Una muesca es una discontinuidad en una molécula de ADN de doble cadena en la que no hay enlace fosfodiéster entre nucleótidos adyacentes de una cadena , generalmente debido a daño o acción enzimática . Las muescas permiten que las cadenas de ADN se desenrollen durante la replicación y también se cree que desempeñan un papel en los mecanismos de reparación de errores de apareamiento del ADN que corrigen errores tanto en la cadena principal como en la cadena secundaria rezagada. [1]
El diagrama muestra los efectos de las muescas en el ADN que se cruza en un plásmido retorcido . Las muescas se pueden utilizar para disipar la energía retenida por los estados que se cruzan. Las muescas permiten que el ADN adopte una forma circular. [2]
El ADN mellado puede ser el resultado de un daño en el ADN o de reacciones biomoleculares reguladas y intencionadas que se llevan a cabo en la célula. Durante el procesamiento, el ADN puede sufrir mellas mediante cizallamiento físico, secado excesivo o enzimas. Una manipulación excesivamente brusca al pipetear o agitar con un vórtex crea estrés físico que puede provocar roturas y mellas en el ADN. El secado excesivo del ADN también puede romper el enlace fosfodiéster en el ADN y dar lugar a mellas. Las enzimas endonucleasas que producen mellas pueden ayudar en este proceso. Una rotura monocatenaria (mella) en el ADN puede formarse mediante la hidrólisis y posterior eliminación de un grupo fosfato dentro de la cadena principal helicoidal. Esto conduce a una conformación diferente del ADN, en la que se forma un enlace de hidrógeno en lugar de la pieza faltante de la cadena principal del ADN para preservar la estructura. [3]
Las ligasas son enzimas versátiles y ubicuas que unen los extremos hidroxilo 3' y fosfato 5' para formar un enlace fosfodiéster, lo que las hace esenciales en la reparación del ADN mellado y, en última instancia, en la fidelidad del genoma. Esta función biológica también ha sido extremadamente valiosa para sellar los extremos pegajosos de los plásmidos en la clonación molecular. Su importancia está atestiguada por el hecho de que la mayoría de los organismos tienen múltiples ligasas dedicadas a vías específicas de reparación del ADN. En las eubacterias, estas ligasas son impulsadas por NAD+ en lugar de ATP. [4] Cada sitio de mella requiere 1 ATP o 1 NAD+ para impulsar la reparación de la ligasa. [4]
Para unir estos fragmentos, la ligasa progresa a través de tres pasos:
Un ejemplo particular de una ligasa que cataliza el cierre de mellas es la ligasa de ADN dependiente de NAD+ de E. coli , LigA. LigA es un ejemplo relevante ya que es estructuralmente similar a un clado de enzimas que se encuentran en todos los tipos de bacterias. [7]
Las ligasas tienen un sitio de unión de metales que es capaz de reconocer mellas en el ADN. La ligasa forma un complejo ADN-adenilato, que ayuda al reconocimiento. [8] Con la ADN ligasa humana, esto forma un complejo cristalizado. El complejo, que tiene un intermediario ADN-adenilato, permite que la ADN ligasa I instituya un cambio conformacional en el ADN para el aislamiento y posterior reparación de la mella en el ADN. [9]
Las muescas monocatenarias actúan como marcadores reconocibles para ayudar a la maquinaria de reparación a distinguir la hebra recién sintetizada (hebra hija) de la hebra molde (hebra parental). [1] La reparación de desajustes de ADN (MMR) es un importante sistema de reparación de ADN que ayuda a mantener la plasticidad del genoma al corregir desajustes o pares de bases que no son de Watson-Crick en el dúplex de ADN. [10] Algunas fuentes de pares de bases desajustes incluyen errores de replicación y desaminación del ADN de 5-metilcitosina para formar timina. La MMR en la mayoría de las bacterias y eucariotas se dirige a la hebra errónea del dúplex desajuste a través del reconocimiento de discontinuidades de la hebra, mientras que la MMR en E. coli y bacterias estrechamente relacionadas se dirige a la hebra sobre la base de la ausencia de metilación . Las endonucleasas de mella introducen las discontinuidades de la hebra, o mellas de ADN, para ambos sistemas respectivos. Los homólogos de Mut L de eucariotas y la mayoría de las bacterias cortan la hebra discontinua para introducir el punto de entrada o terminación para la reacción de escisión. De manera similar, en E. coli, Mut H corta la hebra no metilada del dúplex para introducir el punto de entrada de la escisión. [11] Para los eucariotas específicamente, el mecanismo de elongación de la replicación del ADN entre la hebra líder y la rezagada difiere. En la hebra rezagada, existen mellas entre los fragmentos de Okazaki y son fácilmente reconocibles por la maquinaria de reparación de desajustes del ADN antes de la ligadura . Debido a la replicación continua que ocurre en la hebra líder, el mecanismo allí es ligeramente más complejo. Durante la replicación, las enzimas de replicación agregan ribonucleótidos y estos ribonucleótidos son cortados por una enzima llamada ARNasa H2 . [1] Juntos, la presencia de una mella y un ribonucleótido hacen que la hebra líder sea fácilmente reconocible para la maquinaria de reparación de desajustes del ADN.
La traducción de mellas es un proceso biológico en el que una mella de ADN monocatenario sirve como marcador para que la ADN polimerasa excinda y reemplace los nucleótidos posiblemente dañados. [3] Al final del segmento sobre el que actúa la ADN polimerasa, la ADN ligasa debe reparar el segmento final de la cadena principal del ADN para completar el proceso de reparación. [4] En un entorno de laboratorio, esto se puede utilizar para introducir nucleótidos fluorescentes u otros nucleótidos marcados mediante la inducción intencionada de mellas monocatenarias específicas del sitio en el ADN in vitro y luego agregando el ADN mellado a un entorno rico en ADN polimerasa y nucleótido marcado. Luego, la ADN polimerasa reemplaza los nucleótidos de ADN con los marcados, comenzando en el sitio de la mella monocatenaria.
El ADN mellado desempeña un papel importante en muchas funciones biológicas. Por ejemplo, las mellas monocatenarias en el ADN pueden servir como marcadores biológicos útiles para la enzima topoisomerasa , que desenrolla el ADN empaquetado y es fundamental para la replicación y transcripción del ADN. En estos casos, el ADN mellado no es el resultado de un daño celular no deseado. [2]
La topoisomerasa-1 actúa preferentemente en las muescas del ADN para escindir las cadenas adyacentes a la muesca y luego enrolla o desenrolla las topologías complejas asociadas con el ADN empaquetado. Aquí, la muesca en el ADN sirve como marcador para la rotura de una sola cadena y el desenrollado posterior. [12] Es posible que este no sea un proceso altamente conservado. La topoisomerasa puede causar deleciones cortas cuando escinde enlaces, porque tanto los productos de ADN de longitud completa como las cadenas de deleción cortas se consideran productos de la escisión de la topoisomerasa, mientras que los mutantes inactivos solo produjeron cadenas de ADN de longitud completa. [13]
Las mellas en el ADN también dan lugar a diferentes propiedades estructurales, pueden participar en la reparación de daños causados por la radiación ultravioleta y se utilizan en los pasos primarios que permiten la recombinación genética . [14]
El Nick idling es un proceso biológico en el que la ADN polimerasa puede ralentizar o detener su actividad de añadir bases a una nueva cadena hija durante la replicación del ADN en un sitio de mella. [4] Esto es particularmente relevante para los fragmentos de Okazaki en la cadena rezagada en la replicación del ADN bicatenario porque la dirección de la replicación es opuesta a la dirección de la ADN polimerasa , por lo tanto, el Nick idling juega un papel en el estancamiento del complejo, ya que se replica en la dirección inversa en fragmentos pequeños (fragmentos de Okazaki) y tiene que detenerse y reposicionarse entre cada longitud de fragmento de ADN.
La estructura del ADN cambia cuando se introduce una mella monocatenaria. [14] La estabilidad disminuye ya que una ruptura en la cadena principal de fosfodiéster permite que el ADN se desenrolle , ya que el estrés acumulado por la torsión y el empaquetamiento ya no se resiste con tanta fuerza. [12] El ADN mellado es más susceptible a la degradación debido a esta estabilidad reducida.
El sitio nic o región nick se encuentra dentro del sitio de origen de transferencia ( oriT ) y es clave para iniciar la conjugación bacteriana . Una sola hebra de ADN, llamada hebra T , es cortada en nic por una enzima llamada relaxasa . [15] Esta hebra única se transfiere finalmente a la célula receptora durante el proceso de conjugación bacteriana . Sin embargo, antes de que pueda ocurrir esta escisión, es necesario que un grupo de proteínas se adhiera al sitio oriT . Este grupo de proteínas se llama relaxosoma. [15] Se cree que partes del sitio oriT están dobladas de una manera que crea interacción entre las proteínas del relaxosoma y el sitio nic . [15]
La escisión de la cadena T implica que la relaxasa corte un enlace fosfodiéster en el sitio nic. [15] La cadena escindida queda con un grupo hidroxilo en el extremo 3', lo que puede permitir que la cadena forme un plásmido circular después de moverse hacia la célula receptora. [16] [17]
Las mellas de ADN promueven la formación de entrecruzamiento durante la meiosis , y dichas mellas están protegidas de la ligadura por la exonucleasa 1 (Exo1). [18]
{{cite journal}}: CS1 maint: DOI inactivo a partir de julio de 2024 ( enlace )