El daño del ADN es una alteración en la estructura química del ADN , como una rotura en una cadena de ADN, una nucleobase que falta en la cadena principal del ADN o una base modificada químicamente como 8-OHdG . El daño del ADN puede ocurrir de forma natural o por factores ambientales, pero es claramente diferente de la mutación , aunque ambos son tipos de error en el ADN . El daño del ADN es una estructura química anormal en el ADN, mientras que una mutación es un cambio en la secuencia de pares de bases. Los daños del ADN causan cambios en la estructura del material genético e impiden que el mecanismo de replicación funcione y se desempeñe correctamente. [1] La respuesta al daño del ADN (DDR) es una vía compleja de transducción de señales que reconoce cuándo el ADN está dañado e inicia la respuesta celular al daño. [2]
El daño y la mutación del ADN tienen diferentes consecuencias biológicas. Si bien la mayoría de los daños del ADN pueden sufrir una reparación del ADN , dicha reparación no es 100% eficiente. Los daños del ADN no reparados se acumulan en células no replicantes, como las células del cerebro o los músculos de los mamíferos adultos, y pueden causar envejecimiento. [3] [4] [5] (Véase también la teoría del envejecimiento por daño del ADN ). En las células replicantes, como las células que recubren el colon, se producen errores al replicarse después de los daños en la cadena de ADN molde o durante la reparación de los daños del ADN. Estos errores pueden dar lugar a mutaciones o alteraciones epigenéticas . [6] Ambos tipos de alteración pueden replicarse y transmitirse a generaciones de células posteriores. Estas alteraciones pueden cambiar la función genética o la regulación de la expresión genética y posiblemente contribuir a la progresión al cáncer.
A lo largo del ciclo celular hay varios puntos de control para garantizar que la célula esté en buenas condiciones para progresar a la mitosis. Los tres puntos de control principales son G1/s, G2/m y el punto de control de ensamblaje del huso que regula la progresión a través de la anafase. Los puntos de control G1 y G2 implican la exploración del ADN dañado. [7] Durante la fase S, la célula es más vulnerable al daño del ADN que en cualquier otra parte del ciclo celular. El punto de control G2 verifica el ADN dañado y la completitud de la replicación del ADN.
Los daños al ADN que ocurren naturalmente pueden ser resultado de procesos metabólicos o hidrolíticos . El metabolismo libera compuestos que dañan el ADN, incluyendo especies reactivas de oxígeno , especies reactivas de nitrógeno , especies reactivas de carbonilo , productos de peroxidación lipídica y agentes alquilantes , entre otros, mientras que la hidrólisis rompe los enlaces químicos en el ADN. [8] Los daños oxidativos al ADN que ocurren naturalmente surgen al menos 10.000 veces por célula por día en humanos y hasta 100.000 por célula por día en ratas [9] como se documenta a continuación.
El daño oxidativo del ADN puede producir más de 20 tipos de bases alteradas [10] [11] así como roturas de cadena simple. [12]
Otros tipos de daños endógenos del ADN, que se detallan a continuación con sus frecuencias de aparición, incluyen despurinaciones , despirimidinaciones , roturas de doble cadena , O6-metilguaninas y desaminación de citosina .
El ADN también puede resultar dañado por factores ambientales, como la luz ultravioleta, la radiación ionizante y los productos químicos genotóxicos. Las horquillas de replicación pueden detenerse debido al ADN dañado y las roturas de doble cadena también son una forma de daño del ADN. [13]
La siguiente lista muestra algunas frecuencias con las que se producen nuevos daños naturales en el ADN por día, debido a procesos celulares endógenos.
Otro daño endógeno importante del ADN es M1dG , abreviatura de (3-(2'-desoxi-beta-D-eritro-pentofuranosil)-pirimido[1,2-a]-purin-10(3H)-ona). La excreción en la orina (que probablemente refleja la tasa de aparición) de M1dG puede ser hasta 1000 veces menor que la de 8-oxodG. [26] Sin embargo, una medida más importante puede ser el nivel de estado estable en el ADN, que refleja tanto la tasa de aparición como la tasa de reparación del ADN. El nivel de estado estable de M1dG es más alto que el de 8-oxodG. [27] Esto señala que algunos daños en el ADN producidos a una tasa baja pueden ser difíciles de reparar y permanecer en el ADN a un alto nivel de estado estable. Tanto M1dG [28] como 8-oxodG [29] son mutagénicos .
Los niveles de estado estable de daños en el ADN representan el equilibrio entre la formación y la reparación. Se han caracterizado más de 100 tipos de daño oxidativo del ADN, y 8-oxodG constituye aproximadamente el 5% de los daños oxidativos en estado estable en el ADN. [18] Helbock et al. [14] estimaron que había 24.000 aductos de ADN oxidativo en estado estable por célula en ratas jóvenes y 66.000 aductos por célula en ratas viejas. Esto refleja la acumulación de daño del ADN con la edad. La acumulación de daño del ADN con la edad se describe con más detalle en la teoría del daño del ADN del envejecimiento .
Swenberg et al. [30] midieron las cantidades promedio de determinados daños endógenos del ADN en estado estacionario en células de mamíferos. Los siete daños más comunes que evaluaron se muestran en la Tabla 1.
Al evaluar los daños en estado estable en tejidos específicos de la rata, Nakamura y Swenberg [31] indicaron que el número de sitios abásicos variaba desde aproximadamente 50.000 por célula en el hígado, el riñón y el pulmón hasta aproximadamente 200.000 por célula en el cerebro.
En un artículo de 2019 se identificaron las proteínas que promueven el daño endógeno del ADN como proteínas de "daño ascendente" del ADN (DDP). [32] Los mecanismos de las DDP se dividen en tres grupos:
Los homólogos humanos del DDP están sobrerrepresentados en los promotores de cáncer conocidos, y sus ARN en los tumores predicen una mutagénesis intensa y un mal pronóstico. [32]
En presencia de daño en el ADN, la célula puede reparar el daño o inducir la muerte celular si el daño no se puede reparar.
En esta tabla se muestran los siete tipos principales de reparación del ADN y una vía de tolerancia al daño, las lesiones que abordan y la precisión de la reparación (o tolerancia). Para obtener una breve descripción de los pasos de la reparación, consulte los mecanismos de reparación del ADN o consulte cada vía individual.
El diagrama esquemático indica el papel de la reparación insuficiente del ADN en el envejecimiento y el cáncer, y el papel de la apoptosis en la prevención del cáncer. Un exceso de daño natural del ADN, debido a deficiencias hereditarias en determinadas enzimas de reparación del ADN, puede causar envejecimiento prematuro o un mayor riesgo de cáncer (véase trastorno por deficiencia de reparación del ADN ). Por otro lado, la capacidad de desencadenar la apoptosis en presencia de un exceso de daño del ADN no reparado es fundamental para la prevención del cáncer. [42]
Las proteínas reparadoras del ADN suelen activarse o inducirse cuando el ADN ha sufrido daños. Sin embargo, un daño excesivo del ADN puede iniciar la apoptosis (es decir, la muerte celular programada) si el nivel de daño del ADN supera la capacidad de reparación. La apoptosis puede impedir que las células con un daño excesivo del ADN sufran mutagénesis y progresen al cáncer. [43]
La inflamación suele ser causada por una infección, como la del virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC) o Helicobacter pylori . La inflamación crónica también es una característica central de la obesidad. [44] [45] [46] [47] Dicha inflamación causa daño oxidativo al ADN. Esto se debe a la inducción de especies reactivas de oxígeno (ROS) por varios mediadores inflamatorios intracelulares. [48] [49] [50] Las infecciones por VHB y VHC, en particular, causan aumentos de 10.000 veces y 100.000 veces en la producción intracelular de ROS, respectivamente. [51] Las ROS inducidas por inflamación que causan daño al ADN pueden desencadenar apoptosis, [52] [53] pero también pueden causar cáncer si los procesos de reparación y apoptóticos no son lo suficientemente protectores. [45]
Los ácidos biliares , almacenados en la vesícula biliar, se liberan en el intestino delgado en respuesta a la grasa de la dieta. Los niveles más altos de grasa provocan una mayor liberación. [54] Los ácidos biliares causan daño al ADN, incluyendo daño oxidativo al ADN, roturas de doble cadena de ADN, aneuploidía y rotura de cromosomas. [55] Los niveles altos-normales del ácido biliar ácido desoxicólico causan apoptosis en las células del colon humano, [56] pero también pueden provocar cáncer de colon si la reparación y las defensas apoptóticas son insuficientes. [57]
La apoptosis actúa como un mecanismo de protección contra la tumorigénesis. [58] Previene el aumento de la mutagénesis que el daño excesivo del ADN podría causar durante la replicación. [59]
Al menos 17 proteínas reparadoras del ADN, distribuidas en cinco vías de reparación del ADN, tienen un "doble papel" en respuesta al daño del ADN. Con niveles moderados de daño del ADN, estas proteínas inician o contribuyen a la reparación del ADN. Sin embargo, cuando hay niveles excesivos de daño del ADN, desencadenan la apoptosis. [43]
El empaquetamiento del ADN eucariota en cromatina es una barrera para todos los procesos basados en ADN que requieren la acción de enzimas. Para la mayoría de los procesos de reparación del ADN, la cromatina debe ser remodelada . En eucariotas, los complejos de remodelación de cromatina dependientes de ATP y las enzimas modificadoras de histonas son dos factores que actúan para lograr este proceso de remodelación después de que se produce un daño en el ADN. [60] Por lo general, siguen otros pasos de reparación del ADN, que involucran múltiples enzimas. A continuación se describen algunas de las primeras respuestas al daño del ADN, con su cronología. Se presentan descripciones más completas de las vías de reparación del ADN en artículos que describen cada vía. Al menos 169 enzimas están involucradas en las vías de reparación del ADN. [61]
Las bases oxidadas en el ADN se producen en células tratadas con colorante Hoechst seguido de microirradiación con luz de 405 nm. [62] Estas bases oxidadas se pueden reparar mediante reparación por escisión de bases .
Cuando la luz de 405 nm se enfoca a lo largo de una línea estrecha dentro del núcleo de una célula, aproximadamente 2,5 segundos después de la irradiación, la enzima remodeladora de cromatina Alc1 logra un reclutamiento de la mitad del máximo en la microlínea irradiada. [63] La línea de cromatina que fue irradiada luego se relaja, expandiéndose de lado a lado durante los siguientes 60 segundos. [63]
A los 6 segundos de irradiación con luz de 405 nm, se produce la mitad del reclutamiento máximo de OGG1 a la línea irradiada. [62] OGG1 es una enzima que elimina el daño oxidativo del ADN 8-oxo-dG del ADN. La eliminación de 8-oxo-dG, durante la reparación por escisión de bases, ocurre con una vida media de 11 minutos. [18]
La luz ultravioleta (UV) induce la formación de daños en el ADN, incluidos los dímeros de pirimidina (como los dímeros de timina) y los fotoproductos 6,4. Estos tipos de daños "voluminosos" se reparan mediante la reparación por escisión de nucleótidos .
Después de la irradiación con luz UV, DDB2 , en un complejo con DDB1 , la proteína ubiquitina ligasa CUL4A y la proteína RING finger ROC1, se asocia con sitios de daño dentro de la cromatina. La asociación de la mitad del máximo ocurre en 40 segundos. [64] PARP1 también se asocia dentro de este período. [65] La proteína PARP1 se une tanto a DDB1 como a DDB2 y luego PARilata (crea una cadena de poli-ADP ribosa) en DDB2 que atrae a la proteína remodeladora de ADN ALC1 . [65] ALC1 relaja la cromatina en sitios de daño UV al ADN. Además, el complejo ubiquitina E3 ligasa DDB1-CUL4A lleva a cabo la ubiquitinación de las histonas centrales H2A, H3 y H4, así como la proteína reparadora XPC, que ha sido atraída al sitio del daño del ADN. [66] La XPC, tras la ubiquitinación, se activa e inicia la vía de reparación por escisión de nucleótidos . Un poco más tarde, a los 30 minutos después del daño por UV, el complejo de remodelación de cromatina INO80 se recluta al sitio del daño del ADN, y esto coincide con la unión de otras proteínas de reparación por escisión de nucleótidos, incluida ERCC1 . [67]
Las roturas de doble cadena (DSB) en sitios específicos se pueden inducir mediante la transfección de células con un plásmido que codifica la endonucleasa I-SceI (una endonucleasa homóloga ). Se pueden inducir múltiples DSB irradiando células sensibilizadas (marcadas con 5'-bromo-2'-desoxiuridina y con el colorante Hoechst) con luz de 780 nm. Estas DSB se pueden reparar mediante la precisa vía de reparación recombinatoria homóloga o mediante la menos precisa vía de reparación de unión de extremos no homóloga . Aquí describimos los primeros pasos de la reparación recombinatoria homóloga (HRR).
Después de tratar las células para introducir DSB, la proteína quinasa activada por estrés, c-Jun N-terminal kinase (JNK) , fosforila SIRT6 en la serina 10. [68] Esta modificación postraduccional facilita la movilización de SIRT6 a sitios de daño del ADN con un reclutamiento a la mitad del máximo en mucho menos de un segundo. [68] SIRT6 en el sitio es necesario para el reclutamiento eficiente de la poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1) a un sitio de rotura del ADN y para la reparación eficiente de DSB. [68] La proteína PARP1 comienza a aparecer en DSB en menos de un segundo, con la mitad de la acumulación máxima dentro de los 1,6 segundos después de que ocurre el daño. [69] Esto luego permite el reclutamiento a la mitad del máximo de las enzimas de reparación del ADN MRE11 dentro de los 13 segundos y NBS1 dentro de los 28 segundos. [69] MRE11 y NBS1 llevan a cabo los primeros pasos de la vía HRR.
γH2AX, la forma fosforilada de H2AX , también está involucrada en los primeros pasos de la reparación de DSB. La variante de histona H2AX constituye aproximadamente el 10% de las histonas H2A en la cromatina humana. [70] γH2AX (H2AX fosforilada en la serina 139) puede detectarse tan pronto como 20 segundos después de la irradiación de las células (con formación de rotura de doble cadena de ADN), y la mitad de la acumulación máxima de γH2AX ocurre en un minuto. [70] La extensión de la cromatina con γH2AX fosforilada es de aproximadamente dos millones de pares de bases en el sitio de una rotura de doble cadena de ADN. [70] γH2AX no causa, por sí misma, la descondensación de la cromatina, pero dentro de los 30 segundos posteriores a la irradiación, la proteína RNF8 puede detectarse en asociación con γH2AX. [71] RNF8 media la descondensación extensa de la cromatina, a través de su interacción posterior con CHD4 , [72] un componente del complejo de remodelación de nucleosomas y desacetilasa NuRD .
Después de una rápida remodelación de la cromatina , los puntos de control del ciclo celular pueden activarse para permitir que la reparación del ADN se complete antes de que progrese el ciclo celular. Primero, dos quinasas , ATM y ATR , se activan dentro de los 5 o 6 minutos después de que el ADN se daña. A esto le sigue la fosforilación de la proteína de punto de control del ciclo celular Chk1 , iniciando su función, aproximadamente 10 minutos después de que el ADN se daña. [73]
El daño del ADN 8-oxo-dG no ocurre aleatoriamente en el genoma. En fibroblastos embrionarios de ratón , se encontró un enriquecimiento de 2 a 5 veces de 8-oxo-dG en regiones de control genético, incluyendo promotores , regiones 5'-no traducidas y regiones 3'-no traducidas en comparación con los niveles de 8-oxo-dG encontrados en cuerpos de genes y en regiones intergénicas . [74] En células endoteliales de la arteria pulmonar de rata, cuando se examinaron 22.414 genes codificadores de proteínas para ubicaciones de 8-oxo-dG, la mayoría de 8-oxo-dG (cuando estaban presentes) se encontraron en regiones promotoras en lugar de dentro de cuerpos de genes. [75] Entre cientos de genes cuyos niveles de expresión se vieron afectados por la hipoxia, aquellos con promotores 8-oxo-dG recién adquiridos fueron regulados positivamente , y aquellos genes cuyos promotores perdieron 8-oxo-dG fueron casi todos regulados negativamente . [75]
Como revisaron Wang et al., [76] la guanina oxidada parece tener múltiples funciones reguladoras en la expresión génica. En particular, cuando el estrés oxidativo produce 8-oxo-dG en el promotor de un gen, el estrés oxidativo también puede inactivar OGG1 , una enzima que se dirige a 8-oxo-dG y normalmente inicia la reparación del daño de 8-oxo-dG. La OGG1 inactiva, que ya no escinde 8-oxo-dG, sin embargo se dirige y forma complejos con 8-oxo-dG, y causa una curva pronunciada (~70 o ) en el ADN. Esto permite el ensamblaje de un complejo de iniciación transcripcional, regulando positivamente la transcripción del gen asociado. [76] [77]
Cuando se forma 8-oxo-dG en una secuencia formadora de G-cuadruplex (PQS) rica en guanina en la cadena codificante de un promotor, la OGG1 activa escinde el 8-oxo-dG y genera un sitio apurínico/apirimidínico (sitio AP). El sitio AP permite la fusión del dúplex para desenmascarar el PQS, adoptando un pliegue de G-cuadruplex (estructura/motivo G4) que tiene un papel regulador en la activación de la transcripción. [76] [78]
Cuando el 8-oxo-dG se combina con OGG1 activo, puede reclutar remodeladores de cromatina para modular la expresión génica. La proteína de unión al ADN de la helicasa de cromodominio 4 (CHD4) , un componente del complejo (NuRD) , es reclutada por OGG1 hacia los sitios de daño oxidativo del ADN. Luego, CHD4 atrae enzimas metiladoras de ADN e histonas que reprimen la transcripción de genes asociados. [76]
La oxidación de la guanina, particularmente dentro de los sitios CpG , puede ser especialmente importante en el aprendizaje y la memoria. La metilación de las citosinas ocurre en el 60-90% de los sitios CpG dependiendo del tipo de tejido. [79] En el cerebro de los mamíferos, ~62% de los CpG están metilados. [79] La metilación de los sitios CpG tiende a silenciar genes de manera estable. [80] Más de 500 de estos sitios CpG están desmetilados en el ADN neuronal durante la formación y consolidación de la memoria en las regiones del hipocampo [81] [82] y la corteza cingulada [82] del cerebro. Como se indica a continuación, el primer paso en la desmetilación de la citosina metilada en un sitio CpG es la oxidación de la guanina para formar 8-oxo-dG.
La figura de esta sección muestra un sitio CpG donde la citosina se metila para formar 5-metilcitosina (5mC) y la guanina se oxida para formar 8-oxo-2'-desoxiguanosina (en la figura, esto se muestra en la forma tautomérica 8-OHdG). Cuando se forma esta estructura, la enzima de reparación por escisión de bases OGG1 se dirige a 8-OHdG y se une a la lesión sin escisión inmediata. OGG1, presente en un sitio 5mCp-8-OHdG, recluta a TET1 , y TET1 oxida el 5mC adyacente al 8-OHdG. Esto inicia la desmetilación de 5mC. [83] TET1 es una enzima clave involucrada en la desmetilación de 5mCpG. Sin embargo, TET1 solo puede actuar sobre 5mCpG si la guanina se oxidó primero para formar 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (8-OHdG o su tautómero 8-oxo-dG), lo que da como resultado un dinucleótido 5mCp-8-OHdG (ver la figura en esta sección). [83] Esto inicia la vía de desmetilación en la citosina metilada, lo que finalmente da como resultado una citosina no metilada (ver oxidación del ADN para conocer los pasos adicionales en la formación de citosina no metilada).
Se ha establecido que la expresión alterada de proteínas en las neuronas, debido a cambios en la metilación del ADN (probablemente controlada por la desmetilación dependiente de 8-oxo-dG de los sitios CpG en los promotores de genes dentro del ADN de las neuronas) es central para la formación de la memoria. [84]
Las roturas de doble cadena (DSB) en regiones de ADN relacionadas con la actividad neuronal se producen por una variedad de mecanismos dentro y alrededor del genoma. La enzima topoisomerasa II , o TOPIIβ, desempeña un papel clave en la formación de DSB al ayudar en la desmetilación o aflojamiento de las histonas envueltas alrededor de la doble hélice para promover la transcripción . [85] Una vez que se abre la estructura de la cromatina, es más probable que se acumulen DSB, sin embargo, esto normalmente es reparado por TOPIIβ a través de su capacidad intrínseca de religación que vuelve a unir los extremos del ADN escindido. [85]
El fracaso de TOPIIβ para religarse puede tener consecuencias drásticas en la síntesis de proteínas, donde se estima que "el bloqueo de la actividad de TOPIIβ altera la expresión de casi un tercio de todos los genes regulados por el desarrollo", como los genes tempranos inmediatos neuronales (IEG) involucrados en la consolidación de la memoria . [85] [86] Se ha observado una expresión rápida de IEG egr-1 , c-Fos y Arc en respuesta al aumento de la actividad neuronal en la región del hipocampo del cerebro donde tiene lugar el procesamiento de la memoria. [87] Como medida preventiva contra el fracaso de TOPIIβ, las moléculas de reparación de DSB se reclutan a través de dos vías diferentes: factores de la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ), que realizan una función de religación similar a la de TOPIIβ, y la vía de recombinación homóloga (HR) , que utiliza la cadena hermana no rota como plantilla para reparar la cadena dañada de ADN. [85] [88]
La estimulación de la actividad neuronal, como se mencionó anteriormente en la expresión de IEG, es otro mecanismo a través del cual se generan DSB. Los cambios en el nivel de actividad se han utilizado en estudios como un biomarcador para rastrear la superposición entre DSB y el aumento de la metilación de la histona H3K4 en las regiones promotoras de IEG. [85] [88] Otros estudios han indicado que los elementos transponibles (TE) pueden causar DSB a través de la actividad endógena que implica el uso de enzimas endonucleasas para insertar y escindir el ADN objetivo en sitios aleatorios. [89] [90]
Si bien la acumulación de DSB generalmente inhibe la consolidación de la memoria a largo plazo , el proceso de reconsolidación , por el contrario, depende de DSB. La reconsolidación de la memoria implica la modificación de los recuerdos existentes almacenados en la memoria a largo plazo. [91] La investigación que involucra a NPAS4 , un gen que regula la neuroplasticidad en el hipocampo durante el aprendizaje contextual y la formación de la memoria, ha revelado un vínculo entre las deleciones en la región codificante y los deterioros en el recuerdo de los recuerdos de miedo en ratas transgénicas. [85] Además, la enzima H3K4me3, que cataliza la desmetilación de la histona H3K4, se reguló positivamente en la región promotora del gen NPAS4 durante el proceso de reconsolidación, mientras que la inhibición (derribo del gen) de la misma enzima impidió la reconsolidación. [85] Se observó un efecto similar en TOPIIβ, donde la inhibición también afectó la respuesta de la memoria de miedo en ratas, lo que indica que los DSB, junto con las enzimas que los regulan, influyen en la formación de la memoria en múltiples etapas.
La acumulación de DSB en general conduce a la degeneración de las neuronas, lo que dificulta la función de la memoria y los procesos de aprendizaje. Debido a su falta de división celular y alta actividad metabólica , las neuronas son especialmente propensas al daño del ADN. [88] Además, un desequilibrio de DSB y moléculas de reparación del ADN para los genes de actividad neuronal se ha relacionado con el desarrollo de varias enfermedades neurodegenerativas humanas, incluida la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP) y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). [88] En pacientes con enfermedad de Alzheimer, los DSB se acumulan en las neuronas en etapas tempranas y son la fuerza impulsora detrás de la pérdida de memoria, una característica clave de la enfermedad. [88] Otros factores externos que resultan en niveles aumentados de DSB dependientes de la actividad en personas con EA son el daño oxidativo a las neuronas, que puede resultar en más DSB cuando ocurren múltiples lesiones cerca una de la otra. Los factores ambientales como los virus y una dieta alta en grasas también se han asociado con la función alterada de las moléculas de reparación del ADN.
Una terapia dirigida para tratar a pacientes con EA ha implicado la supresión del gen BRCA1 en cerebros humanos, inicialmente probado en ratones transgénicos, donde se observó que los niveles de DSB habían aumentado y se había producido pérdida de memoria, lo que sugiere que BRCA1 podría "servir como un objetivo terapéutico para la EA y la demencia relacionada con la EA". [88] De manera similar, la proteína ATM involucrada en la reparación del ADN y las modificaciones epigenéticas del genoma está correlacionada positivamente con la pérdida neuronal en cerebros con EA, lo que indica que la proteína es otro componente clave en los procesos intrínsecamente vinculados de neurodegeneración, producción de DSB y formación de memoria. [88]
La mayoría de los daños se pueden reparar sin activar el sistema de respuesta al daño, sin embargo, los daños más complejos activan ATR y ATM, proteínas quinasas clave en el sistema de respuesta al daño. [92] El daño al ADN inhibe las M-CDK, que son un componente clave de la progresión hacia la mitosis .
En todas las células eucariotas, ATR y ATM son proteínas quinasas que detectan daños en el ADN. Se unen a los sitios dañados del ADN y activan Chk1 , Chk2 y, en células animales, p53 . Juntas, estas proteínas forman el sistema de respuesta al daño del ADN. Algunos daños en el ADN no requieren el reclutamiento de ATR y ATM, solo los daños difíciles y extensos requieren ATR y ATM. ATM y ATR son necesarios para la reparación de NHEJ, HR, ICL y NER, así como para la estabilidad de la horquilla de replicación durante la replicación de ADN no perturbada y en respuesta a bloqueos de replicación. [2]
La ATR se recluta para diferentes formas de daño, como daño de nucleótidos, horquillas de replicación estancadas y roturas de doble cadena. La ATM está específicamente para la respuesta al daño por roturas de doble cadena. El complejo MRN (compuesto por Mre11, Rad50 y Nbs1) se forma inmediatamente en el sitio de la rotura de doble cadena. Este complejo MRN recluta a ATM al sitio del daño. La ATR y la ATM fosforilan varias proteínas que contribuyen al sistema de reparación de daños. La unión de la ATR y la ATM a los sitios dañados en el ADN conduce al reclutamiento de Chk1 y Chk2. Estas proteínas quinasas envían señales de daño al sistema de control del ciclo celular para retrasar la progresión del ciclo celular. [13]
Chk1 conduce a la producción de enzimas reparadoras del ADN. Chk2 conduce a una detención reversible del ciclo celular. Chk2, así como ATR/ATM, pueden activar p53, lo que conduce a una detención permanente del ciclo celular o apoptosis.
Cuando hay demasiado daño, se desencadena la apoptosis para proteger al organismo de células potencialmente dañinas.7 p53, también conocido como gen supresor de tumores, es una proteína reguladora importante en el sistema de respuesta al daño del ADN que se une directamente a los promotores de sus genes diana. p53 actúa principalmente en el punto de control G1 (controlando la transición de G1 a S), donde bloquea la progresión del ciclo celular. [7] La activación de p53 puede desencadenar la muerte celular o el arresto permanente del ciclo celular. p53 también puede activar ciertas vías de reparación como NER. [92]
En ausencia de daño en el ADN, p53 es regulado por Mdm2 y degradado constantemente. Cuando hay daño en el ADN, Mdm2 es fosforilado, probablemente causado por ATM. La fosforilación de Mdm2 conduce a una reducción en la actividad de Mdm2, impidiendo así la degradación de p53. Una célula normal, no dañada, generalmente tiene niveles bajos de p53, mientras que las células bajo estrés y daño en el ADN, tendrán niveles altos de p53. [13]
p53 actúa como factor de transcripción tanto para bax , una proteína proapoptótica, como para p21 , un inhibidor de CDK. Los inhibidores de CDK provocan la detención del ciclo celular. La detención de la célula proporciona tiempo a la célula para reparar el daño y, si el daño es irreparable, p53 recluta a bax para desencadenar la apoptosis. [92]
El p53 es un factor clave en el crecimiento de las células cancerosas. Las células con ADN dañado que tienen p53 mutado tienen un mayor riesgo de volverse cancerosas. Los tratamientos de quimioterapia comunes son genotóxicos. Estos tratamientos son ineficaces en tumores cancerosos que tienen p53 mutado, ya que no tienen un p53 funcional para detener o matar la célula dañada.
Un indicio de que los daños en el ADN son un problema importante para la vida es que se han encontrado procesos de reparación del ADN, para hacer frente a los daños en el ADN, en todos los organismos celulares en los que se ha investigado la reparación del ADN. Por ejemplo, en las bacterias, se ha encontrado una red reguladora destinada a reparar los daños en el ADN (llamada respuesta SOS en Escherichia coli ) en muchas especies bacterianas. E. coli RecA, una enzima clave en la vía de respuesta SOS, es el miembro definitorio de una clase ubicua de proteínas de intercambio de cadenas de ADN que son esenciales para la recombinación homóloga, una vía que mantiene la integridad genómica reparando el ADN roto. [93] Los genes homólogos a RecA y a otros genes centrales en la vía de respuesta SOS se encuentran en casi todos los genomas bacterianos secuenciados hasta la fecha, cubriendo un gran número de filos, lo que sugiere tanto un origen antiguo como una ocurrencia generalizada de reparación recombinacional de daños en el ADN. [94] Las recombinasas eucariotas que son homólogas de RecA también están ampliamente extendidas en los organismos eucariotas. Por ejemplo, en la levadura de fisión y en los seres humanos, los homólogos de RecA promueven el intercambio de cadenas de ADN dúplex-dúplex necesario para la reparación de muchos tipos de lesiones del ADN. [95] [96]
Otro indicio de que los daños en el ADN son un problema importante para la vida es que las células realizan grandes inversiones en procesos de reparación del ADN. Como señala Hoeijmakers [4] , reparar una sola rotura de doble cadena podría requerir más de 10.000 moléculas de ATP , que se utilizan para señalar la presencia del daño, la generación de focos de reparación y la formación (en humanos) del nucleofilamento RAD51 (un intermediario en la reparación recombinatoria homóloga). (RAD51 es un homólogo de RecA bacteriano). Si la modificación estructural ocurre durante la fase G1 de la replicación del ADN, el punto de control G1-S detiene o pospone el avance del ciclo celular antes de que el producto entre en la fase S. [1]
Las células somáticas diferenciadas de los mamíferos adultos generalmente se replican con poca frecuencia o no se replican en absoluto. Dichas células, incluidas, por ejemplo, las neuronas cerebrales y los miocitos musculares, tienen poco o ningún recambio celular. Las células no replicantes generalmente no generan mutaciones debido a errores de replicación inducidos por daños en el ADN. Estas células no replicantes no suelen dar lugar al cáncer, pero sí acumulan daños en el ADN con el tiempo que probablemente contribuyen al envejecimiento ( ). En una célula no replicante, una rotura de una sola hebra u otro tipo de daño en la hebra transcrita de ADN puede bloquear la transcripción catalizada por la ARN polimerasa II. [97] Esto interferiría con la síntesis de la proteína codificada por el gen en el que se produjo el bloqueo.
Brasnjevic et al. [98] resumieron la evidencia que muestra que las roturas de cadena sencilla se acumulan con la edad en el cerebro (aunque la acumulación difiere en diferentes regiones del cerebro) y que las roturas de cadena sencilla son los daños de ADN en estado estable más frecuentes en el cerebro. Como se discutió anteriormente, se esperaría que estas roturas de cadena sencilla acumuladas bloquearan la transcripción de genes. En consonancia con esto, como revisaron Hetman et al. [99] , se identificaron 182 genes y se demostró que tenían una transcripción reducida en los cerebros de personas mayores de 72 años, en comparación con la transcripción en los cerebros de personas menores de 43 años. Cuando se evaluaron 40 proteínas particulares en un músculo de ratas, la mayoría de las proteínas mostraron disminuciones significativas durante el envejecimiento de 18 meses (rata madura) a 30 meses (rata vieja) de edad. [100]
Se ha demostrado que otro tipo de daño del ADN, la rotura de la doble cadena, causa la muerte celular (pérdida de células) a través de la apoptosis . [101] Este tipo de daño del ADN no se acumula con la edad, ya que una vez que una célula se pierde a través de la apoptosis, su daño de doble cadena se pierde con ella. Por lo tanto, los segmentos de ADN dañados socavan la maquinaria de replicación del ADN porque estas secuencias alteradas de ADN no se pueden utilizar como verdaderas plantillas para producir copias del material genético de una persona. [1]
Cuando el ADN se daña, la célula responde de diversas maneras para reparar el daño y minimizar los efectos en la célula. Una de esas respuestas, específicamente en las células eucariotas, es retrasar la división celular: la célula se detiene durante algún tiempo en la fase G2 antes de progresar a través del resto del ciclo celular. Se han realizado varios estudios para dilucidar el propósito de esta detención G2 que es inducida por el daño del ADN. Los investigadores han descubierto que las células que se ven obligadas a salir prematuramente del retraso tienen una viabilidad celular menor y tasas más altas de cromosomas dañados en comparación con las células que pueden sufrir una detención G2 completa, lo que sugiere que el propósito del retraso es dar tiempo a la célula para reparar los cromosomas dañados antes de continuar con el ciclo celular. [102] Esto garantiza el funcionamiento adecuado de la mitosis.
Varias especies animales presentan mecanismos similares de retraso celular en respuesta al daño del ADN, que puede ser causado por la exposición a la radiación X. La levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae ha sido estudiada específicamente porque la progresión a través del ciclo celular puede seguirse a través de la morfología nuclear con facilidad. Al estudiar Saccharomyces cerevisiae , los investigadores han podido aprender más sobre los genes sensibles a la radiación (RAD) y el efecto que las mutaciones RAD pueden tener en la respuesta de retraso inducida por daño del ADN celular típica. Específicamente, el gen RAD9 juega un papel crucial en la detección del daño del ADN y la detención de la célula en G2 hasta que se repare el daño.
Mediante experimentos exhaustivos, los investigadores han podido esclarecer el papel que desempeñan los genes RAD en el retraso de la división celular en respuesta al daño del ADN. Cuando las células en crecimiento de tipo salvaje se exponen a varios niveles de irradiación X durante un período de tiempo determinado y luego se analizan con un ensayo de microcolonias , se pueden observar diferencias en la respuesta del ciclo celular en función de los genes que están mutados en las células. Por ejemplo, mientras que las células no irradiadas progresarán normalmente a través del ciclo celular, las células expuestas a la irradiación X se detienen permanentemente (se vuelven inviables) o se retrasan en la fase G2 antes de continuar dividiéndose en mitosis, lo que corrobora aún más la idea de que el retraso en G2 es crucial para la reparación del ADN. Sin embargo, las cepas rad, que son deficientes en la reparación del ADN, muestran una respuesta marcadamente diferente. Por ejemplo, las células rad52, que no pueden reparar roturas de ADN de doble cadena, tienden a detenerse permanentemente en G2 cuando se exponen incluso a niveles muy bajos de irradiación X, y rara vez terminan progresando a través de las últimas etapas del ciclo celular. Esto se debe a que las células no pueden reparar los daños en el ADN y, por lo tanto, no entran en la mitosis. Varios otros mutantes rad muestran respuestas similares cuando se exponen a la radiación X.
Sin embargo, la cepa rad9 muestra un efecto completamente diferente. Estas células no logran retrasar la fase G2 cuando se exponen a la radiación X y terminan progresando a través del ciclo celular sin perturbaciones, antes de morir. Esto sugiere que el gen RAD9, a diferencia de los otros genes RAD, desempeña un papel crucial en el inicio de la detención G2. Para investigar más a fondo estos hallazgos, se han analizado los ciclos celulares de cepas doblemente mutantes. Una cepa mutante rad52 rad9, que es defectuosa tanto en la reparación del ADN como en la detención G2, no logra sufrir una detención del ciclo celular cuando se expone a la radiación X. Esto sugiere que incluso si el daño del ADN no se puede reparar, si RAD9 no está presente, el ciclo celular no se retrasará. Por lo tanto, el daño del ADN no reparado es la señal que le dice a RAD9 que detenga la división y detenga el ciclo celular en G2. Además, existe una respuesta dependiente de la dosis; a medida que aumentan los niveles de radiación X (y el daño del ADN posterior), más células, independientemente de las mutaciones que tengan, se detienen en G2.
Otra forma, quizás más útil, de visualizar este efecto es observar preparaciones de fotomicroscopía. Inicialmente, las preparaciones de células haploides RAD+ y rad9 en la fase exponencial de crecimiento muestran células simples, individuales, que son indistinguibles entre sí. Sin embargo, las preparaciones se ven muy diferentes después de ser expuestas a la radiación X durante 10 horas. Las preparaciones RAD+ ahora muestran que las células RAD+ existen principalmente como microcolonias de dos gemaciones, lo que sugiere que la división celular se ha detenido. En contraste, las preparaciones rad9 muestran que las células rad9 existen principalmente como colonias de 3 a 8 gemaciones, y parecen más pequeñas que las células RAD+. Esto es una prueba más de que las células RAD mutantes continuaron dividiéndose y son deficientes en la detención de G2.
Sin embargo, hay evidencia de que, aunque el gen RAD9 es necesario para inducir el arresto en G2 en respuesta al daño del ADN, dándole tiempo a la célula para reparar el daño, en realidad no juega un papel directo en la reparación del ADN. Cuando las células rad9 son arrestadas artificialmente en G2 con MBC, un veneno para microtúbulos que previene la división celular, y luego tratadas con radiación X, las células son capaces de reparar su ADN y eventualmente progresar a través del ciclo celular, dividiéndose en células viables. Por lo tanto, el gen RAD9 no juega ningún papel en la reparación real del ADN dañado; simplemente detecta el ADN dañado y responde retrasando la división celular. El retraso, entonces, está mediado por un mecanismo de control, en lugar del ADN dañado físicamente. [103]
Por otra parte, es posible que existan mecanismos de respaldo que desempeñen el papel de RAD9 cuando no está presente. De hecho, algunos estudios han descubierto que RAD9 sí desempeña un papel fundamental en la reparación del ADN. En un estudio, células mutantes de rad9 y normales en la fase exponencial de crecimiento se expusieron a la radiación UV y se sincronizaron en fases específicas del ciclo celular. Después de ser incubadas para permitir la reparación del ADN, se evaluó el grado de dimerización de pirimidina (que es indicativa de daño del ADN) utilizando técnicas sensibles de extensión de cebadores. Se descubrió que la eliminación de fotolesiones del ADN era mucho menos eficiente en las células mutantes de rad9 que en las células normales, lo que proporciona evidencia de que RAD9 está involucrado en la reparación del ADN. Por lo tanto, el papel de RAD9 en la reparación del daño del ADN sigue sin estar claro. [104]
De todas formas, está claro que RAD9 es necesario para detectar daños en el ADN y detener la división celular. Se ha sugerido que RAD9 posee actividad exonucleasa 3' a 5', que es quizás la razón por la que desempeña un papel en la detección de daños en el ADN. Cuando el ADN está dañado, se plantea la hipótesis de que RAD9 forma un complejo con RAD1 y HUS1, y este complejo es reclutado a los sitios de daño en el ADN. Es de esta manera que RAD9 puede ejercer sus efectos.
Aunque la función de RAD9 se ha estudiado principalmente en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae , muchos de los mecanismos de control del ciclo celular son similares entre especies. Por lo tanto, podemos concluir que es probable que RAD9 también desempeñe un papel fundamental en la respuesta al daño del ADN en humanos.
