El operón lactosa ( operón lac ) es un operón necesario para el transporte y metabolismo de la lactosa en E. coli y muchas otras bacterias entéricas . Aunque la glucosa es la fuente de carbono preferida para la mayoría de las bacterias entéricas, el operón lac permite la digestión efectiva de la lactosa cuando la glucosa no está disponible a través de la actividad de la β-galactosidasa . [1] La regulación genética del operón lac fue el primer mecanismo regulador genético que se entendió claramente, por lo que se ha convertido en un ejemplo destacado de regulación genética procariótica . Por este motivo, a menudo se analiza en las clases de introducción a la biología molecular y celular . Este sistema de metabolismo de la lactosa fue utilizado por François Jacob y Jacques Monod para determinar cómo una célula biológica sabe qué enzima sintetizar. Su trabajo sobre el operón lac les valió el Premio Nobel de Fisiología en 1965. [1]
La mayoría de las células bacterianas, incluida E. coli, carecen de intrones en su genoma. También carecen de membrana nuclear . De ahí que la regulación genética por el operón lac se produzca a nivel transcripcional, al impedir la conversión de ADN en ARNm .
Los operones bacterianos son transcritos policistrónicos que pueden producir múltiples proteínas a partir de un transcrito de ARNm . En este caso, cuando se requiere lactosa como fuente de azúcar para la bacteria, se pueden expresar los tres genes del operón lac y traducir sus proteínas posteriores: lacZ , lacY y lacA . El producto genético de lacZ es la β-galactosidasa que escinde la lactosa, un disacárido , en glucosa y galactosa . lacY codifica la permeasa de β-galactósido , una proteína de membrana que queda incrustada en la membrana plasmática para permitir el transporte celular de lactosa al interior de la célula. Finalmente, lacA codifica la β-galactósido transacetilasa .
Tenga en cuenta que el número de pares de bases en el diagrama anterior no es a escala. De hecho, hay más de 5300 pares de bases en el operón lac. [2]
Sería un desperdicio producir enzimas cuando no hay lactosa disponible o si estuviera disponible una fuente de energía preferible como la glucosa. El operón lac utiliza un mecanismo de control de dos partes para garantizar que la célula gaste energía produciendo las enzimas codificadas por el operón lac sólo cuando sea necesario. [3]
En ausencia de lactosa, el represor lac , codificado por lacI, detiene la producción de enzimas y proteínas de transporte codificadas por el operón lac . [4] Lo hace bloqueando la ARN polimerasa dependiente del ADN . Este bloqueo/detención no es perfecto y todo el tiempo se produce una cantidad mínima de expresión genética . La proteína represora siempre se expresa, pero el operón lac (enzimas y proteínas de transporte) están reprimidos. (Pero no detenido por completo)
Cuando hay lactosa disponible pero no glucosa, algo de lactosa ingresa a la célula utilizando una proteína de transporte preexistente codificada por lacY. Esta lactosa luego se combina con el represor y lo inactiva, permitiendo así que se exprese el operón lac. Luego se sintetiza más permeasa de β-galactósido, lo que permite que entre aún más lactosa y las enzimas codificadas por lacZ y lacA pueden digerirla.
Sin embargo, en presencia de glucosa, independientemente de la presencia de lactosa, el operón quedará reprimido. Esto se debe a que la proteína activadora del catabolito (CAP), necesaria para la producción de enzimas, permanece inactiva y EIIA Glc desactiva la permeasa de lactosa para evitar el transporte de lactosa al interior de la célula. Este mecanismo de control dual provoca la utilización secuencial de glucosa y lactosa en dos fases de crecimiento distintas, conocidas como diauxie .
Sólo lacZ y lacY parecen ser necesarias para la vía catabólica de la lactosa .
En números, lacI tiene 1100 pb, lacZ tiene 3000 pb, lacY tiene 800 pb, lacA tiene 800 pb, correspondiendo 3 pb a 1 aminoácido. [5]
Se utilizan abreviaturas de tres letras para describir fenotipos en bacterias, incluida E. coli .
Ejemplos incluyen:
En el caso de Lac, las células de tipo salvaje son Lac + y son capaces de utilizar la lactosa como fuente de carbono y energía, mientras que los derivados mutantes de Lac − no pueden utilizar la lactosa. Normalmente se utilizan las mismas tres letras (en minúscula, en cursiva) para etiquetar los genes implicados en un fenotipo particular, donde cada gen diferente se distingue además por una letra adicional. Los genes lac que codifican enzimas son lacZ , lacY y lacA . El cuarto gen lac es lacI , que codifica el represor de lactosa; "I" significa inducibilidad .
Se puede distinguir entre genes estructurales que codifican enzimas y genes reguladores que codifican proteínas que afectan la expresión génica. El uso actual amplía la nomenclatura fenotípica para aplicarla a las proteínas: así, LacZ es el producto proteico del gen lacZ , la β-galactosidasa. Varias secuencias cortas que no son genes también afectan la expresión genética, incluido el promotor lac , lac p , y el operador lac , lac o . Aunque no es un uso estrictamente estándar, las mutaciones que afectan a lac o se denominan lac o c , por razones históricas.
El control específico de los genes lac depende de la disponibilidad del sustrato lactosa para la bacteria. La bacteria no produce las proteínas cuando la lactosa no está disponible como fuente de carbono. Los genes lac están organizados en un operón ; es decir, están orientados en la misma dirección inmediatamente adyacente en el cromosoma y se cotranscriben en una única molécula de ARNm policistrónico . La transcripción de todos los genes comienza con la unión de la enzima ARN polimerasa (RNAP), una proteína de unión al ADN , que se une a un sitio de unión específico al ADN, el promotor , inmediatamente aguas arriba de los genes. La unión de la ARN polimerasa al promotor se ve favorecida por la proteína activadora del catabolito unida a AMPc (CAP, también conocida como proteína receptora de AMPc). [6] Sin embargo, el gen lacI (gen regulador del operón lac ) produce una proteína que bloquea la unión de RNAP al operador del operón. Esta proteína sólo se puede eliminar cuando la alolactosa se une a ella y la inactiva. La proteína formada por el gen lacI se conoce como represor lac. El tipo de regulación que sufre el operón lac se denomina inducible negativa, lo que significa que el factor regulador ( represor lac ) desactiva el gen a menos que se agregue alguna molécula (lactosa). Una vez que se elimina el represor, RNAP procede a transcribir los tres genes ( lacZYA ) en ARNm. Cada uno de los tres genes de la cadena de ARNm tiene su propia secuencia de Shine-Dalgarno , por lo que los genes se traducen de forma independiente. [7] La secuencia de ADN del operón lac de E. coli , el ARNm de lacZYA y los genes lacI están disponibles en GenBank (ver).
El primer mecanismo de control es la respuesta reguladora a la lactosa, que utiliza una proteína reguladora intracelular llamada represor de lactosa para impedir la producción de β-galactosidasa en ausencia de lactosa. El gen lacI que codifica el represor se encuentra cerca del operón lac y siempre se expresa ( constitutivo ). Si falta lactosa en el medio de crecimiento, el represor se une muy estrechamente a una secuencia corta de ADN justo aguas abajo del promotor cerca del comienzo de lacZ llamada operador lac . La unión del represor al operador interfiere con la unión de RNAP al promotor y, por lo tanto, el ARNm que codifica LacZ y LacY solo se produce en niveles muy bajos. Sin embargo, cuando las células crecen en presencia de lactosa, un metabolito de la lactosa llamado alolactosa, elaborado a partir de lactosa por el producto del gen lacZ , se une al represor, provocando un cambio alostérico. Así alterado, el represor es incapaz de unirse al operador, lo que permite que RNAP transcriba los genes lac y, por lo tanto, conduce a niveles más altos de las proteínas codificadas.
El segundo mecanismo de control es una respuesta a la glucosa, que utiliza el homodímero de la proteína activadora del catabolito (CAP) para aumentar en gran medida la producción de β-galactosidasa en ausencia de glucosa. El monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) es una molécula señal cuya prevalencia es inversamente proporcional a la de la glucosa. Se une al CAP, lo que a su vez permite que el CAP se una al sitio de unión del CAP (una secuencia de ADN de 16 pb aguas arriba del promotor a la izquierda en el diagrama siguiente, aproximadamente 60 pb aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción), [8 ] que ayuda a la RNAP a unirse al ADN. En ausencia de glucosa, la concentración de AMPc es alta y la unión de CAP-AMPc al ADN aumenta significativamente la producción de β-galactosidasa, lo que permite a la célula hidrolizar lactosa y liberar galactosa y glucosa.
Más recientemente se demostró que la exclusión del inductor bloquea la expresión del operón lac cuando hay glucosa presente. La glucosa es transportada al interior de la célula mediante el sistema fosfotransferasa dependiente de PEP . El grupo fosfato del fosfoenolpiruvato se transfiere a través de una cascada de fosforilación que consta de las proteínas generales PTS (sistema de fosfotransferasa) HPr y EIA y las proteínas PTS específicas de glucosa EIIA Glc y EIIB Glc , el dominio citoplasmático del transportador de glucosa EII. El transporte de glucosa va acompañado de su fosforilación por EIIB Glc , drenando el grupo fosfato de las otras proteínas PTS, incluida EIIA Glc . La forma no fosforilada de EIIA Glc se une a la lac permeasa y evita que ésta introduzca lactosa en la célula. Por lo tanto, si están presentes tanto glucosa como lactosa, el transporte de glucosa bloquea el transporte del inductor del operón lac . [9]
El represor lac es una proteína de cuatro partes, un tetrámero, con subunidades idénticas. Cada subunidad contiene un motivo hélice-vuelta-hélice (HTH) capaz de unirse al ADN. El sitio operador donde se une el represor es una secuencia de ADN con simetría de repetición invertida. Los dos semisitios del ADN del operador se unen juntos a dos de las subunidades del represor. Aunque las otras dos subunidades del represor no hacen nada en este modelo, esta propiedad no se comprendió durante muchos años.
Finalmente se descubrió que dos operadores más están involucrados en la regulación de la lac . [10] Uno (O 3 ) se encuentra aproximadamente -90 pb corriente arriba de O 1 en el extremo del gen lacI , y el otro (O 2 ) está aproximadamente +410 pb corriente abajo de O 1 en la parte inicial de lacZ . Estos dos sitios no se encontraron en los primeros trabajos porque tienen funciones redundantes y las mutaciones individuales no afectan mucho la represión. Las mutaciones únicas en O 2 u O 3 tienen sólo efectos de 2 a 3 veces. Sin embargo, su importancia queda demostrada por el hecho de que un doble mutante defectuoso tanto en O 2 como en O 3 queda drásticamente desreprimido (unas 70 veces).
En el modelo actual, el represor lac está unido simultáneamente tanto al operador principal O 1 como a O 2 u O 3 . El ADN interpuesto sale del complejo. La naturaleza redundante de los dos operadores menores sugiere que lo importante no es un complejo en bucle específico. Una idea es que el sistema funcione mediante tethering; Si el represor atado se libera momentáneamente de O 1 , vincularlo a un operador menor lo mantiene cerca, de modo que pueda volver a atar rápidamente. Esto aumentaría la afinidad del represor por el O 1 .
El represor es una proteína alostérica , es decir, puede adoptar cualquiera de dos formas ligeramente diferentes, que están en equilibrio entre sí. En una forma, el represor se unirá al ADN operador con alta especificidad, y en la otra forma habrá perdido su especificidad. Según el modelo clásico de inducción, la unión del inductor, ya sea alolactosa o IPTG, al represor afecta la distribución del represor entre las dos formas. Por tanto, el represor unido al inductor se estabiliza en la conformación sin unión al ADN. Sin embargo, este modelo simple no puede ser toda la historia, porque el represor está unido de manera bastante estable al ADN, pero se libera rápidamente mediante la adición de un inductor. Por tanto, parece claro que un inductor también puede unirse al represor cuando éste ya está unido al ADN. Aún no se sabe del todo cuál es el mecanismo exacto de unión. [11]
La unión no específica del represor al ADN juega un papel crucial en la represión e inducción del operón Lac. El sitio de unión específico de la proteína represora Lac es el operador. La interacción no específica está mediada principalmente por interacciones carga-carga, mientras que la unión al operador se ve reforzada por interacciones hidrofóbicas. Además, existe una gran cantidad de secuencias de ADN no específicas a las que se puede unir el represor. Esencialmente, cualquier secuencia que no sea el operador se considera no específica. Los estudios han demostrado que sin la presencia de una unión no específica, la inducción (o no represión) del operón Lac no podría ocurrir incluso con niveles saturados de inductor. Se ha demostrado que, sin unión no específica, el nivel basal de inducción es diez mil veces menor que el observado normalmente. Esto se debe a que el ADN no específico actúa como una especie de "sumidero" para las proteínas represoras, distrayéndolas del operador. Las secuencias no específicas disminuyen la cantidad de represor disponible en la célula. Esto a su vez reduce la cantidad de inductor necesario para descomprimir el sistema. [12]
Se han descrito varios derivados o análogos de la lactosa que son útiles para trabajar con el operón lac . Estos compuestos son principalmente galactósidos sustituidos, donde la fracción glucosa de la lactosa se reemplaza por otro grupo químico.
El microorganismo experimental utilizado por François Jacob y Jacques Monod fue la bacteria común de laboratorio, E. coli , pero muchos de los conceptos reguladores básicos que descubrieron Jacob y Monod son fundamentales para la regulación celular en todos los organismos. [17] La idea clave es que las proteínas no se sintetizan cuando no son necesarias: E. coli conserva los recursos celulares y la energía al no producir las tres proteínas Lac cuando no hay necesidad de metabolizar la lactosa, como cuando se consumen otros azúcares como la glucosa . disponible. La siguiente sección analiza cómo E. coli controla ciertos genes en respuesta a las necesidades metabólicas.
Durante la Segunda Guerra Mundial , Monod estaba probando los efectos de combinaciones de azúcares como fuentes de nutrientes para E. coli y B. subtilis . Monod estaba dando seguimiento a estudios similares que habían realizado otros científicos con bacterias y levaduras. Descubrió que las bacterias cultivadas con dos azúcares diferentes a menudo presentaban dos fases de crecimiento. Por ejemplo, si se proporcionaron glucosa y lactosa, primero se metabolizó la glucosa (fase de crecimiento I, ver Figura 2) y luego la lactosa (fase de crecimiento II). La lactosa no se metabolizó durante la primera parte de la curva de crecimiento diáuxico porque no se produjo β-galactosidasa cuando tanto la glucosa como la lactosa estaban presentes en el medio. Monod llamó a este fenómeno diauxie . [18]
Luego, Monod centró su atención en la inducción de la formación de β-galactosidasa que se producía cuando la lactosa era el único azúcar en el medio de cultivo. [19]
Un avance conceptual de Jacob y Monod [20] fue reconocer la distinción entre sustancias reguladoras y sitios donde actúan para cambiar la expresión genética. Jacob, ex soldado, utilizó la analogía de un bombardero que liberaría su carga letal al recibir una transmisión o señal de radio especial. Un sistema que funcione requiere tanto un transmisor en tierra como un receptor en el avión. Ahora supongamos que el transmisor habitual está roto. Este sistema puede funcionar mediante la introducción de un segundo transmisor funcional. Por el contrario, dijo, consideremos un bombardero con un receptor defectuoso. El comportamiento de este bombardero no se puede cambiar mediante la introducción de un segundo avión funcional.
Para analizar los mutantes reguladores del operón lac , Jacob desarrolló un sistema mediante el cual se podía introducir una segunda copia de los genes lac ( lacI con su promotor y lacZYA con su promotor y operador) en una sola célula. Luego se analiza un cultivo de dichas bacterias, que son diploides para los genes lac pero por lo demás normales, para determinar el fenotipo regulador. En particular, se determina si LacZ y LacY se producen incluso en ausencia de IPTG (debido a que el represor de lactosa producido por el gen mutante no es funcional). Este experimento, en el que se prueban genes o grupos de genes por pares, se denomina prueba de complementación .
Esta prueba se ilustra en la figura ( lacA se omite por simplicidad). En primer lugar, se muestran ciertos estados haploides (es decir, la célula porta sólo una copia de los genes lac ). El panel (a) muestra la represión, (b) muestra la inducción por IPTG y (c) y (d) muestran el efecto de una mutación en el gen lacI o en el operador, respectivamente. En el panel (e) se muestra la prueba de complementación para el represor. Si una copia de los genes lac porta una mutación en lacI , pero la segunda copia es de tipo salvaje para lacI , el fenotipo resultante es normal, pero lacZ se expresa cuando se expone al inductor IPTG. Se dice que las mutaciones que afectan al represor son recesivas con respecto al tipo salvaje (y ese tipo salvaje es dominante ), y esto se explica por el hecho de que el represor es una pequeña proteína que puede difundirse en la célula. La copia del operón lac adyacente al gen lacI defectuoso es bloqueada efectivamente por la proteína producida a partir de la segunda copia de lacI .
Si se realiza el mismo experimento utilizando un operador de mutación, se obtiene un resultado diferente (panel (f)). El fenotipo de una célula que porta un sitio operador mutante y otro de tipo salvaje es que LacZ y LacY se producen incluso en ausencia del inductor IPTG; porque el sitio operador dañado no permite la unión del represor para inhibir la transcripción de los genes estructurales. La mutación del operador es dominante. Cuando el sitio operador donde debe unirse el represor está dañado por una mutación, la presencia de un segundo sitio funcional en la misma célula no supone ninguna diferencia en la expresión de genes controlados por el sitio mutante.
Una versión más sofisticada de este experimento utiliza operones marcados para distinguir entre las dos copias de los genes lac y mostrar que los genes estructurales no regulados son los que están al lado del operador mutante (panel (g). Por ejemplo, supongamos que una copia está marcada por una mutación que inactiva lacZ de modo que solo puede producir la proteína LacY, mientras que la segunda copia porta una mutación que afecta a lacY y solo puede producir LacZ. En esta versión, solo la copia del operón lac . que es adyacente al operador mutante se expresa sin IPTG Decimos que la mutación del operador es cis-dominante , es dominante al tipo salvaje pero afecta solo a la copia del operón que está inmediatamente adyacente a él.
Esta explicación es engañosa en un sentido importante, porque parte de una descripción del experimento y luego explica los resultados en términos de un modelo. Pero, de hecho, a menudo es cierto que el modelo es lo primero y que se diseña un experimento específicamente para probar el modelo. Jacob y Monod primero imaginaron que debía haber un sitio en el ADN con las propiedades del operador, y luego diseñaron sus pruebas de complementación para demostrarlo.
La dominancia de los operadores mutantes también sugiere un procedimiento para seleccionarlos específicamente. Si se seleccionan mutantes reguladores de un cultivo de tipo salvaje usando fenil-Gal, como se describió anteriormente, las mutaciones operadoras son raras en comparación con los mutantes represores porque el tamaño objetivo es muy pequeño. Pero si en cambio comenzamos con una cepa que porta dos copias de la región lac completa (es decir, diploide para lac ), las mutaciones represoras (que todavía ocurren) no se recuperan porque la complementación por el segundo gen lacI de tipo salvaje confiere un tipo salvaje. fenotipo. Por el contrario, la mutación de una copia del operador confiere un fenotipo mutante porque es dominante sobre la segunda copia, la de tipo salvaje.
La explicación de diauxie dependía de la caracterización de mutaciones adicionales que afectan a los genes lac distintas de las explicadas por el modelo clásico. Posteriormente se identificaron otros dos genes, cya y crp , que estaban mapeados lejos de lac y que, cuando mutan, dan como resultado una disminución del nivel de expresión en presencia de IPTG e incluso en cepas de la bacteria que carecen del represor u operador. El descubrimiento de AMPc en E. coli condujo a la demostración de que los mutantes defectuosos en el gen cya pero no en el gen crp podían restaurar su actividad total mediante la adición de AMPc al medio.
El gen cya codifica la adenilato ciclasa, que produce AMPc. En un mutante cya , la ausencia de AMPc hace que la expresión de los genes lacZYA sea más de diez veces menor de lo normal. La adición de AMPc corrige la baja expresión de Lac característica de los mutantes cya . El segundo gen, crp , codifica una proteína llamada proteína activadora de catabolitos (CAP) o proteína receptora de AMPc (CRP). [22]
Sin embargo, las enzimas del metabolismo de la lactosa se producen en pequeñas cantidades en presencia de glucosa y lactosa (a veces denominada expresión con fugas) debido al hecho de que la RNAP a veces todavía puede unirse e iniciar la transcripción incluso en ausencia de CAP. La expresión con fugas es necesaria para permitir el metabolismo de parte de la lactosa después de que se agota la fuente de glucosa, pero antes de que la expresión de lac se active por completo.
En resumen:
El retraso entre las fases de crecimiento refleja el tiempo necesario para producir cantidades suficientes de enzimas metabolizadoras de la lactosa. En primer lugar, la proteína reguladora CAP tiene que ensamblarse en el promotor lac , lo que da como resultado un aumento en la producción de ARNm lac . Más copias disponibles del ARNm de lac dan como resultado la producción (ver traducción ) de muchas más copias de LacZ (β-galactosidasa, para el metabolismo de la lactosa) y LacY (lactosa permeasa para transportar la lactosa al interior de la célula). Después de un retraso necesario para aumentar el nivel de las enzimas metabolizadoras de la lactosa, las bacterias entran en una nueva fase rápida de crecimiento celular .
Dos enigmas de la represión de catabolitos se relacionan con cómo se acoplan los niveles de AMPc a la presencia de glucosa y, en segundo lugar, por qué las células deberían siquiera molestarse. Después de que se escinde la lactosa, en realidad se forma glucosa y galactosa (que se convierte fácilmente en glucosa). En términos metabólicos, la lactosa es una fuente de carbono y energía tan buena como la glucosa. El nivel de AMPc no está relacionado con la concentración de glucosa intracelular sino con la velocidad de transporte de glucosa, que influye en la actividad de la adenilato ciclasa. (Además, el transporte de glucosa también conduce a una inhibición directa de la lactosa permeasa). En cuanto a por qué E. coli actúa de esta manera, sólo se puede especular. Todas las bacterias entéricas fermentan la glucosa, lo que sugiere que la encuentran con frecuencia. Es posible que una pequeña diferencia en la eficiencia del transporte o metabolismo de la glucosa frente a la lactosa haga que sea ventajoso para las células regular el operón lac de esta manera. [23]
El gen lac y sus derivados se pueden utilizar como gen indicador en varias técnicas de selección basadas en bacterias, como el análisis de dos híbridos , en el que se debe determinar la unión exitosa de un activador transcripcional a una secuencia promotora específica. [16] En placas LB que contienen X-gal , el cambio de color de las colonias blancas a un tono azul corresponde a aproximadamente 20 a 100 unidades de β-galactosidasa, mientras que los medios de lactosa de tetrazolio y lactosa MacConkey tienen un rango de 100 a 1000 unidades, siendo más sensible en las partes alta y baja de este rango respectivamente. [16] Dado que los medios de lactosa MacConkey y lactosa de tetrazolio dependen de los productos de la descomposición de la lactosa, requieren la presencia de los genes lacZ y lacY . Por tanto, las numerosas técnicas de fusión lac que incluyen sólo el gen lacZ son adecuadas para placas X-gal [16] o caldos líquidos ONPG . [24]
