares o, más específicamente, mediante el silenciamiento mediado por ARNip de la metilasa Mettl3 de m 6 A condujo al dramático alargamiento del período circadiano. Por el contrario, la sobreexpresión de Mettl3 in vitro condujo a un período más corto. Estas observaciones demostraron claramente la importancia de la regulación postranscripcional del reloj circadiano a nivel de ARN y, al mismo tiempo, establecieron el papel fisiológico de la metilación del ARN (m 6 A). [35]
Los bucles de retroalimentación autorreguladora de los relojes tardan unas 24 horas en completar un ciclo y constituyen un reloj molecular circadiano. Esta generación del reloj molecular de aproximadamente 24 horas se rige por modificaciones postraduccionales como la fosforilación , la sumoilación , la acetilación y metilación de histonas y la ubiquitinación . [31] La fosforilación reversible regula procesos importantes como la entrada nuclear, la formación de complejos proteicos y la degradación de proteínas . Cada uno de estos procesos contribuye significativamente a mantener el período en aproximadamente 24 horas y otorga la precisión de un reloj circadiano al afectar la estabilidad de las proteínas del reloj central antes mencionadas. Así, mientras que la regulación transcripcional genera niveles rítmicos de ARN, las modificaciones postraduccionales reguladas controlan la abundancia de proteínas, la localización subcelular y la actividad represora de PER y CRY. [30]
Las proteínas responsables de la modificación postraduccional de los genes del reloj incluyen miembros de la familia de la caseína quinasa ( caseína quinasa 1 delta (CSNK1D) y caseína quinasa 1 épsilon (CSNK1E) y la proteína repetida 3 rica en leucina F-box (FBXL3) . En los mamíferos, CSNK1E y CSNK1D son factores críticos que regulan el recambio de proteínas circadianas centrales [30] . La manipulación experimental de cualquiera de estas proteínas produce efectos dramáticos en los períodos circadianos, como actividades alteradas de las quinasas y causa períodos circadianos más cortos, y demuestra aún más su importancia. de la regulación postraduccional dentro del mecanismo central del reloj circadiano [30] Estas mutaciones se han vuelto de particular interés en los humanos ya que están implicadas en el trastorno de la fase avanzada del sueño [31] Una pequeña modificación de la proteína modificadora relacionada con la ubiquitina . BMAL1 también se ha propuesto como otro nivel de regulación postraduccional [30] .
Los osciladores circadianos son simplemente osciladores con un período de aproximadamente 24 horas. En respuesta al estímulo luminoso, el cuerpo se corresponde con un sistema y una red de vías que trabajan juntas para determinar el día y la noche biológicos. Las redes regulatorias involucradas en mantener el reloj preciso abarcan una variedad de mecanismos de regulación post-traducción. Los osciladores circadianos pueden regularse mediante fosforilación , SUMOilación, ubiquitinación y acetilación y desacetilación de histonas , la modificación covalente de la cola de histonas que controla el nivel de las estructuras de cromatina que hacen que el gen se exprese más fácilmente. La metilación de una estructura proteica agrega un grupo metilo y regula la función de la proteína o la expresión génica y, en la metilación de histonas, la expresión génica se suprime o se activa cambiando la secuencia del ADN. Las histonas pasan por un proceso de acetilación, metilación y fosforilación, pero los principales cambios estructurales y químicos ocurren cuando las enzimas histonas acetiltransferasas (HAT) y histonas desacetilasas (HDAC) agregan o eliminan grupos acetilo de la histona, lo que provoca un cambio importante en la expresión del ADN. Al cambiar la expresión del ADN, la acetilación y metilación de histonas regulan el funcionamiento del oscilador circadiano. Fustin y sus colaboradores aportaron una nueva capa de complejidad a la regulación del oscilador circadiano en mamíferos al demostrar que la metilación del ARN era necesaria para la exportación eficiente del ARNm maduro fuera del núcleo: la inhibición de la metilación del ARN provocó la retención nuclear de las transcripciones del gen del reloj, lo que llevó a a un período circadiano más largo. [35]
Una característica clave de los relojes es su capacidad para sincronizarse con estímulos externos. La presencia de osciladores celulares autónomos en casi todas las células del cuerpo plantea la cuestión de cómo se coordinan temporalmente estos osciladores. La búsqueda de señales horarias universales para los relojes periféricos de los mamíferos ha dado como resultado señales principales de arrastre, como la alimentación, la temperatura y el oxígeno. Se demostró que tanto los ritmos de alimentación como los ciclos de temperatura sincronizan los relojes periféricos e incluso los desacoplan del reloj maestro del cerebro (p. ej., alimentación restringida durante el día). También se ha descubierto que los ritmos de oxígeno sincronizan los relojes en células cultivadas. [36]
Los enfoques experimentales modernos que utilizan la biología de sistemas han identificado muchos componentes novedosos en los relojes biológicos que sugieren una visión integradora de cómo los organismos mantienen la oscilación circadiana. [27] [28]
Recientemente, Baggs et al. desarrolló una estrategia novedosa denominada "Análisis de red de dosificación genética" (GDNA) para describir las características de la red en el reloj circadiano humano que contribuyen a la robustez de un organismo contra las perturbaciones genéticas. [28] En su estudio, los autores utilizaron pequeños ARN de interferencia (ARNip) para inducir cambios dependientes de la dosis en la expresión genética de los componentes del reloj dentro de las células U2OS de osteosarcoma humano inmortalizadas para construir redes de asociación genética consistentes con las limitaciones bioquímicas conocidas en el ritmo circadiano de los mamíferos. reloj. El empleo de múltiples dosis de ARNip impulsó su PCR cuantitativa para descubrir varias características de la red del reloj circadiano, incluidas las respuestas proporcionales de la expresión genética, la propagación de señales a través de módulos que interactúan y la compensación a través de cambios en la expresión genética.
Las respuestas proporcionales en la expresión genética posterior después de la perturbación inducida por ARNip revelaron niveles de expresión que se alteraron activamente con respecto al gen que se estaba derribando. Por ejemplo, cuando Bmal1 fue eliminado de una manera dependiente de la dosis, se demostró que los niveles de ARNm de Rev-ErbA alfa y Rev-ErbA beta disminuyen de manera lineal y proporcional. Esto respalda los hallazgos anteriores de que Bmal1 activa directamente los genes Rev-erb y sugiere además que Bmal1 contribuye en gran medida a la expresión de Rev-erb.
Además, el método GDNA proporcionó un marco para estudiar los mecanismos de retransmisión biológica en las redes circadianas a través de las cuales los módulos comunican cambios en la expresión genética. [28] Los autores observaron la propagación de señales a través de interacciones entre activadores y represores, y descubrieron una compensación paráloga unidireccional entre varios represores de genes de reloj; por ejemplo, cuando se agota PER1 , hay un aumento en Rev-erbs, que a su vez propaga una señal a Disminuye la expresión en BMAL1 , el objetivo de los represores Rev-erb.
Al examinar la desactivación de varios represores transcripcionales, el GDNA también reveló una compensación de parálogos en la que los parálogos de genes se regulaban positivamente a través de un mecanismo activo mediante el cual la función del gen se reemplaza después de la desactivación de una manera no redundante, es decir, un componente es suficiente para mantener la función. Estos resultados sugirieron además que una red de reloj utiliza mecanismos compensatorios activos en lugar de una simple redundancia para conferir robustez y mantener la función. En esencia, los autores propusieron que las características de la red observadas actúan en conjunto como un sistema de amortiguación genético para mantener la función del reloj frente a perturbaciones genéticas y ambientales. [28] Siguiendo esta lógica, podemos utilizar la genómica para explorar las características de la red en el oscilador circadiano.
Otro estudio realizado por Zhang et al. También empleó una pequeña pantalla de ARN de interferencia en todo el genoma en la línea celular U2OS para identificar genes de reloj adicionales y modificadores utilizando la expresión del gen indicador de luciferasa. [27] La eliminación de casi 1000 genes redujo la amplitud del ritmo. Los autores encontraron y confirmaron cientos de efectos potentes sobre la duración del período o el aumento de la amplitud en las pantallas secundarias. La caracterización de un subconjunto de estos genes demostró un efecto dependiente de la dosis sobre la función del oscilador . El análisis de la red de interacción de proteínas mostró que docenas de productos genéticos estaban asociados directa o indirectamente con componentes del reloj conocidos. El análisis de la vía reveló que estos genes están sobrerrepresentados en los componentes de la insulina y la vía de señalización de hedgehog , el ciclo celular y el metabolismo del folato. Junto con datos que demuestran que muchas de estas vías están reguladas por reloj, Zhang et al. postuló que el reloj está interconectado con muchos aspectos de la función celular.
Un enfoque de biología de sistemas puede relacionar los ritmos circadianos con fenómenos celulares que originalmente no se consideraban reguladores de la oscilación circadiana. Por ejemplo, un taller celebrado en 2014 [37] en el NHLBI evaluó hallazgos genómicos circadianos más recientes y discutió la interfaz entre el reloj biológico y muchos procesos celulares diferentes.
Si bien en muchos organismos se encuentra un reloj circadiano preciso de 24 horas, no es universal. Los organismos que viven en el alto Ártico o la alta Antártida no experimentan el tiempo solar en todas las estaciones, aunque se cree que la mayoría mantiene un ritmo circadiano cercano a las 24 horas, como los osos durante el letargo. [38] Gran parte de la biomasa de la Tierra reside en la biosfera oscura, y si bien estos organismos pueden exhibir una fisiología rítmica, es poco probable que el ritmo dominante para estos organismos sea circadiano. [39] Para los organismos migratorios de este a oeste, y especialmente aquellos organismos que circunnavegan el mundo, la fase absoluta de 24 horas puede desviarse a lo largo de meses, estaciones o años.
Algunas arañas exhiben relojes circadianos inusualmente largos o cortos. Algunos tejedores de orbes de líneas de basura , por ejemplo, tienen relojes circadianos de 18,5 horas, pero aún pueden adaptarse a un ciclo de 24 horas. Esta adaptación puede ayudar a las arañas a evitar a los depredadores al permitirles estar más activas antes del amanecer. [40] Los relojes de las viudas negras son arrítmicos, quizás debido a su preferencia por los ambientes oscuros. [41]